Kháng thể không chỉ được sử dụng để điều trị, chống lại các dịch bệnh mà nó còn được dùng trong chuẩn đoán rất nhiều loại bệnh, phát hiện sự tồn tại của dược phẩm, các sản phẩm của virus
Trang 1BÁO CÁO CNSH ĐỘNG VẬT: KHÁNG THỂ ĐA DÒNG
I Mở đầu:
Kháng thể trong tiếng Anh là “antibody” được ghép từ 2 gốc “anti-”( kháng lại) và “body”( cơ thể) Năm 1890, các
nhà bác học Von Behring và Ehlich đã phát hiện ra kháng thể (antibody) và phát hiện ra vị trí của thụ thể (receptor) trên màng tế bào Vào thời kì này kĩ thuật điều trị bệnh bằng huyết thanh, hiện tượng ngưng kết tế bào, hiện tượng kết tủa, khả năng chuẩn đoán bệnh theo huyết thanh đã được nghiên cứu và ứng dụng trong y học
Kháng thể có hai đặc tính hữu dụng Đầu tiên là chúng rất đặc hiệu, có nghĩa là mỗi loại kháng thể chỉ liên kết và tấn công một loại kháng nguyên nhất định Thứ hai, đối với một số loại kháng thể, sau khi được kích thích bởi sự hiện diện của bệnh, vẫn giữ được khả năng chống lại loại bệnh đó sau này, ví dụ trong trường hợp của bệnh đậu mùa và sởi Đặc tính thứ hai của kháng thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine - dạng đã được làm yếu đi hay làm chết của virus
và vi trùng Vaccine sẽ thúc đẩy quá trình sản xuất kháng thể chống lại các kháng nguyên có trong vaccine khi được đưa vào cơ thể
Công nghệ kháng thể chủ yếu dựa vào đặc tính đầu tiên của kháng thể - tính đặc hiệu Chính đặc tính này giúp
cho công nghệ kháng thể có một giá trị to lớn Kháng thể không chỉ được sử dụng để điều trị, chống lại các dịch bệnh mà
nó còn được dùng trong chuẩn đoán rất nhiều loại bệnh, phát hiện sự tồn tại của dược phẩm, các sản phẩm của virus và vi trùng, cũng như các chất bất thường trong máu
Cách thông thường để tạo kháng thể là tiêm kháng nguyên vào các động vật thí nghiệm Sau khi kháng thể được tạo ra, chúng sẽ được trích tách từ máu (huyết thanh có chứa kháng thể được gọi là huyết thanh miễn dịch) Tuy nhiên, phương pháp này có hai nhược điểm: huyết thanh miễn dịch sinh ra có chứa các chất không mong muốn, và có ít lượng kháng thể cần sản xuất Chính vì vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu các quy trình sản xuất và tinh sạch kháng thể đơn dòng và
từ đó công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng ngày càng được hoàn thiện và ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh, nghiên cứu và chữa trị ung thư, sản xuất vaccine, giảm việc sử dụng kháng sinh…
Trong nghiên cứu này, nhóm chúng tôi đưa ra các quy trình sản xuất kháng thể từ huyết thanh và sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng (IgY), đồng thời so sánh những ưu nhược điểm cũng như những ứng dụng của chúng trong thực tiễn
II Mục tiêu:
Xây dựng quy trình sản xuất kháng thể đa dòng từ huyết thanh của động vật hữu nhũ và quy trình sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng gà và ứng dụng của chúng trong thực tiễn
III Tổng quan:
1 Khái quát kháng thể:
a Khái niệm:
Kháng thể: Kháng thể (antibody) là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào
lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ (vi khuẩn hoặc virus…)
Kháng nguyên: Kháng nguyên là các protein lạ xâm nhập vào cơ thể có tác động kích thích cơ thể tạo ra kháng
thể
Epitope: Epitope hay còn gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) là vị trí cấu trúc trên một phân
tử kháng nguyên có thể phản ứng với một kiểu cấu trúc hóa học của phân tử kháng thể hoặc phân tử thụ thể Đa số các epitope có thể coi là các bề mặt ba chiều có thể khớp với các bề mặt kháng nguyên
b Cấu trúc kháng thể:
Kháng thể được cấu tạo bởi hai chuỗi polypeptide là chuỗi nặng (H: heavy chain) và chuổi nhẹ (L: light chain): -Chuỗi nặng gồm các dạng µ, α1, α 2, γ1, γ2, γ3, γ4, δ, ε Phân loại lớp và dưới lớp của các Ig
-Chuổi nhẹ gồm hai dạng κ, λ
Kháng thể gồm năm lớp: IgM, IgD, IgA, IgE và các dưới lớp IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2
Trang 2Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype, tùy theo cấu tạo của các domain hằng định của các chuỗi nặng: các chuỗi γ, α, μ, ε và δ lần lượt tương ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE và IgD
Các domain hằng định (C) đặc trưng bởi các chuỗi amino acid khá giống nhau giữa các kháng thể Các domain hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các
bổ thể Do đó, phần "chân" của chữ Y còn được gọi là Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng thể)
Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V) Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận biết kháng nguyên) Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa các kháng thể Chính sự biến thiên
đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng thể nhận biết được nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau
Tóm tắt tính chất của các lớp (isotype) immunoglobulin khác nhau.
