BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC Danh sách sinh viên: Nguyễn Thị Liêm Thanh Nguyễn Thị Phương Thảo Trần Thị Tú Thảo Luân Đức Anh Thi Lê Đỗ Thái Thi Lớp DCQ2015 – Chiều thứ Nhóm – Tiểu nhóm 03 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 BÀI CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT Ngày: 27/02/2018 1.1 Tóm tắt lý thuyết: - Chọn lọc giống vi sinh vật phương pháp phân lập phát chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ mẫu vi sinh vật hỗn hơp Sau cải tạo ni cấy chúng mơi trường thích hợp, nhằm áp dụng đặc tính mong muốn vào thực tiễn - Để phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, dựa vào:  Chất chuyển hóa ra: kháng sinh, sắc tố, …  Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường: amylase – tinh bột, protease – gelatin, …  Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật  Sự thay đổi hình thái 1.2 Kết bàn luận: 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease: a Hình ảnh đĩa phân lập phát khả sinh enzym: 1.1 1.2 2.1 2.2 Ghi chú: - Phân lập môi trường tinh bột (1.1), tráng lên mơi trường Lugol (1.2) - Phân lập môi trường gelatin (2.1), tráng lên môi trường TCA 50% (2.2) Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 b Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào: Bảng Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Chủng Mô tả khuẩn lạc Amylase Protease Đường kính 0,9 – 1,2 cm Màu trắng đục, bìa chia thùy Đường kính vòng sáng 1,2 – 1,5 cm Đường kính 0,4 – 0,9 cm Trắng đục, bìa chia thùy Khơng thấy tượng Nhận xét: - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch tinh bột ủ 37 ⁰ C 24 có khả tiết amylase ngoại bào - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường gelatin ủ 37⁰ C 24 khơng có khả tiết Protease ngoại bào 1.2.2 Phát khả sinh khánh sinh: Bảng 2: Kết phát khả sinh kháng sinh (đường kính vùng kháng khuẩn – đơn vị (cm)) Chủng E.coli S.aureus Bacillus 1,2 Bacillus 0 Bacillus 1,6 Bacillus 0 Nhận xét: - Chủng vi sinh vật Bacillus có khả sinh kháng sinh ức chế phát triển E coli - Chủng vi sinh vật Bacillus có khả sinh kháng sinh ức chế phát triển S aureus Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 3.1 3.2 Ghi chú: Vi khuẩn E coli (3.1), vi khuẩn S aureus (3.2) Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Bài ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CĨ LỢI CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC 2.1 Tóm tắt lý thuyết: Vi sinh vật lựa chọn làm probiotic phải chịu môi trường pH acid dịch vị thành phần muối mật dịch mật Cho chủng vi sinh vật tiếp xúc với dịch vị có pH khác dịch mật có nồng độ khác khoảng thời gian định Trải vi sinh vật lên thạch đem ủ, đếm số khóm vi sinh vật so sánh với mẫu chứng để đánh giá khả chịu dịch vị, dịch mật VSV thể 2.2 Kết bàn luận: Bảng Kết thử nghiệm khả chịu acid dịch vị: Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Phút pH Đối chứng TBSD 300(SD3); A=3.106 MT pH2 Bào tử TBSD MT pH3 Bào tử TBSD Bào tử 308(BT3);A=3,08.106 60 155(SD3);A=1,55.106 