Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị

Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TẠ THỊ NGỌC HOAN

ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG ĐIỂU TRỊ

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001- 2006)

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn RưNơi thực hiện; Bộ môn Hoá sinh

Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 1/2006- 5/2006

Hà nội, tháng 5 năm 2006

LỜI CẢM ƠN

Đ ể CÓ kết quả báo cáo ngày hôm nay, tôi xỉn được bày tỏ lònẹ biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn R ư - Bộ môn Hoá sinh - Đại học Dược Hà Nội, là người thầy trực tiếp dìu dắt, tận tình hướnĩĩ dẫn tồi hoàn thảnh luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong các hộ môn, đặc hiệt là

các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi, truyền thụ cho tôi nhữn^ kiến thức vồ CÌUĨÍỊ quý háu tron^

suốt quá trình học tập và làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể T hư viện- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trono quá trình tìm tài liệu và các phươnĩ’ tiện

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT ứ c CHẾ PROTEASE 2

1.1 Chất ức chế enzym (Enzym inhibitor- EI) 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Phân loại chất ức chế enzym 3

1.2 Protease 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Phân loại protease 6

1.2.3 Đặc điểm một số protease có nguồn gốc động vật 7

1.2.4 Đặc điểm của một số protease có nguồn gốc thực vật 10

1.2.5 Ví dụ về protease có nguồn gốc vi sinh vật 11

1.2.6 Một số ứng dụng của protease trong thực tiễn 12

1.3 Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI) 13

1.3.1 Khái niệm 13

1.3.2 Phân loại chất ức chế protease 13

1.3.3 Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease 15

1.3.4 Cơ chế tác động của chất ức chế protease 16

1.3.5 Một số ứng dụng của chất ức chế protease 18

2 SỬDỤNG CHẤT ứ c CHẾ PROTEASE TRONG ĐlÊU TRỊ 19

2.1 Chất ức chế protease ứng dụng trong điều trị virus 19

2.1.1 Vài nét về virus và thuốc điều trị 19

2.1.2 HIV/AIDS và thuốc điều trị hiện nay 21

2.1.3 Protease inhibitor sử dụng trong điều trị H IV /A IDS 25

2.1.4 PI trong điều trị nhiễm một số virus khác 32

2.2 Chất ức chế protease trong điều trị kí sinh trùng 33

2.2.1 Bệnh sốt rét 33

2.2.2 Bệnh Chagas (Chagas’disease) 36

2.3 Sử dụng chất ức chế protease trong điều trị ung thư 37

2.3.1 Bệnh ung thư và thuốc điều trị 37

2.3.2 Mối liên quan giữa PI và bệnh ung thư 39

2.3.3 Cơ chế tác dụng chống ung thư của các PI 40

2.3.4 Một số PI sử dụng trong điều trị ung thư 42

2.4 Chất ức chế protease với quá trình đông máu- chảy m áu 44

2.4.1 Những chất ức chế protease sinh lý 44

2.4.2 Bệnh thiếu alpha 2-antiplasmin di truyền (Miyasato) 46

2.4.3.Chất ức chế protease điều trị xuất huyết 47

2.5 Sử dụng chất ức chế protease trong chống viêm 51

3 NHẬN ĐỊNH TỔNG QUÁT VÀ BÀN LUẬN 53

3.1 Về cơ chế tác dụng của chất ức chế protease 53

3.2 Về những lưu ý khi sử dụng PI trong điều trị 55

3.3 Về tác dụng không mong muốn khi sử dụng PI 55

3.4 Lợi ích của việc sử dụng PI trong điều trị 56

3.5 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu PI 56

3.6 Nguồn gốc của chất ức chế protease 57

3.7 Phương hướng nghiên cứu và ứng dụng PI trong điều trị 57

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Đề xuất 60

Phụ lục

Tài liệu tham khảo

PI đã được tăng cường tác dụng (PI with boost) Chất ức chế enzym (Enzym inhibitor)

Cục quản lý Dược và Thực phẩm Mỹ (the US Food and Drug Administration)Virus gây đại dịch cúm ở gia cầm và người Liệu pháp kháng retrovirus cực mạnh (Highly Active Anti Retrovirus Therapy)Virus viêm gan c (Hepatitis c virus)Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch (Human Immunodeficiency Virus)

Protease của HIVEslastase bạch cầu tmng tính của người (Human Neutrophil Eslatase)

Ký sinh trùng sốt rét Kunitz trypsin inhibitor Lopinavir

Matrix metalloproteaseChất ức chế protease (Protease inhibitor)Enzym sao chép ngược (Reverse transcriptase)