IgG
IgG là kháng thể phổ biến nhất trong máu và các dịch mô Đây là lớp immunoglobulin duy nhất có thể xuyên qua nhau thai, qua đó bảo vệ con trong những tuần lễ đầu đời sau khi sinh khi hệ miễn dịch của trẻ chưa phát triển Vai trò chính của IgG là hoạt hóa bổ thể và opsonine hóa
IgA
IgA chiếm khoảng 15 - 20% các immunoglobulin trong máu, nó chủ yếu được tiết tại các mô niêm nhầy (chẳng hạn trong ống tiêu hóa và hệ hô hấp) Nó còn được tiết trong sữa, nước mắt và nước bọt Lớp immunoglobulin này chống lại (bằng cách trung hòa) các tác nhân gây bệnh tại những nơi chúng được tiết ra Nó không hoạt hóa bổ thể, khả năng opsonise hóa cũng rất yếu
IgM
IgM chủ yếu ở trong huyết tương Nhờ tính chất polymer, IgM rất "háu" kháng nguyên và rất hiệu quả trong việc hoạt hóa
bổ thể Nó còn được gọi là các "kháng thể tự nhiên" vì lưu hành trong máu ngay cả khi không có bằng chứng về sự tiếp xúc với kháng nguyên
IgE
IgE có trên màng bào tương của bạch cầu ái kiềm và tế bào mast ở mô liên kết IgE giữ một vai trò trong phản ứng quá mẫn cấp cũng như trong cơ chế miễn dịch chống ký sinh trùng Kháng thể loại IgE cũng có trong các dịch tiết, không hoạt hóa bổ thể và là loại immunoglobulin dễ bị hủy bởi nhiệt
IgD
IgD là loại immunoglobulin monomer chiếm chưa đầy 1% trên màng tế bào lympho B Chức năng của IgD chưa được hiểu biết đầy đủ, nó thường biểu hiện đồng thời với IgM và được xem như một chỉ dấu (marker) của tế bào B trưởng thành nhưng chưa tiếp xúc kháng nguyên Có lẽ nó tham gia vào cơ chế biệt hóa của tế bào B thành tương bào và tế bào B ghi nhớ
c Kháng thể đa dòng( Polyconal antibody-PAB):
Kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước
d Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – MAB):
Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn
e Đặc tính sinh học:
Trong một đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: gắn với kháng nguyên, kích hoạt hệ thống bổ thể
và huy động các tế bào miễn dịch
Liên kết với kháng nguyên
Các immunoglobulin có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên Một thí dụ để miêu tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống độc tố vi khuẩn Kháng thể gắn
Trang 3vào và qua đó trung hòa độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên lên các thụ thể tế bào Như vậy, các tế bào cơ
thể tránh được các rối loạn do các độc tố đó gây ra (xem hình).
Các độc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể.
Các độc tố trên bị trung hòa bởi kháng thể.
Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám được vào các tế bào cơ thể Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là adhesine, còn virus sở hữu các protein cố định trên lớp vỏ ngoài Các kháng thể kháng-adhesine
và kháng-proteine capside virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào đích của chúng
Hoạt hóa bổ thể
Một trong những cơ chế bảo vệ cơ thể của kháng thể là việc hoạt hóa dòng thác bổ thể Bổ thể là tập hợp các protein huyết tương khi được hoạt hóa sẽ tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại bằng cách (1) đục các lỗ thủng trên vi khuẩn, (2) tạo điều kiện cho hiện tượng thực bào, (3) thanh lọc các phức hợp miễn dịch và (4) phóng thích các phân tử hóa hướng động
Hoạt hóa các tế bào miễn dịch
Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Những tương tác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch Như vậy, các kháng thể gắn với một
vi khuẩn có thể liên kết với một đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào Các tế bào lympho NK (Natural Killer)
có thể thực hiện chức năng gây độc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể
f Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch:
Tế bào lympho:
Tế bào lympho là những tế bào có khả năng nhận diện một cách đặc hiệu kháng nguyên lạ và tạo phản ứng chống lại chúng Do vậy, lympho bào là tế bào trung gian của cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào
