Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học

Vai trò công nghệ tế bào công nghệ sinh học I KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC Có nhiều định nghĩa cách diễn đạt khác công nghệ sinh học tùy theo tác giả, tất thống khái niệm sau đây: Công nghệ sinh học trình sản xuất sản phẩm quy mô công nghiệp, nhân tố tham gia trực tiếp định tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống thể sinh vật hoạt động lĩnh vực sản xuất xem lò phản ứng nhỏ Đầu năm 1980, bắt đầu hình thành công nghệ sinh học đại lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học tế bào biến đổi di truyền Công nghệ sinh học đại đời với xuất kỹ thuật gen Cơ sở sinh học áp dụng bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, nguyên lý kỹ thuật máy tính Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học cách tổng quát nhất: - Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ sử dụng phận hay tế bào riêng rẽ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm chúng - Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ chuyển hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm chức gen Sự khác biệt rõ rệt hai định nghĩa thuộc đối tượng tác động công nghệ sinh học: UNESCO xem quan, phận, tế bào chức riêng rẽ sinh vật đối tượng, Trường Luật Stanford lại coi gen đối tượng tác động công nghệ Từ định nghĩa trên, phân biệt hai nhóm công nghệ sinh học là: Công nghệ sinh học truyền thống (traditional biotechnology) Bao gồm: + Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional fermentations) + Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation technology) + Sản xuất phân bón thuốc trừ sâu vi sinh vật (production of microbial fertilizer and pesticide) + Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass production) + Nhân giống vô tính nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant micropropagation) + Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization) Công nghệ sinh học đại (modern biotechnology) Bao gồm: + Nghiên cứu genome (genomics) + Nghiên cứu proteome (proteomics) + Thực vật động vật chuyển gen (transgenic animal and plant) + Động vật nhân (animal cloning) + Chip DNA (DNA chip) + Liệu pháp tế bào gen (gene and cell therapy) + Protein biệt dược (therapeutic protein) + Tin sinh học (bioinformatics) + Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology) + Hoạt chất sinh học (bioactive compounds) II KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Công nghệ tế bào phận quan trọng công nghệ sinh học, chủ yếu nghiên cứu trình nuôi cấy tế bào động - thực vật vi sinh vật để sản xuất sinh khối, sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vaccine, chất thứ cấp…) Mặc dù, kỹ thuật nuôi cấy tế bào phát triển vào nửa đầu kỷ 20, đến ứng dụng chúng có bước tiến vượt bậc nhờ đóng góp công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ tế bào bao gồm: - Công nghệ tế bào thực vật - Công nghệ tế bào động vật - Công nghệ tế bào vi sinh vật III VAI TRÒ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Công nghệ tế bào công nghệ gen 1.1 Cơ sở khoa học công nghệ gen  Dựa vào đặc điểm hoạt động gen - Gen mã hóa protein theo mã ba  biểu tính trạng + Thay đổi gen  thay đổi tính trạng + Sử dụng gen để biểu  sản xuất chế phẩm - Gen đoạn ADN + Có thể cắt rời nhờ enzim cắt liêt kết phosphodiester (RE) + Gen thực thể hoạt động độc lập + Có khả di chuyển vào tế bào lạ nhờ công cụ - Hoạt động gen + Gen chuyển vào tế bào lạ  gen biểu hệ gen tế bào lạ không bị ảnh hưởng  Dựa vào tính toàn tế bào Một tế bào chuyên hóa chứa lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với thể trưởng thành, để điều kiện định tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh 1.3 Vai trò công nghệ tế bào công nghệ gen Tùy vào đối tượng nhận gen tế bào thực vật, tế bào động vật hay vi sinh vật mà vai trò công nghệ tế bào thể khác Trong công nghệ gen vai trò công nghệ tế bào thể khâu nuôi cấy tế bào 1.3.1 Nuôi cấy tế bào thực vật Sau thực bước trình chuyển gen: xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm; phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cDNA