Trung tâm hoạt động Trung tâm phản ứng

PI không được tăng cường tác dụng (PI without boost) Urinary trypsin inhibitor

ĐẶT VÂN ĐỂ

Đến cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21, nền khoa học công nghệ của thế giói phát triển rất mạnh mẽ, giao lưu quốc tế được tăng cường trong mọi lĩnh vực, đời sống con người được nâng cao Công tác y tế, khám chữa bệnh cũng đạt được bước tiến vưọft bậc, nghiên CÚII thành công nhữrm phác đồ điều trị có hiệu CỊLUỈ, đẩy lùi được nhiều dịch bệnh Song bên cạnh đó, mô hình bệnh tật trên thế giới lại trở nên phức tạp hơn với nhiều loại bệnh mới khó chữa trị, có khả năng lan tràn nhanh, ảnh hưỏfng đến nhiều mặt của xã hội, đe dọa tới sự tồn vong của nhân loại như HIV, cúm H5N1,SARS,

Để đảm bảo cho sự phát triển bền vững của toàn cầu, công tác y tế và chăm sóc sức khoẻ là vấn đề hết sức quan trọng Đặc biệt là việc không ngừng nghiên cún tìm

ra các loại thuốc có khả năng điều trị cao, thanh toán được nhiều dịch bệnh, có hiệu quả trong điều trị một số bệnh nan y như HIV, ung thư Nghiên cứu về các hợp chất

có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào sinh vật- chất ức chế protease là một trong những hướng nghiên cún đã và đang thu được nhiều thành tụii to lón đáp ứng được mong muốn như trên Năm 1996, ứng dụng các chất ức chế protease trong điều trị HIV đã giảm tỷ lệ tử vong và kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân Những thành công này đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giói không ngừng tìm hiểu, thử nghiệm PI trong điều trị và ngày càng thu được kết quả khả quan, hứa hẹn cho ra đời các loại thuốc mới trong điều trị ung thư, chống viêm, vi sinh vạt gây bệnh

Tại Việt Nam, chất ức chế protease gần đây mới được chú ý Những nghiên cứu ứng dụng PI trong điều trị mới bắt đầu Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Tổng quan

về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị” nhằm:

- Thu thập các thông tin, căn cứ đã được nghiên cứu về nguồn gốc, cấu trúc, các tính chất cơ bản và cơ chế tác dụng của chất ức chế protease đã ứng dụng trong điều trị một số bệnh cụ thể

- Phân tích, làm rõ vai trò của PI trong điều trị các bệnh này Từ đó đề xuất một số uiải pháp nghiên cứu và ứng dụng các PI ở Việt Nam

1 ĐẠI CƯƠNG VỂ CHẤT ức CHÊ PROTEASE

Chất ức chế protease là những chất có khả năng ức chế đặc hiệu enzym protease

1.1 C h ất ức chê enzym (Enzym inhibitor- EI)

1.1.1 Khái niệm

Trước đây, chất ức chế enzym ít được quan tâm chú ý, hầu như nó chỉ là một phần nhỏ trong việc nghiên cứu động học enzym Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy có rất nhiều quá trình liên quan đến sự ức chế hoạt động của enzym, đặc biệt là những vấn đề trong nhiễm độc tế bào Chính vì vậy, EI đã thu hút được nhiều nhà khoa học tham gia nghiên cứu về nó Từ đó, chất ức chế enzym trở thành một phần riêng biệt liên quan đến nhiều ngành khác, đặc biệt

mô tả bằng phản ứng cân bằng giữa enzym và chất ức chế, thông qua hằng số cân bằng của phản ứng thể hiện sự thuận nghịch của ái lực giữa enzym và chất

ức chế Loại ức chế này thể hiện mức độ phụ thuộc của chất ức chế vào trung tâm ức chế, không phụ thuộc vào thời gian và đạt đến một sự ức chế bền vững.Ngược lại, ức chế không thuận nghịch không có chiều hướnơ cân bằng và không có sự tác động trở lại trong máu (tất cả những cố gắng loại bỏ nhóm ức chế bằng cách này hay cách khác đều không thành công), được mô tả bằng sự

tiến triển theo thời gian, cuối cùng là sự ức chế hoàn toàn ngay cả khi nồng độ chất ức chế rất loãng Tác dụng của chất ức chế không được thể hiện bằng hằng số cân bằng mà thông qua vận tốc cân bằng[44],

1.1.2 Phản loại chất ức c h ế enzym

"^Dựa vào cơ chếtcic dụng của chcít ức c h ế

- ưc ch ế cạnh tranh (Competitive inhibitors)