Tế bào lympho B:
Tế bào lympho B là tế bào duy nhất có thể sản xuất kháng thể hòa tan Chúng nhận diện kháng nguyên ngoại bào (kể cả kháng nguyên trên bề mặt tế bào) và biệt hóa thành tế bào tiết kháng thể, do đó chúng có tác dụng như tế bào trung gian của miễn dịch thể dịch
Tế bào lympho T:
Tế bào lympho nhận diện kháng nguyên của vi sinh vật nội bào và có chức năng tiêu diệt những vi sinh vật này hoặc những tế bào bị nhiễm trùng
Tế bào trình diện kháng nguyên:
Tế bào trình diện kháng nguyên chịu trách nhiệm bắt giữ và trình diện kháng nguyên cho những tế bào T để khởi động đáp ứng miễn dịch
g Cơ chế đáp ứng miễn dịch:
Trang 4h Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch:
h1 Kháng nguyên:
Điều kiện bắt buộc của một chất sinh miễn dịch:
Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ với cơ thể, bởi vì bình thường cơ thể không
đáp ứng bảo vệ với các chất của bản thân Chất càng lạ với cơ thể bao nhiêu, khả năng kích thích tạo kháng thể mạnh bấy nhiêu
Khối lượng phân tử lớn: Kháng nguyên phải có khối lượng phân tử lớn hơn 10000 Da Nếu < 1000 Da( penixillin,
progesterone, aspirin,…) thì không có tính sinh miễn dịch Từ 1000 đến 6000 Da (insulin) có thể có hoặc không có khả năng đáp ứng miễn dịch
Cấu trúc phân tử phức tạp: Một chất có tính sinh miễn dịch phải là chất có cấu trúc hóa- lí tương đối phức tạp
các chất có cấu trúc tương đối phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao
Kháng nguyên có thể hiện diện với hệ thống miễn dịch là phức hợp kháng nguyên (ví dụ, vi khuẩn, virus và kí sinh vật) hay là kháng nguyên đơn giản (ví dụ protein hay polysaccharide)
h2 Liều lượng tiêm:
Liều lượng của kháng nguyên ảnh hưởng rất nhiều đến đáp ứng miễn dịch Quá nhiều hay quá ít kháng nguyên có thể dẫn đến sự giảm bớt, độ nhạy, sức chịu và những đáp ứng không mong muốn khác
Liều lượng tiêm phù hợp phụ thuộc rất nhiều vào loại kháng nguyên Nếu kháng nguyên là protein thì lượng protein khoảng 10-100 µg protein nên được sử dụng
Tiêm nhắc lại thì sẽ giúp đáp miễn dịch dịch thể sẽ tăng lên, tạo khả năng miễn dịch cao và bền vững
h3 Vị trí tiêm:
Tiêm trong tĩnh mạch; tiêm ở bụng; tiêm dưới da; tiêm trong da
Tiến trình tiêm trong tĩnh mạch không được khuyến khích dùng và không thể sử dụng cho kháng nguyên đặc biệt hay tá dược đặc biệt
Vì mục đích thực nghiệm và lý do kinh tế, gà thường được tiêm vào trong cơ ngực Trong phòng thí nghiệm, gà
có thể tiêm vào dưới da cổ
Với động vật còn non, thích hợp cho việc tiêm vào trong cơ của cơ ngực, bởi vì tiêm dưới da thường khó thực hiện hơn và có thể gây ra stress
Việc tiêm vào trong cơ dưới chân cần tránh, vì chúng có thể ảnh hưởng tới sự đi lại của gà
h4 Số lần tiêm và khoảng cách các lần tiêm:
Tổng số lần tiêm phụ thuộc vào loại và liều lượng kháng nguyên, cũng như tá dược được sử dụng
Trong mọi trường hợp, phải có ít nhất hai lần miễn dịch
Nếu lượng kháng thể bắt đầu giảm thì nên gây tạo miễn dịch để duy trì kháng thể đặc hiệu luôn ở mức độ cao Kháng thể lòng đỏ nên được kiểm tra sau 14 ngày của lần miễn dịch sau cùng Nếu lượng kháng thể quá thấp, sẽ tiếp tục thực hiện lại việc tiêm
Thường những kết quả báo cáo cho thấy khoảng cách lần tiêm thứ nhất và thứ hai và những lần tiêm tiếp theo nên tiến hành sau 2 đến 4 tuần sẽ cho hiệu quả cao
h5 Tá dược:
Khái niệm tá dược được nghĩ ra bởi Ramon năm 1925 Những chất được sử dụng đầu tiên là tinh bột, agar và saponin là tá dược cơ bản Tá dược là chất kích hoạt miễn dịch có tác dụng củng cố việc sản xuất của kháng thể đa dòng
Trang 5Tá dược kéo dài sự giải phóng của kháng nguyên vì vậy tạo nên hiệu quả cũng như tạo nên kích thích nội bộ sau khi miễn dịch
-Tá dược có thể ảnh hưởng toàn bộ hay một phần lên thành phần trong suốt đáp ứng miễn dịch
-Điểm bất lợi của việc sử dụng tá dược được chứng minh là có tác dụng phụ: đau u hạt dẫn đến sưng viêm có thể dẫn đến
