Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học

Đầu những năm 1980, đã bắt đầu hình thành công nghệ sinh học hiện đại là lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các tế bào đã được biến đổi di truyền.. Có hai cách định nghĩ

Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học

I KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Có nhiều định nghĩa và cách diễn đạt khác nhau về công nghệ sinh học tùy theo từng tác giả, nhưng tất cả đều thống nhất về khái niệm cơ bản sau đây: Công nghệ sinh học là quá trình sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ

Đầu những năm 1980, đã bắt đầu hình thành công nghệ sinh học hiện đại là lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các tế bào đã được biến đổi di truyền Công nghệ sinh học hiện đại ra đời cùng với sự xuất hiện kỹ thuật gen Cơ sở sinh học được áp dụng ở đây bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học,

di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, cùng các nguyên lý kỹ thuật máy tính

Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học một cách tổng quát nhất:

- Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng

- Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của gen đó

Sự khác biệt rõ rệt nhất của hai định nghĩa trên thuộc về đối tượng tác động của công nghệ sinh học: UNESCO xem cơ quan, bộ phận, tế bào và chức năng riêng rẽ của sinh vật là đối tượng, trong khi đó Trường Luật Stanford lại coi gen là đối tượng tác động của công nghệ Từ các định nghĩa trên, có thể phân biệt được hai nhóm công nghệ sinh học là:

1 Công nghệ sinh học truyền thống (traditional biotechnology)

Bao gồm:

+ Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional fermentations)

+ Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation technology)

+ Sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu vi sinh vật (production of microbial fertilizer and pesticide)

+ Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass production)

+ Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật (plant micropropagation)

+ Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization)

2 Công nghệ sinh học hiện đại (modern biotechnology)

Bao gồm:

+ Nghiên cứu genome (genomics)

+ Nghiên cứu proteome (proteomics)

+ Thực vật và động vật chuyển gen (transgenic animal and plant)

+ Động vật nhân bản (animal cloning)

1

+ Chip DNA (DNA chip)

+ Liệu pháp tế bào và gen (gene and cell therapy)

+ Protein biệt dược (therapeutic protein)

+ Tin sinh học (bioinformatics)

+ Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology)

+ Hoạt chất sinh học (bioactive compounds)

II KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Công nghệ tế bào là một bộ phận quan trọng của công nghệ sinh học, chủ yếu nghiên cứu các quá trình nuôi cấy tế bào động - thực vật và vi sinh vật để sản xuất sinh khối, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vaccine, các chất thứ cấp…)

Mặc dù, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào chỉ được phát triển vào nửa đầu thế kỷ 20, nhưng đến nay các ứng dụng của chúng đã có những bước tiến vượt bậc nhờ sự đóng góp của công nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ tế bào bao gồm:

- Công nghệ tế bào thực vật

- Công nghệ tế bào động vật

- Công nghệ tế bào vi sinh vật

III VAI TRÒ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1 Công nghệ tế bào trong công nghệ gen

1.1 Cơ sở khoa học của công nghệ gen

 Dựa vào đặc điểm hoạt động của gen

- Gen mã hóa protein theo mã bộ ba  biểu hiện tính trạng

+ Thay đổi gen  thay đổi tính trạng

+ Sử dụng gen để biểu hiện  sản xuất các chế phẩm

- Gen là một đoạn của ADN

+ Có thể cắt rời nhờ enzim cắt liêt kết phosphodiester (RE)

+ Gen là một thực thể có thể hoạt động độc lập

+ Có khả năng di chuyển vào tế bào lạ nhờ công cụ

- Hoạt động của gen

+ Gen chuyển vào tế bào lạ  gen biểu hiện được và hệ gen tế bào lạ không bị ảnh hưởng

 Dựa vào tính toàn năng của tế bào

Một tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với một cơ thể trưởng thành, để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

1.3 Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ gen

Tùy vào đối tượng nhận gen là tế bào thực vật, tế bào động vật hay vi sinh vật

mà vai trò của công nghệ tế bào thể hiện khác nhau

Trong công nghệ gen vai trò của công nghệ tế bào thể hiện ở khâu nuôi cấy tế bào

1.3.1 Nuôi cấy tế bào thực vật

Sau khi thực hiện các bước của quá trình chuyển gen: xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm; phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc

từ thư viện genomic DNA); gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến

nạp; biến nạp vào E coli; tách chiết DNA plasmid; thì biến nạp vào mô hoặc tế bào

thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, ở đây tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên trong tế bào Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo nên Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây hoàn chỉnh Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen

Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện nay

có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA vào trong tế bào Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể đưa các phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp Phương pháp này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng cho

tế bào thực vật Phương pháp thứ hai là bắn vào tế bào các vi đạn (microprojectile), thường bằng vàng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA Phương pháp này được gọi

là phi sinh học và được sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau

Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại

cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt

1.3.2 Nuôi cấy tế bào động vật

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy

3

truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen

Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst) Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con

Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta

có thể tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột

Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không

Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Northern blot ) hoặc PCR

Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên

mã và dịch mã Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật

Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ) để xác định gen lạ có

di truyền hay không

Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo

và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen

1.3.3 Nuôi cấy tế bào vi sinh vật

Sự sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo được gọi là nuôi cấy (cultivation) Một kiểu nuôi cấy chỉ chứa một loại vi sinh vật được gọi là nuôi cấy thuần khiết (pure culture) Nuôi cấy hỗn hợp (mixed culture) là một loại nuôi cấy chứa nhiều hơn một loại vi sinh vật

Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật như sau:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho phép vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt nhất

- Khử trùng môi trường để loại bỏ tất cả các cơ thể sống có trong bình nuôi cấy

- Cấy vi sinh vật vào trong môi trường đã chuẩn bị

Hình 2: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

Để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nuôi cấy phải được chuẩn bị trong những loại bình nuôi được sử dụng phổ biến nhất, chẳng hạn ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri hoặc nồi lên men Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: môi trường tự nhiên (dựa trên kinh nghiệm) và môi trường tổng hợp (thành phần hóa học xác định) Nói chung, các môi trường dinh dưỡng rất khác nhau về hình thái (dạng rắn hoặc lỏng) và thành phần, tùy thuộc vào loại vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy

Môi trường sau đó phải được khử trùng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống trong bình chứa môi trường Phương pháp khử trùng phổ biến nhất là khử trùng bằng hơi nước dưới áp suất cao trong nồi khử trùng (autoclave)

Tiếp mẫu (vi sinh vật) vào bình chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng Sự tiếp mẫu khi nuôi cấy trên môi trường rắn có agar được thực hiện bằng que cấy có vòng kim loại ở đầu (metal wire hoặc loop) được khử trùng nhanh trước khi sử dụng bằng cách đốt nóng trên đèn cồn

Cấy chuyển trong nuôi cấy lỏng thường được thực hiện bằng Pasteur pipette

Sự tiếp mẫu thường được tiến hành trong tủ cấy vô trùng (laminar flow cabinet) để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn

Ví dụ: Người ta đã chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin của người

sang cho E coli Vi khuẩn E coli tái tổ hợp gen được nuôi cấy trong nồi lên men có

dung tích 1.000 L, sau một thời gian ngắn có thể thu được 200g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 con bò

2 Công nghệ tế bào

2.1 Công nghệ tế bào thực vật

2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào

a Cơ sở khoa học

- Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật

- Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật

- Sự sinh trưởng của tế bào thực vật

- Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng

b Quy trình

5

Mẫu vật

Nuôi cấy ban đầu (Tạo callus) Khử trùng

Tạo hạt nhân tạo

Tạo rễ

Tạo phôi

Tạo cây Tạo chồi

 Chuẩn bị mẫu vật

- Chọn mẫu vật có khả năng nuôi cấy tốt

- Thu hái mẫu vật

- Khử trùng sơ bộ: bằng cồn 700C

- Khử trùng tuyệt đối: HgCl2 0,1%

 Chuẩn bị môi trường

Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng của các loại mô nuôi cấy là rất khác nhau nhưng môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các thành phần sau:

- Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium,

phosphorus, magnesium và sulfur Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao

- Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron,

copper, molybdenum và cobalt ở dạng vết

- Các phụ gia hữu cơ: Một lượng nhỏ các loại vitamin (myo-inositol, thiamine,

nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), các amino acid (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng), và các phụ gia hữu cơ không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…)

- Các chất kích thích sinh trưởng thực vật: Thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết

định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinhtrưởng Các auxin (IAA2 và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…), và các cytokinin (zeatin, 2i-P7 và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như kinetin, BA8…) là những nhóm chất kích thích sinh trưởng và phát sinh hình thái chủ yếu trong nuôi cấy mô và cơ quan của thực vật

- Nguồn carbon: Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon

được thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp Trong đa số các thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật đã mất khả năng quang hợp Glucose cũng thường được đưa vào môi trường và cho hiệu quả tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu quả kém hơn

- Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường: Thường sử dụng là agar, một loại

polysaccharide thu được từ một số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta) Một số hợp chất khác cũng được thử nghiệm thành công như alginate, phytagel, methacel và gel-rite

 Nuôi cấy ban đầu

Môi trường MS + 30g/l agar + 30g/l saccharose + 1-3 ppm 2,4 D

 Thực hiện quá trình phản phân hóa tạo callus

 Nhân nhanh callus

Môi trường MS + 1-2ppm 2,4 D + 1-2 ppm BAP  Tăng số lượng callus

 Tạo phôi

Môi trường MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 5ppm 2,4 D; 2ppm BA; 1-2ppm NAA;  Tạo phôi để nuôi cấy thành cây

 Sản xuất hạt nhân tạo

 Tạo chồi

Môi trường MS + Kinetin + BAP + Zeatin (1-3ppm)  Tạo chồi từ callus

 Tạo rễ

- Môi trường MS + NAA, TAA, PAA (1-3 ppm)

- Rễ tạo ra từ callus

 Nuôi cấy tạo cây con

Nuôi cấy tiếp trong môi trường tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh

 Đưa ra vườn ươm

c Thành tựu

Tạo ra hàng loạt bản sao của một cây ưu việt hay là nhân nhanh cây trồng quy

mô công nghiệp Đây là nền tảng của công nghệ vi nhân giống

Ví du: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, mía đường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa, anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả, cẩm chướng, cúc,Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, …

Một số cây đang được tái sinh trong phòng thí nghiệm: cây bơ, ca cao, cà phê, Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngô, đậu, củ từ, đậu nành, (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987)

Trong cải tạo giống nhiều khi tạo ra được giống có năng suất cao và chống chịu giỏi nhưng lại không có hạt hoặc rất ít hạt để có thể gieo trồng lại Bằng phương pháp nói trên, người ta có thể sản xuất hạt nhân tạo bằng các tế bào bình thường của cây này với một lượng lớn Trên thị trường thế giới có bán nhiều hạt nhân tạo với các tính

ưu việt nói trên, trong đó có hạt lúa mì, hạt lúa, táo,…

2.1.2 Công nghệ tế bào trần

a Cơ sở khoa học

- Tế bào thực vật có màng cellulose

- Các cơ sở của công nghệ nuôi cấy mô tế bào

- Dựa vào đặc điểm lai tế bào soma

7

+ Nhân lai + tế bào chất lai  cây lai

+ Nhân lai + tế bào chất không lai

+ Nhân không lai + Tế bào chất lai

+ Nhân không lai + tế bào chất không lai

b Quy trình

 Tạo mẫu vật

- Chọn nguyên liệu

Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt

Vì lá cây là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, dễ phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất

Lấy lá từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ Cũng có thể tách

tế bào trần từ mô sẹo, bao phấn

- Xử lý sơ bộ: Các tế bào được ngâm trong dung dịch là ổn định áp suất thẩm thấu Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12 – 14% để duy trì tính ổn định của màng sinh chất

 Xử lý enzim thủy phân tạo tế bào trần

Dùng enzim pectinase, hemicellulase, cellulase để phá vỡ thành tế bào Có thể dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tùy vào từng loại tế bào

 Tách tế bào trần

- Xác định xem còn thành tế bào hay không: Dùng calcofour để xác định Calcofour bám vào các phân tử cellulose và phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi thường

có màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của lạp thể

- Xác định khả năng sống sót của tế bào trần: tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống Ngược lại những tế bào chết

- Xác định sức sống của tế bào trần: Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10ml môi trường tách tế bào trần Lấy 0,25ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được

 Nuôi cấy trong môi trường đẳng trương

c Thành tựu

Công nghệ tế bào trần có vai trò quan trọng trong tạo giống mới

Ngày nay người ta đang sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo ra những cây lai mới Chẳng hạn, lai khoai tây trồng và khoai tây hoang dại Gene cây hoang

dại giúp cây trồng chống bệnh virus Người ta lai cây cà chua với cây khoai tây (họ hàng chúng xa nhau) cho cây lai mang quả cà chua và củ khoai tây