Chất ức chế cạnh tranh là những chất kết hợp với enzym ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất Thông thường, chất ức chế cạnh tranh là những chất tương tự không chuyển hoá được hoặc là dẫn chất của cơ chất Chất ức chế có cấu trúc giống như cơ chất nên nó có thể kết hợp với enzym ở vị trí trung tâm hoạt động của enzym làm cho cơ chất không thể gắn vào trung tâm hoạt động được Do vậy, sẽ làm cho tốc độ xúc tác của enzym giảm đi

Ví dụ: Leupeptin ức chế cạnh tranh với serin

Trong một số trưòỉng hợp, chất ức chế được sản sinh ra không liên quan đến cấu trúc của cơ chất, thưcmg là sản phẩm cuối hay gần cuối của quá trình chuyển hoá tác động lên một men hay một phản ứng nhánh của quá trình chuyển hoá Hiện tượng này gọi là ức chế ngược “feedback” Chất kìm hãm

“hiệu ứng” hay điều hoà kết hợp với enzym ở một vị trí có thể khác so với vị trí xúc tác của cơ chế gây ra sự thay đổi hình dạng enzym như cấu trúc bậc 3 hay bậc 4 dẫn đến làm giảm ái lực đối vói cơ chất Dựa trên những nghiên CÚII

về động học enzym, chúng ta thấy được rằng tốc độ và mức kìm hãm của phản ứng xúc tác bằng enzym trong sự có mặt của chất ức chế cạnh tranh phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, chất ức chế; liên quan đến ái lực của cơ chất(S) và chất kìm hãm đối với enzym(E) Trong sự có mặt của chất kìm hãm(I), tốc độ lớn nhất của phản ứng không thay đổi khi nồng độ cơ chất rất cao yêu cầu cần đạt đến tốc độ của phản ứng

Quá trình ức chế cạnh tranh có thể được biểu diễn như sau:

- ức ch ế không cạnh tranh (Non- competitive inhibitors)

Úc chế không cạnh tranh là sự ức chế thể hiện qua sự liên kết chất ức chế với enzym tự do hay phức họfp enzym và cơ chất Thông thường, chất ức chế không cạnh tranh thường kết hợp với enzym ngoài vị trí xúc tác của trung tâm hoạt động, mức độ kìm hãm không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng của enzym ở bất kì nồng độ cơ chất nào trong sự có mặt của chất ức chế tỷ lệ với nồng độ của enzym mà nó không gắn với chất ức chế, mức độ kìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế và Ki (hằng số cân bằng của chất ức chế và enzym)[4

Quá trình ức chế kliông cạnh tranh được biểu diễn như sau:

- Loại kết hợp của hai ức chê': một ức chế có thể tác động trên cả vận tốc,

và hằng số cân bằng, là sự kết hợp của cả tác động cạnh tranh và không cạnhtranh [44

* Dưa vào nhóm E hi ức ch ế

- Chất ức ch ế enzym thuỷ phân (Hydrolase inhibitor): như chất ức chế

protease, chất ức chế glycosidase,

- Chất ức c h ế enzym vận chuyển nhóm (Transferase inhibitor).

- Chất ức ch ếem ym oxy hoá khử (Oxydoreductase inhibitor).

- Chất ức chếem ym phân cắt (Lyase inhibitor).

- Chổít ức c h ế enzym đồn^phán (Isomerase inhibitor).

- Chất ức c h ế enzym tổn^ hợp (Ligase inhibitor).

* Dưa vào nsuồn sốc của chất ức chế:

Nẹầy nay, những chất ức chế enzym đang được phát triển rộng rãi Các

nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm ra những ưu việt và hạn chế của nó

để ứng dụng vào thực tế Trong đó, chất ức chế protease cũng giành được nhiều sự quan tâm đặc biệt trong lĩnh VỊĨC y học

1.2.2 Phân loại protease

a Dựa vào nhóm hoá học tham gia vào quá trình xúc tác có thể chia protease thành 4 loại sau[9]:

- Protease serin: như trypsin, Chymotrypsin,

- Protease cystein; như papain, bromelain,

- Protease aspartic: như pepsin, renin,

- Protease chứa kim loại(Metalloprotease): như carboxypeptidase,

c Dựa vào PH tối lai, người ta chia protease thành 3 loại:

- Protease trung tính: như papain, bromelain, ficin,

- Protease acid: như pepsin, renin,

- Protease kiềm: như trypsin,

d Dựa vào vị trí tác dụng đặc hiệu vói cơ chất, protease cũng có thể được chia thành hai loại:

- Endopeptidase; enzym thuỷ phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid

- Exopeptidase: enzym phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid

e Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia protease thành 2 nhóm;

- Protease nội bào (enzym ở trong tế bào) như cathepsin chứa trong bào quan (lysosom)

- Protease nsoại bào (enzym được xuất tiết khỏi tế bào vào môi trườim xung quanh) như các enzym của đưcmg tiêu hoá (pepsin, trypsin, )[11]

1.2.3 Đặc điểm m ột sô protease có nguồn gốc động vật

Protease nguồn gốc từ động vật bao gồm: nhóm protease serin như trypsin, Chymotrypsin; nhóm protease aspartic như pepsin, renin; nhóm protease chứa kim loại như carboxypeptidase, aminopeptidase Protease độns vật có cả hai loại endopeptidase và exopeptidase[l 1], Sau đây là một số ví dụ:

a Nhóm serin protease

Nhóm này gồm hai loại khác nhau là[55]:

-Nhóm Chymotrypsin; gồm các enzym của loài động vật có vú như Chymotrypsin, trypsin, elastase, hoặc kallikrein

- Nhóm substilisin: gồm các enzym của vi khuẩn như subtilisin

Tuy cấu trúc không gian khác nhau nhưng cả hai nhóm này đều có vị trí hoạt động hình học và xúc tác theo cơ chế giống nhau Những serin protease biểu lộ sự đặc hiệu cơ chất khác nhau, được liên hệ với sự thay thế acid amin trong vị trí thay thế nhiều enzym, tương tác với những đoạn cơ chất Một vài enzym có vị trí tương tác kéo dài, ngược lại cũng có những enzym khác có một sự đặc hiệu giới hạn tới P1 đoạn cơ chất

Ba đoạn trong cấu trúc xúc tác bộ ba là cần thiết trong quá trình xúc tác như His 57, Asp 102, Ser 195 (sự đánh số của chymotrypsinogen) Bước đầu tiên trong sự xúc tác là hình thành của một acyl enzym trung gian giữa cơ chất

và serin tương ứng Bước thứ hai (sự loại bỏ acyl hoá) là trung gian acyl- enzym bị thuỷ phân bởi một phân tử nước dẫn đến sự phân tách peptid và phục hồi ser- hydroxyl của enzym[l 1][55]

Môt số ví du về emym nhóm serỉn proteơsel 11

- Chymotrypsin-, được tổng hợp ở tuyến tuỵ dưới dạng tiền enzym

nhất vốn mang một proton của histidin Phức acyl- enzym này có sự thay đổi đồng hoá trị tạm thời ở enzym Liên kết este bị thuỷ phân giải phóng acid carboxylic và enzym lại về thời điểm xuất phát.

Enzym này có khả năng thuỷ phân các liên kết peptid trong đó sự tham gia của nhóm carboxyl của acid amin là tyrosin, phenylalanin, trytophan, methionin và leucin

- Trypsin: được tổng hợp ở tuyến tuỵ dưới dạng tiền enzym là

trypsinogen

Trung tâm hoạt động của trypsin có chứa một serin và hai histidin, các nhóm này gần nhau trong không gian nhờ cấu trúc bậc ba của phân tử Trypsin phân cắt chọn lọc liên kết peptid trong đó nhóm carboxyl là của lysin hoặc arginin Ngoài ra trypsin còn có thể thuỷ phân các liên kết este và amid có mạch bên cation nhưng im tiên các liên kết este hơn, chẳng hạn như benzoyl- L-Lysinetyleste (một este của lysin) bị thuỷ phân rất nhanh bởi trypsin Điều đáng quan tâm nữa là trypsin có thể thuỷ phân các este cũng như có thể tổng hơp được các polypeptid

b Nhóm aspartic protease

Phần ló’n aspartic protease thuộc họ pepsin Họ pepsin bao gồm những enzym tiêu hoá như pepsin, Chymotrypsin CLin? như enzym cathepsin D nội bào những enzym được phân lập như renin, protease nấm như penicillopepsin, rhizopuspepsin, endothiapepsin Họ thứ hai của nhóm này gồm những protease của virus như protease của virus HIV Sự nghiên cứu về hình thái tinh thể cho phép chỉ ra rằng những enzym này là những phân tử hai thuỳ với vị trí hoạt động nằm giữa hai thuỳ tương đồng Mỗi thuỳ góp một đoạn aspartat trong hoạt động xúc tác bộ đôi của aspartat Hai đoạn aspartyl này gần với trạng thái hình học trong phân tử hoạt động và một aspartat được ion hoá còn aspartat thứ hai thì không bị ion hoá ở khoảng pH 2-3