sự di căn; tác động gây ung thư ngẫu nhiên; nguy cơ gây ra dị ứng trong trường hợp sử dụng lặp lại; tác động ngược lên chất lượng thịt nếu sử dụng động vật trang trại
Tá dược Freund (Freund adjuvant):
Tá dược Freund dạng hoàn toàn (FCA) là hệ nhũ hóa dầu trong nước, bao gồm: dầu khoáng, mannide
mono-oleate, và Mycobacterium tuberculosis đã giết chết bởi nhiệt (hay M butycium) hay một số thành phần của vi sinh vật này
FCA là tá dược kích hoạt cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tương tác tế bào FCA thường phản ứng mạnh vì dầu khoáng không thể chuyển hóa và thành phần vi nấm có thể tạo ra một vài phản ứng viêm Nồng độ của vi nấm thay đổi lớn trong FCA thương mại Về phần này, cần chú ý rằng nếu nồng độ của vi nấm mà ít hơn 0.5 mg/ml thì kết quả phản ứng sưng viêm sẽ ít trầm trọng hơn
Tá dược Freund dạng không hoàn toàn (FIA) có thành phần giống như FCA nhưng không có tế bào vi nấm hay thành phần tế bào FIA thì ít hiệu quả hơn so với FCA trong việc tạo ra kháng thể cao hơn và tạo giữ miễn dịch tương tác
tế bào FIA thường được dùng cho các lần miễn dịch thứ phát
2 Lịch sử phát triển của kháng thể:
Năm 1890 những kháng huyết thanh đầu tiên ra đời (do các tác giả Von Behring, Kitazato, Challou - Roux và Martin đề xuất), gồm 2 loại để chữa trị bệnh bạch hầu và uốn ván
Năm 1939 Tiselius A và Kabat E A đã tiến hành phát hiện phần protein huyết thanh chứa các kháng thể Các tác giả đã gây miễn dịch cho thỏ bằng ovalbumin
Từ năm 1980, kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) đã được ứng dụng rộng rãi hơn theo sự xuất hiện các dạng thương mại như là kit tinh sạch IgY, và các loại kháng thể thứ cấp kháng lại IgY kết gắn với các enzyme như alkaline phosphatase, peroxidase,…
Từ năm 1996, kĩ thuật IgY đã trở thành thuật ngữ được chấp nhận trên toàn cầu cho việc mô tả việc sản xuất và ứng dụng IgY Năm 1996, Trung tâm Phê chuẩn Các phương pháp thay thế ở Châu Âu (European Centre for the Validation Alternative methods -ECVAM) đã khuyến khích việc sử dụng IgY thay thế cho IgG trong động vật hữu nhũ,
để nhằm làm giảm bớt đau đớn gây ra bởi việc thu nhận kháng thể ở huyết thanh
3 Thành tựu và ứng dụng:
a Hiệu quả xã hội:
Những hạn chế do tiêm chủng vaccin hiệu lực không kịp thời đã được khắc phục khi dùng kháng huyết thanh(KHT) Phương thức sản xuất cổ điển là dùng KHT khác loài vì rẻ tiền và dễ làm
Mỗi năm, ước tính trên toàn thế giới có ít nhất 34.000 người tử vong vì bệnh dại và hơn 6 triệu người phải tiêm ngừa vaccin
Việc có mặt SAR( kháng huyết thanh dại) của Việt Nam từ 1997 đến nay đã góp phần quan trọng giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại hàng năm ở nước ta xuống 10 lần so với trước đây
Với KHT nọc rắn, chủ yếu có 2 nhóm kháng độc thần kinh và huyết học Trên thế giới có rất nhiều cơ sở sản xuất,
ở châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan và Việt Nam KHT mang tính đặc hiệu loài rất cao, không có loại KHT nào có khả năng chống lại nhiều loại rắn độc cắn vì thế khó đầu tư cho sản xuất
Sản xuất kháng huyết thanh ở nước ta cũng phải đối mặt với nhiều thách thức lớn có tính toàn cầu như bản quyền phát minh và công nghệ ứng dụng, tính đa giá và đặc hiệu, chất lượng và giá thành, yêu cầu của thị trường và kế hoạch sản xuất
Viện vaccin Việt Nam ở Nha Trang đã chọn 2 loại KHT rắn lục tre và hổ đất vì chúng là nguyên nhân chiếm đa
số trong 30.000 trường hợp bị rắn độc cắn hàng năm Sản phẩm đã có mặt trên thị trường và trong 2 năm qua đã cứu sống gần 100 bệnh nhân Việc đầu tư nghiên cứu sản xuất các KHT rắn cạp nong, cạp nia, hổ đất và rắn biển cũng đang được quan tâm
b Hiệu quả kinh tế:
Kháng huyết thanh cùng loài quá đắt: 1 liều điều trị uốn ván cần 155USD, dại cần 180 USD và bạch hầu cần 1.290 USD; Vì vậy, bệnh nhân ở các nước nghèo không thể chấp nhận mức phí cao như vậy được Và các nước này vẫn phải dùng kháng huyết thanh khác loài
