BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tóm tắt lý thuyết: - Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hơp.. - Để phát hiện dòng vi sinh

BÁO CÁO THỰC TẬP

CÔNG NGHỆ

SINH HỌC

Danh sách sinh viên:

1 Nguyễn Thị Liêm Thanh

2 Nguyễn Thị Phương Thảo

3 Trần Thị Tú Thảo

4 Luân Đức Anh Thi

5 Lê Đỗ Thái Thi

Lớp DCQ2015 – Chiều thứ 3 Nhóm 6 – Tiểu nhóm 03

2

BÀI 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

Ngày: 27/02/2018 1.1 Tóm tắt lý thuyết:

- Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật

có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hơp Sau đó cải tạo và nuôi cấy

chúng trong môi trường thích hợp, nhằm áp dụng các đặc tính mong muốn đó vào

thực tiễn

- Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, có thể dựa vào:

 Chất chuyển hóa tại ra: kháng sinh, sắc tố, …

 Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase – tinh bột,

protease – gelatin, …

 Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật

 Sự thay đổi hình thái

1.2 Kết quả và bàn luận:

1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease:

a Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym:

Ghi chú:

- Phân lập trên môi trường tinh bột (1.1), tráng lên môi trường một ít Lugol (1.2)

- Phân lập trên môi trường gelatin (2.1), tráng lên môi trường một ít TCA 50% (2.2)

2.2

2.2

3

b Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào:

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

1

Đường kính 0,9 – 1,2 cm

Màu trắng đục, bìa chia

thùy

Đường kính vòng sáng 1,2 – 1,5 cm

2 Đường kính 0,4 – 0,9 cm

Trắng đục, bìa chia thùy

Không thấy hiện tượng

Nhận xét:

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ

ở 37 ⁰ C trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường gelatin và ủ ở 37⁰ C trong 24 giờ không có khả năng tiết Protease ngoại bào

1.2.2 Phát hiện khả năng sinh khánh sinh:

Bảng 2: Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh (đường kính vùng kháng khuẩn

– đơn vị (cm))

Nhận xét:

- Chủng vi sinh vật Bacillus 1 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của

E coli

- Chủng vi sinh vật Bacillus 3 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của

S aureus

4

Ghi chú: Vi khuẩn E coli (3.1), vi khuẩn S aureus (3.2)

5

Bài 2 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA

VI KHUẨN PROBIOTIC

2.1 Tóm tắt lý thuyết:

Vi sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải chịu được môi trường pH acid của dịch vị và thành phần muối mật của dịch mật

Cho chủng vi sinh vật tiếp xúc với dịch vị có pH khác nhau hoặc dịch mật có nồng độ khác nhau trong các khoảng thời gian nhất định Trải vi sinh vật lên thạch rồi đem ủ, đếm số khóm vi sinh vật rồi so sánh với mẫu chứng để đánh giá khả năng chịu dịch vị, dịch mật của VSV trong cơ thể

2.2 Kết quả và bàn luận:

Bảng 1 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị:

Phút pH

0 300(SD3); A=3.10

6 308(BT3);A=3,08.106

6 300(BT3); A=3.106 >300 (SD2) 300 (BT3);A=3.106

5

246(BT3);A=2,46.106 >300 (SD2) >300 (BT2)

Bảng 2 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu acid dịch mật:

0 245(SD3);A=2,45.106 306(BT3);A=3,06.106

Nhận xét:

- Bào tử sinh sống tốt hơn tế bào sinh dưỡng

- Trong dịch vị, vi khuẩn chịu đựng tốt hơn ở pH=3

- Trong dịch mật, vi khuẩn chịu đựng tốt hơn ở nồng độ 0,3%

9

BÀI 3: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

3.1 Tóm tắt lí thuyết

- Amylase là enzyme có trong nước bọt và dịch mật của người, có chức năng phân hủy tinh bột thành maltose và sau cùng thành glucose

- Enzym amylase có nhiều ứng dụng trọng công nghiệp, thực phẩm, đặc biệt là y học như dịch phẩm tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược,…

- Các chế phẩm amylase để được đưa vào sử dụng trong y dược cần trải qua quá trình tinh chế từ enzyme thô

- Enzym amylase được cố định lên bề mặt các hạt gel alginate, sau đó thu dịch lọc sẽ được dịch enzyme tinh chế

- Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel dựa trên mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode

3.2 Kết quả và bàn luận

3.2.1 Hàm lượng protein

Bảng 4 Hàm lượng protein của enzyme thô và tinh chế

(mg)