từ thư viện genomic DNA); gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp; biến nạp vào E coli; tách chiết DNA plasmid; biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, tế bào đặt xung điện ngắn, xung điện làm xuất lỗ tạm thời màng tế bào, phân tử DNA vào bên tế bào Sau biến nạp người ta tách enzyme phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo nên Các tế bào biến nạp nuôi cấy môi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo nên hoàn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Bên cạnh phương pháp biến nạp Agrobacterium xung điện, có hai phương pháp khác thường sử dụng để đưa DNA vào tế bào Phương pháp thứ vi tiêm: với pipet nhỏ người ta đưa phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp Phương pháp sử dụng tế bào động vật, sau người ta sử dụng cho tế bào thực vật Phương pháp thứ hai bắn vào tế bào vi đạn (microprojectile), thường vàng wolfram, bao bọc DNA Phương pháp gọi phi sinh học sử dụng thành công nhiều loại tế bào khác Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối thường tế bào biến nạp, mà thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật tái sinh dễ dàng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, tái sinh mầm ngũ cốc loại cỏ khác gặp vài khó khăn Từ tế bào biến nạp người ta tạo chuyển gen, tế bào mang DNA ngoại lai tiếp tục chuyển cho hệ sau sau nở hoa tạo hạt 1.3.2 Nuôi cấy tế bào động vật Công nghệ tạo động vật chuyển gen trình phức tạp loài khác khác nhiều nội dung gồm bước sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn tạo tổ hợp gen biểu tế bào động vật; tạo sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định biểu gen lạ tạo dòng động vật chuyển gen gốc cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen Tế bào trứng tiền nhân sau vi tiêm nuôi cấy ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) túi phôi (blastocyst) Ở giai đoạn màng (pellucida) bị bong phôi làm tổ Những phôi cấy chuyển vào nhận gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể Ðối với động vật bậc thấp cá không cần giai đoạn Tuy nhiên cá, trứng sau thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, dai dính gây trở ngại cho việc định vị xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để đưa DNA vào trứng Mặt khác giai đoạn phôi tế bào cá ngắn việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ xác Ðể khắc phục nhược điểm này, người ta tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột Ðể khẳng định động vật có chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải Sơ đồđược tạo động kiểm tra xem gen lạ cóHình xâm2:nhập vào vật chuyển máy digen truyền động vật trưởng thành hay không sản phẩm gen lạ có tổng hợp hay không Ðối với vấn đề thứ người ta sử dụng phương pháp lai phân tử pha rắn (Southern blot, Northern blot ) PCR Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm gen lạ đánh giá hai mức độ: phiên mã dịch mã Sản phẩm phiên mã đánh giá phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã đánh giá phương pháp Western blot, ELISA kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát protein lạ động vật Theo dõi hệ sau động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ) để xác định gen lạ có di truyền hay không Sau kiểm tra thấy gen ngoại lai di truyền ổn định, tiến hành lai tạo chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen 1.3.3 Nuôi cấy tế bào vi sinh vật Sự sinh trưởng quần thể vi khuẩn môi trường dinh dưỡng nhân tạo gọi nuôi cấy (cultivation) Một kiểu nuôi cấy chứa loại vi sinh vật gọi nuôi cấy khiết (pure culture) Nuôi cấy hỗn hợp (mixed culture) loại nuôi cấy chứa nhiều loại vi sinh vật Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật sau: - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho phép vi sinh vật sinh trưởng tốt - Khử trùng môi trường để loại bỏ tất thể sống có bình nuôi cấy - Cấy vi sinh vật vào môi trường chuẩn bị Để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nuôi cấy phải chuẩn bị loại bình nuôi sử dụng phổ biến nhất, chẳng hạn ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri nồi lên men Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: môi trường tự nhiên (dựa kinh nghiệm) môi trường tổng hợp (thành phần hóa học xác định) Nói chung, môi trường dinh dưỡng khác hình thái (dạng rắn lỏng) thành phần, tùy thuộc vào loại vi sinh vật nuôi cấy mục đích nuôi cấy Môi trường sau phải khử trùng để loại bỏ tất thể sống bình chứa môi trường Phương pháp khử trùng phổ biến khử trùng nước áp suất cao nồi khử trùng (autoclave) Tiếp mẫu (vi sinh vật) vào bình chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng Sự tiếp mẫu nuôi cấy môi trường rắn có agar thực que cấy có vòng kim loại đầu (metal wire loop) khử trùng nhanh trước sử dụng cách đốt nóng đèn cồn Cấy chuyển nuôi cấy lỏng thường thực Pasteur pipette Sự tiếp mẫu thường tiến hành tủ cấy vô trùng (laminar flow cabinet) để giảm thiểu nguy nhiễm bẩn Ví dụ: Người ta chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin người sang cho E coli Vi khuẩn E coli tái tổ hợp gen nuôi cấy nồi lên men có dung tích 1.000 L, sau thời gian ngắn thu 200g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 bò Công nghệ tế bào 2.1 Công nghệ tế bào thực vật 2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào a Cơ sở khoa học - Dựa vào tính toàn tế bào thực vật - Khả phân hóa phản phân hóa tế bào thực vật - Sự sinh trưởng tế bào thực vật - Vai trò chất điều hòavật sinh trưởng Mẫu b Quy trình Khử trùng Nuôi cấy ban đầu (Tạo callus) Tạo phôi Tạo hạt nhân tạo Tạo chồi Tạo rễ Tạo  Chuẩn bị mẫu vật - Chọn mẫu vật có khả nuôi cấy tốt - Thu hái mẫu vật - Khử trùng sơ bộ: cồn 700C - Khử trùng tuyệt đối: HgCl2 0,1%  Chuẩn bị môi trường Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng loại mô nuôi cấy khác môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm loại muối nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium sulfur Đây sáu nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng thực vật bậc cao - Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm loại muối sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum cobalt dạng vết - Các phụ gia hữu cơ: Một lượng nhỏ loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), amino acid (thường cho phép bỏ qua số trường hợp đặc biệt dùng), phụ gia hữu không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…) - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật: Thành phần phụ gia quan trọng định kết nuôi cấy chất điều hòa sinhtrưởng Các auxin (IAA2 dạng tương tự tổng hợp nhân tạo 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…), cytokinin (zeatin, 2i-P7 dạng tương tự tổng hợp nhân tạo kinetin, BA8…) nhóm chất kích thích sinh trưởng phát sinh hình thái chủ yếu nuôi cấy mô quan thực vật - Nguồn carbon: Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon thực vật cố định từ khí quang hợp Trong đa số thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật khả quang hợp Glucose thường đưa vào môi trường cho hiệu tương đương sucrose, fructose cho hiệu - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường: Thường sử dụng agar, loại polysaccharide thu từ số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta) Một số hợp chất khác thử nghiệm thành công alginate, phytagel, methacel gel-rite  Nuôi cấy ban đầu Môi trường MS + 30g/l agar + 30g/l saccharose + 1-3 ppm 2,4 D  Thực trình phản phân hóa tạo callus  Nhân nhanh callus Môi trường MS + 1-2ppm 2,4 D + 1-2 ppm BAP  Tăng số lượng callus  Tạo phôi Môi trường MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 1-5ppm 2,4 D; 1-2ppm BA; 12ppm NAA;  Tạo phôi để nuôi cấy thành  Sản xuất hạt nhân tạo  Tạo chồi Môi trường MS + Kinetin + BAP + Zeatin (1-3ppm)  Tạo chồi từ callus  Tạo rễ - Môi trường MS + NAA, TAA, PAA (1-3 ppm) - Rễ tạo từ callus  Nuôi cấy tạo Nuôi cấy tiếp môi trường tạo rễ tạo hoàn chỉnh  Đưa vườn ươm c Thành tựu Tạo hàng loạt ưu việt nhân nhanh trồng quy mô công nghiệp Đây tảng công nghệ vi nhân giống Ví du: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, mía đường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa, anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả, cẩm chướng, cúc,Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, … Một