Bảng giá tính theo USD cho 1 liều điều trị bằng KHT
(Uốn ván)
SAR (Dại)
SAV (Rắn cắn)
SAD (Bạch hầu)
Trang 6Việt Nam 0.3x3=1 6x2=12 5(1 lọ) 2
Bảng trên cho thấy giá kháng huyết thanh ở Việt Nam thấp hơn so với ở Thái Lan từ 1,6-7 lần Ngoài ra, do Việt Nam tự sản xuất KHT này nên không còn tình trạng thiếu thuốc khi cần đến
c Nhược điểm:
Tuy kháng huyết thanh khác loài rẻ hơn nhưng còn kém an toàn hơn so với kháng huyết thanh cùng loài
Song, so với tiêm Penicillin, tỷ lệ gây sốc quá mẫn vẫn thấp hơn khi tiêm kháng huyết thanh khác loài
Khó khăn về đạo đức, và vi phạm luật bảo vệ động vật
d Ứng dụng:
Năm 1894, A Calmette đã dùng kháng huyết thanh rắn hổ ở Viện Pasteur Sài Gòn và tiếp sau đó, trên thế giới có các KHT chữa bệnh dịch hạch, than, tả, bại liệt, viêm gan rồi tụ cầu, dại và hiện nay đang phát triển các KHT chống trực khuẩn mủ xanh, SARS…
Sự đa dạng của tương tác kháng nguyên–kháng thể và khả năng của con người điều khiển các đặc trưng của tương tác đã làm gia tăng việc sử dụng kháng thể và các phần riêng của kháng thể cho kỹ thuật hóa miễn dịch ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản và chẩn đoán, trị liệu
Việc sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp mở ra khả năng tạo ra số lượng vô cùng lớn của sự kết hợp giữa các immunoglobulin, các phân đoạn immunoglobulin, cụm và protein tiết, mở ra sự điều khiển tiếp theo những phân tử này cho những lợi thế mới
Các kháng thể đa dòng đã được sử dụng trong liệu pháp để cảm ứng miễn dịch thụ động
Sản xuất kháng thể nói chung và sản xuất kháng thể đơn dòng nói riêng có những ứng dụng chính như sau:
Phân tích miễn dịch:
Phát hiện sự có mặt của kháng nguyên tương ứng của nó trong các mẫu phân tích
Ức chế phản ứng thải loại khi ghép cơ quan:
Sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T, nhằm loại bỏ phản ứng thải loại khi cấy ghép các cơ quan của người với nhau
Chẩn đoán sự hình thành khối u:
Khi có sự hình thành khối u, trong máu sẽ xuất hiện một số tác nhân đánh dấu, do đó có thể sử dụng các phương pháp phân tích miễn dịch để phát hiện các tác nhân trên trong máu hoặc trong khối u ung thư, từ đó giúp chữa trị sớm bênh ung thư
Định hướng thuốc đúng mục tiêu:
Các tác nhân trị bệnh cụ thể như chữa trị ung thư đúng vị trí cần thiết, giảm nguy hiểm trong trường hợp ghép tủy
Tinh sạch protein:
Sử dụng tính chất kháng nguyên-kháng thể nhằm tinh sạnh nhiều loại protein có giá trị với độ tinh sạnh gấp hàng ngàn lần
Các phương pháp trong kĩ thuật di truyền như Western Blotting hay Elisa… cũng dựa trên tính chất kháng nguyên kháng thể
IV Nội dung nghiên cứu:
1.Công nghệ sản xuất kháng thể đa dòng từ động vật hữu nhũ:
Trong tự nhiên kháng nguyên có thể vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau như qua đường niêm mạc, đường
hô hấp, sinh dục, qua da (do xây xước hoặc côn trùng đốt) Chính vì thế, cơ thể sẽ có đáp ứng miễn dịch, tạo kháng thể chống lại một số tác nhân gây bệnh từ môi trường Tuy nhiên, để thu được lượng nhất định một loại kháng thể đặc hiệu kháng lại một kháng nguyên biết trước thì phải chủ động đưa kháng nguyên đó vào cơ thể động vật đã chọn để gây miễn dịch
Quy trình gây miễn dịch cơ bản tạo kháng thể đa dòng:
Bước 1: Tiêm kháng nguyên vào cơ thể động vật để gây đáp ứng miễn dịch:
Tiêm kháng nguyên vào cơ thể động vật để gây đáp
ứng miễn dịch Sau các mũi tiêm nhắc lại lấy máu kiểm tra hiệu giá
kháng thể Tinh chế kháng thể IgG
Kiểm tra độ sạch và nồng độ của huyết thanh sau tinh
chế