Bằng cách này, người ta tạo ra cây lai giữa cà rốt và rau mùi, cam và chanh, … Đối với cọ dầu, từ protoplast và sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene có thể nâng cao hiệu quả, chọn lọc các dòng có dầu có năng suất cao Đối với mía, dung hợp protoplast có ý nghĩa lớn đối với việc phổ biến các giống mía không ra hoa (trốn cờ) hoặc bất thụ Các kết quả nghiên cứu của CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) và CEBTEC (Divis.o de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) ở Brazil cho thấy, dung hợp protoplast cây mía có thể giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dòng mía này qua dòng mía khác

Dung hợp protoplast có thể chọn giúp các dòng cà phê kháng bệnh và các độc

tố do nấm tiết ra để đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn ra các dòng tế bào kháng độc tố cho cà phê Năm 1987, ở Costa Rica cũng đã tái sinh cây cà phê từ protoplast được tách từ phôi vô tính hình thành từ huyền phù tế bào callus lá Sau khi nuôi cấy protoplast vài lần trên môi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D 0,5 mg/l NAA, các tác giả thu được callus nhỏ Khi cấy chuyền sang môi trường không có chất sinh trưởng các callus phát triển thành phôi và phát triển thành cây hoàn chỉnh Người

ta cũng dung hợp protoplast cao su từ các tế bào phôi vô tính Đến nay đã có hơn 70 loài cây cũng được sinh ra từ protoplast

Khi dung hợp protoplast, người ta còn tạo ra được giống lai giữa tế bào thực vật và vi khuẩn Sự dung hợp protoplast giữa tế bào tảo lam (vừa,có đặc tính quang hợp vừa có đặc tính cố định N2 trong không khí) với callus thực vật làm kích thích sự phát triển của chúng

Cũng với kĩ thuật trên, người ta có thể dung hợp được các tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt phấn) để tạo ra cây lai giữa các họ với nhau

Tóm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast hiện tại đang mở ra một khả năng rộng lớn trong việc tạo ta những giống có thể tập hợp được nhiều đặc tính tốt từ các cây khác nhau

Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast, nó trở thành công cụ nghiên cứu các quá trình sinh hóa, đặc biệt là acid nucleic và protein trong tế bào, dùng mô hình nghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào, nghiên cứu quá trình cộng sinh vi khuẩn trong cây bộ Đậu, nghiên cứu các enzyme, nghiên cứu cơ chế của quá trình quang hợp v.v làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng phục vụ cho đời sống của con người

2.2 Công nghệ tế bào động vật

2.2.1 Chuyển phôi tạo giống vật nuôi

a Cơ sở khoa học

- Dựa vào đặc điểm sinh sản của động vật

9

+ Động dục

+ Quá trình thụ tinh

+ Quá trình nuôi thai

- Dựa vào quá trình phát triển phôi động vật

+ Các giai đoạn phát triển

+ Môi trường phát triển

- Đặc điểm của tế bào động vật

b Quy trình

- Xử lý con cái cho phôi

+ Thực hiện quá trình thụ tinh

+ Cung cấp phôi

- Xử lý phôi

+ Tách phôi

+ Chuyển gen

- Xử lý con vật cái mang phôi

c Thành tựu

Phương pháp chuyển phôi được sử dụng để tăng khả năng sinh sản của động vật cái Hiện nay đây là phương pháp phổ biến được sử dụng trong thực tiễn chọn giống gia súc (trâu, bò, cừu, lợn, dê, ) ở nhiều nước trên thế giới

2.2.2 Nuôi cấy tế bào động vật

a Quy trình

 Chọn tế bào nuôi cấy

- Dựa vào mục đích để chọn tế bào nuôi cấy

- Chọn tế bào có độ tuổi thích hợp (thường là tế bào ở độ tuổi còn non)

 Chuẩn bị môi trường

Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương của động vật có vú Môi trường Eagle (Eagle 1959), đây là một trong những môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào động vật (Hình10)

 Nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy trong bể nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp chính trong nuôi cấy

tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm

10