số tái sinh phòng thí nghiệm: bơ, ca cao, cà phê, Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngô, đậu, củ từ, đậu nành, (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987) Trong cải tạo giống nhiều tạo giống có suất cao chống chịu giỏi lại hạt hạt để gieo trồng lại Bằng phương pháp nói trên, người ta sản xuất hạt nhân tạo tế bào bình thường với lượng lớn Trên thị trường giới có bán nhiều hạt nhân tạo với tính ưu việt nói trên, có hạt lúa mì, hạt lúa, táo,… 2.1.2 Công nghệ tế bào trần a Cơ sở khoa học - Tế bào thực vật có màng cellulose - Các sở công nghệ nuôi cấy mô tế bào - Dựa vào đặc điểm lai tế bào soma + Nhân lai + tế bào chất lai  lai + Nhân lai + tế bào chất không lai + Nhân không lai + Tế bào chất lai + Nhân không lai + tế bào chất không lai b Quy trình  Tạo mẫu vật - Chọn nguyên liệu Thường sử dụng mô thịt trưởng thành có tính trạng sinh lý tốt Vì nguồn nguyên liệu thông dụng truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, dễ phân lập số lớn tế bào tương đối đồng Lấy từ không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ Cũng tách tế bào trần từ mô sẹo, bao phấn - Xử lý sơ bộ: Các tế bào ngâm dung dịch ổn định áp suất thẩm thấu Thường sử dụng mannitol sorbitol 12 – 14% để trì tính ổn định màng sinh chất  Xử lý enzim thủy phân tạo tế bào trần Dùng enzim pectinase, hemicellulase, cellulase để phá vỡ thành tế bào Có thể dùng riêng lẻ kết hợp tùy vào loại tế bào  Tách tế bào trần - Xác định xem thành tế bào hay không: Dùng calcofour để xác định Calcofour bám vào phân tử cellulose phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh rực rỡ soi tia cực tím Nếu tế bào bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi thường có màu tối thẫm, tế bào trần không nhìn thấy ngoại trừ tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ lạp thể - Xác định khả sống sót tế bào trần: tế bào chất tế bào xuất dạng dòng chảy chuyển động tròn, trông hạt nhỏ nguyên sinh chất tế bào sống Ngược lại tế bào chết - Xác định sức sống tế bào trần: Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10ml môi trường tách tế bào trần Lấy 0,25ml huyền phù tế bào trần đưa vào 1ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để 15 phút Những tế bào nguyên vẹn ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, tế bào có màng nguyên sinh chất bị chức bắt màu xanh chúng sinh trưởng  Nuôi cấy môi trường đẳng trương c Thành tựu Công nghệ tế bào trần có vai trò quan trọng tạo giống Ngày người ta sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo lai Chẳng hạn, lai khoai tây trồng khoai tây hoang dại Gene hoang dại giúp trồng chống bệnh virus Người ta lai cà chua với khoai tây (họ hàng chúng xa nhau) cho lai mang cà chua củ khoai tây Bằng cách này, người ta tạo lai cà rốt rau mùi, cam chanh, … Đối với cọ dầu, từ protoplast sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene nâng cao hiệu quả, chọn lọc dòng có dầu có suất cao Đối với mía, dung hợp protoplast có ý nghĩa lớn việc phổ biến giống mía không hoa (trốn cờ) bất thụ Các kết nghiên cứu CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) CEBTEC (Divis.o de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) Brazil cho thấy, dung hợp protoplast mía giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dòng mía qua dòng mía khác Dung hợp protoplast chọn giúp dòng cà phê kháng bệnh độc tố nấm tiết để đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn dòng tế bào kháng độc tố cho cà phê Năm 1987, Costa Rica tái sinh cà phê từ protoplast tách từ phôi vô tính hình thành từ huyền phù tế bào callus Sau nuôi cấy protoplast vài lần môi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D 0,5 mg/l NAA, tác giả thu callus nhỏ Khi cấy chuyền sang môi trường chất sinh trưởng callus phát triển thành phôi phát triển thành hoàn chỉnh Người ta dung hợp protoplast cao su từ tế bào phôi vô tính Đến có 70 loài sinh từ protoplast Khi dung hợp protoplast, người ta tạo giống lai tế bào thực vật vi khuẩn Sự dung hợp protoplast tế bào tảo lam (vừa,có đặc tính quang hợp vừa có đặc tính cố định N2 không khí) với