300(BT3); A=3.106 90 80(SD3); A=8.105 >300 (SD2) 246(BT3);A=2,46.106 >300 (SD2) 300 (BT3);A=3.106 >300 (BT2) Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Bảng Kết thử nghiệm khả chịu acid dịch mật: Giờ pH 0,3 Đối chứng TBSD Bào tử 245(SD3);A=2,45.10 306(BT3);A=3,06.106 TBSD 0,5 Bào tử 234(SD3);A=2,34.106 250(BT3);A=2,5.106 >300 (SD2) TBSD 250(SD3);A=2,5.106 136(BT3);A=1,36.106 130(SD3);A=1,3.106 Bào tử >300 (BT2) 138(BT3);A=1,38.106 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Nhận xét: - Bào tử sinh sống tốt tế bào sinh dưỡng Trong dịch vị, vi khuẩn chịu đựng tốt pH=3 Trong dịch mật, vi khuẩn chịu đựng tốt nồng độ 0,3% Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 BÀI 3: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT 3.1 Tóm tắt lí thuyết - Amylase enzyme có nước bọt dịch mật người, có chức phân hủy tinh bột thành maltose sau thành glucose - Enzym amylase có nhiều ứng dụng trọng cơng nghiệp, thực phẩm, đặc biệt y học dịch phẩm tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược,… - Các chế phẩm amylase để đưa vào sử dụng y dược cần trải qua q trình tinh chế từ enzyme thơ - Enzym amylase cố định lên bề mặt hạt gel alginate, sau thu dịch lọc dịch enzyme tinh chế - Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel dựa mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode 3.2 Kết bàn luận 3.2.1 Hàm lượng protein Bảng Hàm lượng protein enzyme thô tinh chế OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg) Dịch thơ 0,3616 Vthô= 10 72,32 Enzym tinh chế 0,7314 Vtinh chế= 27 19,748 Mẫu 3.2.2 Hoạt tính enzyme a Đường chuẩn hoạt tính enzyme OD560 Bảng Thơng số đường chuẩn tinh bột Ống U/ml OD 0.2 0.4 0.6 0.8 0.3346 0.6325 0.9012 1.0862 1.2611 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Vẽ đường chuẩn ĐƯỜNG CHUẨN HOẠT ĐỘ AMYLASE 1.4 y = 1.1534x + 0.1511 R² = 0.9851 1.2 1.2611 1.0862 OD 0.9012 0.8 0.6325 0.6 0.4 0.3346 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 U/ml Y= 1,1534X + 0,1511 (R2=0,9851) b Hoạt tính enzyme Bảng Hoạt tính enzyme thơ tinh chế OD560 thử 0,6513 ΔOD560 HTE Độ pha loãng 0,5812 0,373 100 Hoạt tính tổng enzym (U) 373 0,8642 0,3336 0,158 10 42,66 Mẫu OD560 chứng Enzym thô 1,2325 1,1978 Enzym Hoạt tính riêng (U/protein) 2,16 5,158 tinh chế Hiệu suất tinh chế: HS= Utinh / Uthô = 42,66/373= 11,44% Mức tinh chế : HTRtinh / HTRthô = 2,16 / 5,158= 0,419 (lần) 3.2.3 Bàn luận - Sau trình tinh chế, hoạt tính riêng amylase tăng lên Hiệu suất tinh chế thấp 11,44%, amylase bị thất thoát nhiều - Mức tinh chế thấp 0,419 lần thao tác chưa xác lọc khơng kĩ, đo quang khơng cẩn thận,… làm giảm hoạt tính enzyme 10 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Bài CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINAT 4.1 Tóm tắt lý thuyết: - Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) enzyme chuyển hóa tinh bột chất tương tự thành cyclodextrin có mức polymer hóa 6, đơn vị glucose (tương ứng α-CD, β-CD γ-CD) - Việc cố định giúp tái sử dụng CGTase đắt tiền, đồng thời tăng cường tính ổn