Trang 7Sau khi đã chọn được loại tá chất phù hợp, tiến hành phối trộn với kháng nguyên và đưa vào cơ thể động vật Người ta có thể chủ động tiêm kháng nguyên vào trong da, dưới da, trong bắp thịt hay tĩnh mạch, giúp kháng nguyên nhanh chóng tiếp cận với các hệ thống miễn dịch Khi tiêm vào bắp và dưới da sẽ kích thích hạch lympho ngoại vi, còn tiêm tĩnh mạch, phúc mạc sẽ kích thích hệ miễn dịch trong gan, lá lách và tủy xương Tiêm vào hạch kheo chân, kết mạc mắt sẽ kích thích tạo kháng thể toàn thân mạch.Có trường hợp khi tiêm kháng nguyên vào tĩnh mạch không gây đáp ứng miễn dịch nhưng khi tiêm vào tĩnh mạch dưới da cùng với phụ gia là tá chất thì hiệu quả là rất mạnh Đây chính là yếu tố quan trọng khi gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm
Mũi tiêm đầu tiên (ngày thứ nhất, tá chất là FCA) đối với động vật là chuột, thỏ có thể tiêm dưới da bụng Đối với thỏ có thể tiêm 8-10 vị trí khác nhau Các lần tiêm nhắc lại sau 8-10 ngày tính từ mũi tiêm trước đó, nhưng tá chất thường dùng là FIA hoặc kháng nguyên được hòa trong PBS không chứa azide
Bước 2: Lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể:
Sau các mũi tiêm nhắc lại tiến hành lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể, nếu hiệu giá kháng thể đạt yêu cầu thì tiến hành lấy máu toàn bộ Nếu không, tiếp tục tiêm các mũi tiếp theo đến khi hiệu giá kháng thể đạt yêu cầu thì lấy máu toàn bộ thu huyết thanh Trong thời gian gây miễn dịch, động vật được chăm sóc và nuôi dưỡng bằng thức ăn thông thường đã được chỉ định
Thời gian gây miễn dịch của các loài động vật khác nhau là khác nhau Cụ thể như, thời gian lấy máu của các động vật khác nhau được gây miễn dịch là khác nhau Ví dụ: ở chuột từ 2-3 tuần, ở thỏ từ 3-4 tuần, còn đối với cừu, ngựa, linh trưởng sau 4 tuần hoặc lâu hơn
Xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp Ouchterlony (khuếch tán miễn dịch kép)
+ Nguyên lý kỹ thuật: là sự ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra khi chúng di chuyển trên gel
agarose khi cho kháng nguyên và kháng thể ở độ pha loãng thích hợp Nếu kháng nguyên và kháng nguyên ngưng kết đặc hiệu sẽ cho cung kết tủa màu trắng và ngược lại, sẽ không có cung kết tủa nếu kháng nguyên và kháng thể không ngưng kết đặc hiệu
+ Ưu điểm: kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém do không phải sử dụng nhiều máy móc, hóa chất.
+ Nhược điểm: thời gian hoàn thành thí nghiệm kéo dài 3-4 ngày, sự phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể chỉ
mang tính định tính, không định lượng được chính xác được hàm lượng, hàm lượng kháng nguyên tối đa có thể phát hiện được rất lớn nên không thể xác định được những mẫu có hàm lượng kháng nguyên nhỏ hơn
Tiêu bản nhuộm Coomassie phương pháp Ouchterlony phát hiện kháng thể
Bước 3: Tinh chế kháng thể IgG:
Để sử dụng IgG cho các ứng dụng trên mẫu từ huyết thanh thu được, thì huyết thanh phải được tinh chế Hiện nay
có một số phương pháp tinh chế IgG như:
Kết tủa IgG từ huyết thanh hoặc dịch sinh vật khác bằng (NH4)2SO4
Tinh chế IgG nhờ sắc kí trao đổi ion
Tinh chế IgG nhờ cột ái lực protein A hoặc protein G-sepharose 4B
Kết tủa IgG từ huyết thanh hoặc dịch sinh vật khác bằng (NH4)2SO4:
Thêm bột rắn (NH4)2SO4 vào dịch sinh vật để đạt độ bảo hòa
Ủ hỗn hợp 30 phút ở 4oC, rồi ly tâm
Rửa kết tủa bằng dung dịch muối bảo hòa amon sulfat
Hòa tan lại kết tủa bằng dung dịch đệm
Tinh chế IgG nhờ sắc kí trao đổi ion:
Thường sử dụng DEAE-cellulose, DEAE-sephacryl, DEAE-sephadex
Kết tủa từ huyết thanh thỏ bằng amon sulfat 40-50%
Hòa tan tủa bằng đệm photphat 0,07M, pH =6,4, thẩm tích đối với đệm này
Trang 8Cho mấu vào các cột đã được cân bằng với đệm photphat, tiếp tục rửa chiết bằng đẹm photphat và thu mỗi phân đoạn 5ml
Theo dõi quá trình rửa chiết ở bước sóng 280nm
Tinh chế IgG nhờ cột ái lực protein A hoặc protein G-sepharose 4B:
Protein A và protein G đều có khả năng liên kết với cùng một vùng giữa các khu vực CH2, CH3 của phân tử IgG Protein A giữ liên kết đặc hiệu với phân tử IgG, nhưng protein G có liên kết ái lực rộng hơn ( ái lực cao với albumin, liên kết với một số chất ức chế: proteinase, marcoglobulin, kininogen)