callus thực vật làm kích thích phát triển chúng Cũng với kĩ thuật trên, người ta dung hợp tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt phấn) để tạo lai họ với Tóm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast mở khả rộng lớn việc tạo ta giống tập hợp nhiều đặc tính tốt từ khác Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast, trở thành công cụ nghiên cứu trình sinh hóa, đặc biệt acid nucleic protein tế bào, dùng mô hình nghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu xâm nhập vi khuẩn vào tế bào, nghiên cứu trình cộng sinh vi khuẩn Đậu, nghiên cứu enzyme, nghiên cứu chế trình quang hợp v.v làm sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng phục vụ cho đời sống người 2.2 Công nghệ tế bào động vật 2.2.1 Chuyển phôi tạo giống vật nuôi a Cơ sở khoa học - Dựa vào đặc điểm sinh sản động vật + Động dục + Quá trình thụ tinh + Quá trình nuôi thai - Dựa vào trình phát triển phôi động vật + Các giai đoạn phát triển + Môi trường phát triển - Đặc điểm tế bào động vật b Quy trình - Xử lý cho phôi + Thực trình thụ tinh + Cung cấp phôi - Xử lý phôi + Tách phôi + Chuyển gen - Xử lý vật mang phôi c Thành tựu Phương pháp chuyển phôi sử dụng để tăng khả sinh sản động vật Hiện phương pháp phổ biến sử dụng thực tiễn chọn giống gia súc (trâu, bò, cừu, lợn, dê, ) nhiều nước giới 2.2.2 Nuôi cấy tế bào động vật a Quy trình  Chọn tế bào nuôi cấy - Dựa vào mục đích để chọn tế bào nuôi cấy - Chọn tế bào có độ tuổi thích hợp (thường tế bào độ tuổi non)  Chuẩn bị môi trường Môi trường đặc trưng dùng nuôi cấy tế bào động vật bao gồm amino acid, vitamin, hormone, nhân tố sinh trưởng, muối khoáng glucose Ngoài ra, môi trường cần cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương động vật có vú Môi trường Eagle (Eagle 1959), môi trường sử dụng phổ biến nuôi cấy tế bào động vật (Hình10)  Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy bể nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất sản phẩm sinh-dược dựa sở nuôi cấy dịch huyền phù hệ lên men Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào động vật thực vật khó khăn nhiều so với vi sinh vật, trình trao đổi chất loại tế bào diễn chậm, điều phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm tế bào Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp so với vi khuẩn nấm 10 Hình 10: Thành phần môi trường Eagle (1959) men, chúng thành tế bào vi khuẩn dễ biến dạng vỡ Do đó, hệ thống khuấy sục khí thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn Mặc dù có số điểm không thuận lợi, hệ thống lên men sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật vài chục năm trước Các dòng tế bào khác BHK-21, LS, tế bào Namalwa… sinh trưởng hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập môi trường để sản xuất viral vaccine sản phẩm khác Đặc điểm dễ biến dạng dễ vỡ tế bào động vật khắc phục cách đưa vào cánh khuấy có dạng hình mái chèo Việc cung cấp khí trực tiếp tạo bọt khí dễ làm vỡ tế bào, cần cung cấp khí cách khuếch tán thông qua ống silicone Môi trường chứa nhiều protein huyết có khả gây tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm nhẹ Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen.Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm không tạo bọt khí tốc độ truyền oxygen thỏa đáng  Thu nhận chế phẩm - Tách chiết thành phần mong muốn từ tế bào - Tạo chế phẩm b Thành tựu 2.2.3 Nhân vô tính động vật 2.2.4 Công nghệ tế bào gốc, tế bào mầm Tế bào gốc loại tế bào chuyên biệt hoá, có nhiều tiềm – biến thành nhiều loại tế bào khác Phân biệt tế bào gốc phôi, từ thai từ thể trưởng thành Thường giai đoạn phôi có nhiều Những thành tựu khoa học cho thấy, từ thể trưởng thành tách thành tế bào gốc từ chuyển hoá thành nhiều loại tế bào khác Cụ thể, từ tế bào da người trưởng thành chuyển hoá thành tế bào gốc, thông qua phương pháp chuyển-mở số gen nhân tế bào, làm cho chúng trở thành dạng sơ khai, dạng gốc ban đầu Việc đưa lại nhiều triển vọng lớn trị liệu, ví thể bị thoái hoá tim chẳng hạn, người ta lấy tế bào gốc người để chuyển hoá thành tế bào tim nuôi dưỡng chúng thành tim làm thủ thuật thay