định hoạt tính enzyme - Dựa vào chất liên kết chất mang enzyme, cố định enzyme bao gồm phương pháp:  Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, …  Liên kết cộng hóa trị: dựa vào lực enzyme chất mang để tạo nên phức hợp enzyme - chất mang có liên kết cộng hóa trị  Bắt giữ enzyme gel: dựa vào hút giữ enzyme vào mạng lưới mà chất sản phẩm qua được, không cho enzyme khuếch tán vào môi trường  Tại vi nang: enzyme giữ bao vi thể có màng bán thấm dày 200 Å (như cellulose, polysaccharide) - Trong thực hành, enzyme cố định theo phương pháp hấp phụ bắt giữ - Nguyên tắc Enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca-alginat, emzyme bám bề mặt (hấp phụ) nằm (bắt giữ) hạt gel - Đệm Tris-HCl pH=8 dể tạo môi trường ổn định cho emzyme hoạt động tối ưu Tránh dùng dệm phosphate gel alginate không bền Bảng Các điểm khác biệt phương pháp hấp phụ bắt giữ Hấp phụ Bắt giữ Tạo gel Ca-alginat trước, sau cho enzyme vào hấp phụ Gel Ca-alginat tạo lúc bắt giữ enzyme Thời gian ủ lâu (45 phút) Thời gian ủ nhanh (10 phút) 11 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 4.2 Kết bàn luận: 4.2.1 Kết xác định hàm lượng protein a Xây dựng đường chuẩn BSA Bảng Thông số đường chuẩn BSA Ống nghiệm Nồng độ BSA 10 20 30 40 50 ΔOD595 nm 0.1116 0.2756 0.3501 0.5499 0.6004 Vẽ đường chuẩn Đường chuẩn BSA 0.7 0.6004 y = 0.0125x + 0.0009 R² = 0.9839 0.6 0.5499 ΔOD595 nm 0.5 0.3501 0.4 0.2756 0.3 0.2 0.1116 0.1 0 10 20 30 Nồng độ BSA 40 50 60 b Tính hàm lượng protein Bảng Hàm lượng protein enzyme thô tinh chế Enzym ban đầu 0.4057 Nồng độ BSA (µg/ml) 32.384 Enzym KCĐ theo bắt giữ 0.5832 46.584 Mẫu OD595 nm Hàm lượng protein (mg) Vban đầu = Hệ số pha loãng 200 Vgộp = 39 1000/850 2.1374 Thể tích (ml) 4.3394 Enzym CĐ theo bắt giữ Enzym KCĐ theo hấp phụ Enzym CĐ theo hấp phụ 6.4768 0.4685 37.408 Vgộp = 40 1000/850 1.7604 4.7164 12 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 4.2.2 Kết xác định hoạt tính enzyme chế phẩm hoạt tính enzyme cố định: a Xây dựng đường chuẩn CD Bảng Thông số đường chuẩn CD Số thứ tự Nồng độ CD (mg) 10 1.1183 1.0784 0.9734 0.9176 0.8720 0.7980 ΔOD550 nm Vẽ đường chuẩn Đường chuẩn CD 1.1183 1.2 1.0784 0.9734 0.9176 0.872 ΔOD550 nm 0.798 0.8 y = -0.0325x + 1.1222 R² = 0.9866 0.6 0.4 0.2 0 10 12 Nồng độ CD b Hoạt tính Enzym Bảng Hoạt tính Enzyme ΔOD550nm Lượng CD (mg) Hệ số pha loãng Hoạt tính chung (U) Hoạt tính riêng (U/mg pro) 1.0321 0.1027 31.3692 30 558.45 86.96 1.2561 0.8216 0.4345 21.16 10/0.6 207.15 47.74 1.1219 1.0052 0.1167 30.94 10/0.6 302.89 64.22 Mẫu OD550nm chứng OD550nm thử Enzym ban đầu 1.1348 Enzym CĐ theo bắt giữ Enzym CĐ theo hấp phụ 13 Lớp D15 – Nhóm 06 – Chiều thứ – Tiểu nhóm 03 Hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt tính enzyme theo phương pháp Bảng Hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt tính Enzym theo phương pháp bắt giữ hấp phụ Bắt giữ Hấp phụ Hiệu suất cố định Tỉ lệ hoạt tính 4.3 Nhận xét: Phương pháp cố định enzyme phương pháp hấp phụ cho hiệu suất tỉ lệ hoạt tính cao phương pháp bắt giữ 14