Phương pháp này sử dụng đệm glixin-HCl 0,1M pH 2,5-2,8 để chiết rút các IgG ra khỏi cột
Kháng thể sau khi chiết rút được trung hòa bằng Tris-HCl 1M để tránh làm hỏng hoạt tính IgG
Bước 4: Kiểm tra độ sạch và nồng độ của kháng thể sau tinh chế:
Các phương pháp dung để kiểm tra độ sạch và nồng độ của kháng nguyên:
Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ sạch của huyết thanh sau tinh chế:
Huyết thanh sau khi tinh chế có thể còn lẫn một số protein khác Để kiểm tra độ sạch bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.Các giá thể được sử dụng cho điện di có thể là giấy thấm, gel agarose hoặc gel polyacrylamide được tẩm dung dịch đệm có pH thường là kiềm(pH 8.3-8.6)
Nguyên tắc phương pháp điện di SDS-PAGE: Các phân tử protein tích điện sẽ được di chuyển trên điện trường trên một giá thể rắn hoặc lỏng tùy theo đặc tính tính điện âm hoặc dương và cũng tùy thuộc vào kích thước của chúng Dựa vào maker chuẩn có thể xác định được loại protein trong mẫu
Tiêu bản nhuộm Coomassie bản điện dí SDS-PAGE các mẫu huyết thanh
Phương pháp điện di miễn dịch đối lưu:
Nguyên lý: kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật Ouchterlony nhưng thay cho sự khuếch tán tự nhiên ta dùng một
lực điện di để hướng dẫn cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau nhanh hơn trên gel agarose Khi đó kháng thể IgG và IgM sẽ di chuyển về phía cực âm, dưới tác dụng của dòng điện kháng nguyên và kháng thể gặp nhau trên gel
Ưu điểm: thời gian cho kết quả nhanh chỉ sau 1 giờ.
Nhược điểm: phương pháp chỉ mang tính chất định tính, tốn nhi phí nhiều hơn vì phải sử dụng thêm máy móc và
hóa chất
Nguyên lý: phương pháp dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng nguyên đánh dấu đồng vị phóng xạ với kháng nguyên
không đánh dấu đồng vị phóng xạ gắn vào kháng thể đặc hiệu
Ở lô đối chứng lấy một lượng nhất định kháng nguyên tinh khiết đánh dấu phóng xạ Kháng nguyên này cùng loại với mẫu thử nghiệm Trộn kháng nguyên đánh dấu trên với lượng kháng nguyên tương đương kháng thể đặc hiệu, rồi ủ Rửa kháng nguyên đánh dấu tự do Đo độ phóng xạ của phức hệ kháng nguyên-kháng thể(A)
Ở lô kiểm nghiệm, ngoài kháng nguyên đánh dấu và kháng thể như trên còn trộn thêm kháng nguyên cần thử không đánh dấu gắn vào kháng thể Rửa kháng nguyên đánh dấu tự do Đo độ phóng xạ của phức hệ kháng nguyên-kháng thể(B)
Dựa vào tỉ lệ độ phóng xạ đo được A/B xác định nồng độ kháng nguyên trong mẫu thử so với đường cong chuẩn
Ưu điểm: cho kết quả nhanh và có độ chính xác cao.
Nhược điểm: rất tốn kém, sử dụng chất phóng xạ nên không an toàn cho người thực hiện.
Phương pháp ELISA kiểm tra nồng độ của huyết thanh:
Nguyên lý: phương pháp là sự kết hợp giữa kháng nguyên-kháng thể đã được gắn enzyme Khi cho cơ chất thích
hợp, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện
Ưu điểm: kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên, kháng thể ở nồng độ rất thấp.
Trang 9Phương pháp ELISA có thể phát hiện kháng nguyên ở nồng độ thấp nên có thể định lượng lượng ovalbumin có trong mẫu vacxin cúm mà 2 phương pháp Ouchterlony và điện di đối lưu không phát hiện được
Với phương pháp miễn dịch phóng xạ mặc dù cũng phát hiện nhanh chóng và rất chính xác nhưng rất tốn kém vì trong quá trình sử dụng nhiều máy móc, hóa chất đắt tiền nên ít được sử dụng Phương pháp ELISA rẻ tiền, kỹ thuật khá nhạy và đơn giản nên dễ thực hiện, làm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành vacxin
Phương pháp ELISA còn an toàn với người thực hiện thử nghiệm, thời gian cho kết quả nhanh và chính xác
Nhược điểm: phải qua nhiều bước khác nhau nên tốn nhiều hóa chất, việc thực hiện các thao tác phải thật chính
xác về thời gian, nồng độ các chất
2 Tạo kháng thể đa dòng từ động vật lông vũ:
a Nguyên lý tạo IgY:
Giống như sự truyền kháng thể từ mẹ vào sữa non, gà bảo vệ thế hệ sau bằng cách truyền kháng thể vào lòng đỏ trứng của chúng