Trong trình nghiên cứu, người ta tạo tế bào gốc từ nhiều loại tế bào khác nhau, từ phôi, thai, từ tế bào máu, từ tế bào âm đạo, gần từ tế bào da người trưởng thành Và từ tế bào gốc, nhà khoa học nghiên cứu thành công việc chuyển hoá chúng thành loại tế bào, loại mô, khác 11 thể tế bào thần kinh, tế bào máu, tim, giác mạc mắt v.v… Với tế bào gốc từ cuống dây rốn, người chữa vài bệnh liệt, tuỷ sống, bỏng… Công nghệ tế bào công nghệ protein – enzim 3.1 Cơ sở khoa học công nghệ protein – enzim - Dựa vào tính chất kết tủa, hòa tan protein VD: Môi trường (NH4)2SO4 bán bão hòa globulin kết tủa + Các protein khác kết tủa pH khác + Protein kết tủa điểm đẳng điện khác - Dựa vào tích điện protein khác  tốc độ chạy điện điện di khác - Dựa vào tốc độ chạy qua cột sắc ký khác protein khác 3.2 Quy trình - Tách protein tổng số từ tế bào + Phá hủy màng tế bào + Tách protein tổng số từ hỗn hợp hóa chất từ hợp chất hữu tế bào sử dụng tác nhân kết tủa chung + Tách protein kết tủa phương pháp lọc - Tách riêng loại protein cần + Sử dụng tác nhân kết tủa riêng biệt + Tách riêng protein phương pháp lọc Vai trò công nghệ tế bào công nghệ protein – enzim thể giai đoạn tách protein tổng số từ tế bào  Phá vỡ tế bào Protein enzim có tất thể động vật, thực vật vi sinh vật Sau tổng hợp tiết tế bào tồn môi trường dịch thể, dịch môi trường (gọi protein enzim ngoại bào) giữ lại bên tế bào (protein enzim nội bào) Các protein enzim nội bào tồn dạng hòa tan tế bào chất bào quan nhân tế bào Do để chiết rút protein enzim nội bào phải phá vỡ cấu trúc tế bào chứa chúng chuyển vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học như: nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị nghiền đồng thể Để việc phá vỡ có hiệu quả, mô thực vật trước nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá cho trương nước Còn mô động vật gan thận, chiết protein enzim người ta cần cắt bỏ mô liên kết 12 Muốn tách protein quan tử, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác như: sóng siêu âm, dùng dung môi hữu butanol, aceton, glycerin, ethylacetat,…  Chiết rút protein Sau phá vỡ cấu trúc tế bào tiến hành chiết xuất protein enzim dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính nước protein enzim nội bào ly tâm tách tế bào protein enzim ngoại bào Việc chọn phương pháp tách chiết protein enzim tùy thuộc vào tính chất protein enzim cần nghiên cứu 3.3 Thành tựu Protein enzim ứng dụng công nghiệp thực phẩm sản xuất bia - Amylase dùng sản xuất đường mật ngô chocolate, sản xuất bia, chế biến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già trẻ em, sản xuất nước y học - Protease thủy phân protein sữa để chế biến ăn kiêng đặc biệt, dùng thuộc da, sản xuất bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len y học Protease vi sinh vật sử dụng với amylase chế biến thức ăn gia súc - Pectinase nhóm enzyme thủy phân pectin tạo thành galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, methanol… - Cytolase hệ enzyme có hoạt tính cao phân hủy hemicellulose, pentozan, lignin… Các enzyme gọi chung cytolase (bao gồm cellulase, hemicelllulase, pentosinase) - Invertase enzyme nội bào dùng rộng rãi sản xuất bánh kẹo, rượu mùi, kem, mật ong nhân tạo Nó làm tăng vị thủy phân đường saccharose thành fructose glucose, làm tăng độ hòa tan saccharose sản phẩm Trong tương lai gần, enzyme sử dụng rộng rãi y học để làm đầu dò (probe) cho thiết bị phân tích y khoa để chữa bệnh Hiện nay, số enzyme như: glucooxydase, hexokinase, esterase, urease, cholesteroloxydase, alcoholdehydrogenase… sử dụng phổ biến y học Điển hình sử dụng glucooxydase cố định bề mặt điện cực platinum thiết bị phân tích hàm lượng glucose máu Trong y học, enzyme sử dụng để chữa trị số bệnh liên quan đến thiếu hụt số enzyme thể người, dùng enzyme để loại bỏ cục thịt, mỡ dư thừa gây nguy hiểm cho số phận thể người Chẳng hạn: dùng enzyme streptokinase urokinase để làm tan máu đông làm tắc nghẽn mạch máu 13 [...]