3.2.2 Hoạt tính enzyme

a Đường chuẩn hoạt tính enzyme và OD560

Bảng 2 Thông số đường chuẩn tinh bột

10

Vẽ đường chuẩn

0.3346

0.6325

0.9012

1.0862

1.2611

y = 1.1534x + 0.1511 R² = 0.9851

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

U/ml

ĐƯỜNG CHUẨN HOẠT ĐỘ AMYLASE

Y= 1,1534X + 0,1511 (R2=0,9851)

b Hoạt tính enzyme

Bảng 3 Hoạt tính enzyme thô và tinh chế

Mẫu

OD560 chứng

OD560 thử

ΔOD560 HTE

Độ pha loãng

Hoạt tính tổng enzym (U)

Hoạt tính riêng (U/protein)

Enzym

tinh chế

Hiệu suất tinh chế: HS= Utinh / Uthô = 42,66/373= 11,44%

Mức tinh chế : HTRtinh / HTRthô = 2,16 / 5,158= 0,419 (lần)

3.2.3 Bàn luận

- Sau quá trình tinh chế, hoạt tính riêng của amylase tăng lên Hiệu suất tinh chế

thấp 11,44%, amylase bị thất thoát nhiều

- Mức tinh chế thấp 0,419 lần có thể do thao tác chưa chính xác như lọc không

kĩ, đo quang không cẩn thận,… làm giảm hoạt tính enzyme

11

Bài 4 CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINAT 4.1 Tóm tắt lý thuyết:

- Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzyme duy nhất chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự thành các cyclodextrin có mức

polymer hóa 6, 7 và 8 đơn vị glucose (tương ứng α-CD, β-CD và γ-CD)

- Việc cố định sẽ giúp tái sử dụng CGTase đắt tiền, đồng thời tăng cường tính ổn định và hoạt tính enzyme

- Dựa vào bản chất liên kết giữa chất mang và enzyme, cố định enzyme bao gồm các phương pháp:

 Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, …

 Liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo nên

phức hợp enzyme - chất mang có liên kết cộng hóa trị

 Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ

chất và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường

 Tại vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200

Å (như cellulose, polysaccharide)

- Trong bài thực hành, enzyme được cố định theo phương pháp hấp phụ và bắt giữ

- Nguyên tắc là do Enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca-alginat, emzyme có thể bám trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel

- Đệm Tris-HCl pH=8 dể tạo môi trường ổn định cho emzyme hoạt động tối ưu Tránh dùng dệm phosphate vì gel alginate không bền

Bảng 1 Các điểm khác biệt giữa phương pháp hấp phụ và bắt giữ

Tạo gel Ca-alginat trước, sau đó mới cho

enzyme vào hấp phụ

Gel Ca-alginat được tạo cùng lúc bắt giữ enzyme

Thời gian ủ lâu (45 phút) Thời gian ủ nhanh (10 phút)

12

4.2 Kết quả và bàn luận:

4.2.1 Kết quả xác định hàm lượng protein

a Xây dựng đường chuẩn BSA

Bảng 2 Thông số đường chuẩn BSA

Vẽ đường chuẩn

b Tính hàm lượng protein

Bảng 3 Hàm lượng protein của enzyme thô và tinh chế

Nồng độ BSA (µg/ml)

Thể tích (ml)

Hệ số pha loãng

Hàm lượng protein (mg)

Enzym KCĐ theo bắt giữ 0.5832 46.584 Vgộp = 39 1000/850 2.1374

Enzym KCĐ theo hấp phụ 0.4685 37.408 Vgộp = 40 1000/850 1.7604

0

0.1116

0.2756

0.3501

0.5499

0.6004

y = 0.0125x + 0.0009 R² = 0.9839

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

0 10 20 30 40 50 60

Nồng độ BSA

Đường chuẩn BSA

13

4.2.2 Kết quả xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và hoạt tính enzyme

cố định:

a Xây dựng đường chuẩn CD

Bảng 4 Thông số đường chuẩn CD

ΔOD550 nm 1.1183 1.0784 0.9734 0.9176 0.8720 0.7980

Vẽ đường chuẩn

b Hoạt tính Enzym

Bảng 5 Hoạt tính Enzyme

chứng

OD550nm thử ΔOD550nm

Lượng

CD (mg)

Hệ số pha loãng

Hoạt tính chung (U)

Hoạt tính riêng (U/mg pro)

Enzym CĐ theo

47.74

Enzym CĐ theo

64.22

1.1183

1.0784

0.9734

0.9176

0.872

0.798

y = -0.0325x + 1.1222 R² = 0.9866

0 0.2 0.4 0.6 0.8

1 1.2

0 2 4 6 8 10 12

Nồng độ CD

Đường chuẩn CD

14

Hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính enzyme theo các phương pháp

Bảng 6 Hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính Enzym theo phương pháp bắt giữ và hấp phụ

Hiệu suất cố định

4.3 Nhận xét:

Phương pháp cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ cho hiệu suất và

tỉ lệ hoạt tính cao hơn phương pháp bắt giữ