Globulin miễn dịch của gà được tiết vào trứng trong suốt thời kỳ đẻ trứng nên lòng đỏ trứng gà là nguồn tiềm năng cung cấp globulin miễn dịch, thích hợp cho việc tiêu dùng ở người
b Lịch sử phát triển:
Năm 1893, Klemperer đầu tiên mô tả thí nghiệm tạo miễn dịch trên gà tạo nên kết quả là sự chuyển kháng thể vào trong lòng đỏ trứng gà Một thời gian dài sau đó, không có bất kì ứng dụng khoa học nào cho hiểu biết này
Từ năm 1980, kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) đã được ứng dụng rộng rãi hơn theo sự xuất hiện các dạng thương mại như là kit tinh sạch IgY, và các loại kháng thể thứ cấp kháng lại IgY kết gắn với các enzyme như alkaline phosphatase, peroxidase,…
Từ năm 1996, kĩ thuật IgY đã trở thành thuật ngữ được chấp nhận trên toàn cầu cho việc mô tả việc sản xuất và ứng dụng IgY Năm 1996, Trung tâm Phê chuẩn Các phương pháp thay thế ở Châu Âu (European Centre for the Validation Alternative methods -ECVAM) đã khuyến khích việc sử dụng IgY thay thế cho IgG trong động vật hữu nhũ,
để nhằm làm giảm bớt đau đớn gây ra bởi việc thu nhận kháng thể ở huyết thanh
c Vai trò các chất miễn dịch trong lòng đỏ trứng:
Trong trứng có chứa Immunoglobulin (IgY)-nhân tố điều hòa miễn dịch (Immunoregulatory factor)
Gắn đặc hiệu với tác nhân bệnh làm bất hoạt chúng
- Tạo ra sự bảo vệ cục bộ chống lại sự nhiễm độc đường tiêu hóa
- Hoạt động trực tiếp trên bề mặt đường tiêu hóa
- Lưu thông một cách có hệ thống, làm ảnh hưởng đến tất cả các con đường miễn dịch, sinh lý, trao đổi chất, nội tiết trong cơ thể
d Tính chất của IgY:
IgY tương đương với IgG ở động vật hữu nhũ: Protein IgY có trọng lượng phân tử khoảng 180 kDa, chứa hai tiểu đơn vị: chuỗi nặng 67 -70 kDa, chuỗi nhẹ 22 -30 kDa
IgY có nhiều ưu điểm về mặt miễn dịch học và sinh học hơn immunoglobulin ở động vật hữu nhũ do sự khác biệt
về phát sinh chủng loại giữa hai loài
Có ít sự gắn không đặc hiệu của IgY với phần Fc - IgG của động vật hữu nhũ, có ít sự gắn với các yếu tố viêm khớp, các protein A hay G hay các chất bổ trợ và các protein vi khuẩn khác
Những đặc trưng này tạo nhiều thuận lợi cho sự phát triển các phương pháp xác định miễn dịch hiệu quả
Tiêm kháng nguyên vào gà
Gà tạo ra kháng huyết thanh
Kháng thể được chuyển từ kháng huyết thanh vào lòng đỏ trứng gà
Trang 10e Quy trình tạo kháng thể đa dòng từ động vật lông vũ:
QUI TRÌNH ĐỀ NGHỊ LIÊN QUAN ĐẾN MIỄN DỊCH TRÊN GÀ
- Tá dược (adjuvant)
- Lượng kháng nguyên: 10 – 100 µ g
- Vị trí tiêm: tiêm vào trong cơ (đối với gà còn non), tiêm dưới da (đối với gà già hơn)
- Thể tích tiêm: < 1ml
- Tần số tiêm: 2-3 lần, kích hoạt miễn dịch trong suốt thời kỳ đẻ trứng
- Khoảng cách giữa thời gian tiêm: 4 – 8 tuần
- Độ tuổi của gà: toàn bộ thời kì đẻ trứng (khoảng 1 năm)
f Ứng dụng của kháng thể đa dòng từ động vật lông vũ:
f1 Ứng dụng IgY trong nghiên cứu, chẩn đoán, điều trị bệnh:
Kháng sinh được sử dụng rộng rãi để điều trị nhiễm trùng Phương pháp điều trị bằng kháng sinh đang bị đe dọa bởi những con số ngày càng tăng của tác nhân ức chế miễn dịch, sự xuất hiện của các tác nhân gây bệnh mới (bao gồm cả những tác nhân không đáp ứng với kháng sinh, chẳng hạn như các virus), và hiện tượng vi sinh vật kháng kháng sinh ngày càng gia tăng
Trong nhiều năm qua, IgY đã được báo cáo là sử dụng thành công trong miễn dịch thụ động để bảo vệ chống lại mầm bệnh trong ruột người và động vật; là chất chữa trị miễn dịch chống lại bệnh khó có thể chữa trị bằng kháng sinh truyền thống hay bệnh thiểu năng miễn dịch
Tiêm vào gà để gây tạo đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể
Các mũi tiêm được tiêm nhắc lại để tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn sinh ra nhiều kháng thể trong một thời gian dài
Thu trứng gà Tinh chế kháng thể từ lòng đỏ trứng gà Kiểm tra nồng độ và độ sạch của kháng
thể sau khi tinh chế