... pháp lọc Vai trò của công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim thể hiện ở giai đoạn tách protein tổng số từ tế bào  Phá vỡ tế bào Protein enzim có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong môi trường các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzim ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein... người ta lấy tế bào gốc của chính người đó để chuyển hoá thành tế bào cơ tim và nuôi dưỡng chúng thành các cơ tim rồi làm các thủ thuật thay thế Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã tạo ra được tế bào gốc từ nhiều loại tế bào khác nhau, từ phôi, thai, từ tế bào máu, từ tế bào âm đạo, và gần đây là từ tế bào da của người trưởng thành Và từ tế bào gốc, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu thành công việc... đã nghiên cứu thành công việc chuyển hoá chúng thành các loại tế bào, các loại mô, cơ khác nhau 11 của cơ thể như tế bào thần kinh, tế bào máu, cơ tim, giác mạc mắt v.v… Với tế bào gốc từ cuống dây rốn, người ra đã có thể chữa được một vài bệnh liệt, tuỷ sống, bỏng… 3 Công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim 3.1 Cơ sở khoa học công nghệ protein – enzim - Dựa vào tính chất kết tủa, hòa tan của... Tách chiết thành phần mong muốn từ tế bào - Tạo chế phẩm b Thành tựu 2.2.3 Nhân bản vô tính động vật 2.2.4 Công nghệ tế bào gốc, tế bào mầm Tế bào gốc là loại tế bào chuyên biệt hoá, có nhiều tiềm năng – có thể biến thành nhiều loại tế bào khác Phân biệt tế bào gốc phôi, từ thai và từ cơ thể trưởng thành Thường ở giai đoạn phôi thì nó có nhiều Những thành tựu khoa học mới đây nhất đã cho thấy, từ cơ... ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzim nội bào) Các protein enzim nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan nhân của tế bào Do đó để chiết rút các protein enzim nội bào phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào chứa chúng và chuyển vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng... trưởng thành chúng ta đã có thể tách thành các tế bào gốc và từ đó có thể chuyển hoá thành nhiều loại tế bào khác Cụ thể, là từ tế bào da của người trưởng thành chuyển hoá thành các tế bào gốc, thông qua phương pháp chuyển-mở một số gen trong nhân tế bào, và làm cho chúng trở thành dạng sơ khai, dạng gốc ban đầu Việc này đưa lại nhiều triển vọng rất lớn trong trị liệu, ví như khi cơ thể của một ai đó...men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương... enzim ngoại bào Việc chọn phương pháp tách chiết protein enzim tùy thuộc vào tính chất protein enzim cần nghiên cứu 3.3 Thành tựu Protein enzim được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia - Amylase dùng trong sản xuất đường mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, chế biến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ em, trong sản xuất nước quả và trong y học - Protease... protein trong các cơ quan tử, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như: sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethylacetat,…  Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất protein enzim bằng các dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzim nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào. .. điện khác nhau - Dựa vào sự tích điện của các protein khác nhau  tốc độ chạy điện trong điện di khác nhau - Dựa vào tốc độ chạy qua cột sắc ký khác nhau của các protein khác nhau 3.2 Quy trình - Tách protein tổng số từ tế bào + Phá hủy màng tế bào + Tách protein tổng số từ hỗn hợp các hóa chất từ hợp chất hữu cơ của tế bào sử dụng tác nhân kết tủa chung + Tách protein kết tủa bằng phương pháp lọc - ... Công nghệ tế bào bao gồm: - Công nghệ tế bào thực vật - Công nghệ tế bào động vật - Công nghệ tế bào vi sinh vật III VAI TRÒ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Công nghệ tế bào công nghệ gen... định tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh 1.3 Vai trò công nghệ tế bào công nghệ gen Tùy vào đối tượng nhận gen tế bào thực vật, tế bào động vật hay vi sinh vật mà vai trò công nghệ tế bào thể... Công nghệ tế bào 2.1 Công nghệ tế bào thực vật 2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào a Cơ sở khoa học - Dựa vào tính toàn tế bào thực vật - Khả phân hóa phản phân hóa tế bào thực vật - Sự sinh trưởng tế bào