Khác với serrín và cystein protease, sự xúc tác bởi aspartic protease không bao gồm một trung gian liên kết hoá trị dù vãn có trung gian tetrahedran Sự tấn công nucleophilic được hoàn thành nhờ hai sự vận chuyển proton đồng thời; một từ phân tử nước tới bộ đôi hai nhóm carboxyl và hai là

từ bộ đôi đến carboxyl oxygen của cơ chất với sự phá vỡ liên kết CO-NH đồns: thời[55]

Ví du về aspartic protease

Pepsin: là một protease acid điển hình, hoạt động mạnh trong môi trường

acid Pepsin được tổng hợp trong màng nhầy dạ dày dưới dạng một tiền enzym

là pepsinogen Pepsinogen được hoạt hoá bởi ion hoặc tự xúc tác để chuyển thành pepsin

Trung tâm hoạt động của pepsin có nhóm carboxyl của acid aspartic tham gia Nhân phenol của tyrosin chỉ tham gia vào việc kiên kết với cơ chất, còn tryptophan tham gia duy trì cấu trúc không gian của phân tử enzym Pepsin có nhiều loại (A, B) Pepsin có khả năng tác dụng được trên các protein nguyên thể cũng như trên các protein đã biến tính Pepsin thuỷ phân đặc hiệu trên các liên kết peptid trong đó có gốc acid là của các amin vòng (Phe, Tyr, Trp) Pepsin cũng thuỷ phân các liên kết peptid có chứa gốc acid amin khác như Leu hoặc Val nhưng vói tốc độ chậm hơn[l 1],

c Nhóm metalloprotease

Metalloprotease có thể coi là nhóm lâu đời của protease và được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm và tổ chức cao hơn Sự liên kết chuỗi và cấu trúc giữa các metalloprotease có sự khác biệt lớn nhưng chúng có một điểm chung nhất đó

là đều có chứa kẽm trong trung tâm hoạt động Trong một số trường họp, kẽm

có thê bị thay thế bởi một kim loại khác như coban hay niken vẫn không 2,iảm tác dụng xúc tác Thermolysin của vi khuẩn đã được mô tả và hình thái tinh thể của nó đã cho thấy kẽm được gắn kết nhờ hai histidin và một acid glutamic Cơ chế xúc tác là sự hình thành trung gian tetrahedra liên kết khônc

hoá trị sau sự tấn công của liên kết kẽm với phân tử nước vào nhóm carboxyl của liên kết phân cắt được Trung gian này nhanh chóng bị phân ly do sự chuyển dịch của proton acid glutamic ra khỏi nhóm[55].

Ví du về metalloprotease

Carboxypeptidase A là enzym được nghiên cứu nhiều, được tiết ra dưới dạng tiền enzym procarboxypeptidase A ở tuỵ bò và lợn Cơ chế hoạt động của carboxypeptidase A đòi hỏi nhóm carboxyl của acid amin đầu tận được tự

do và cả hai enzym có chứa Zir^ ở trung tâm hoạt động Carboxypeptidase A

tác động lên peptid mà vị trí acid amin đầu tận carboxyl không phải là arginin,

ly sin hoặc prolin[l 1]

J.2.4 Đặc điểm của một sốprotease có nguồn gốc thực vật

Protease thực vật hay được gọi là cystein protease vì chúng chứa nhóm thiol của cystein trong trung tâm hoạt động

Cystein protease có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzym vì

có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loại biến đổi hoá học như acid hoá, phosphoryl hóa, oxy hoá và ankyl hoá Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzym đa dạng; tạo phức chất trung gian enzym- cơ chất; phức họp cơ chất với cofactor; hoặc duy trì ổn định các cấu dạng hoạt động của enzym

Cystein protease có tínli đặc hiệu rộng, chỉ hoạt động được klii nhóm thiol trong trung tâm hoạt động kliông bị bao vây Do đó, các chất như cystein, acid ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hoá enzym này Flotease cystein bị ức chế bởi một số muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thuỷ ngân như p- chloromercuribenzoat và các chất khác như iodoacetamid Các protease này còn bị oxy hoá dưód tác dụng của các chất oxy hoá như hydrogen peroxyd, iod Acid ethylen diaminotetraacetic (EDTA) có khả năng kết họp vói các ion kim loại trong dung dịch, vì vậy thường làm tăng độ bền của cystein protease Nlióm protease này gồm các enzym ở thực vật bậc cao là papain tìĩ cây đu đủ; ficin từ câysung;

V í d u v ề c y s t e i n P r o t e a s e

Papain', là một polypeptid có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là asparagin, có ba cầu disulfit (do 6 gốc cystein tạo thành) và một nhóm thiol tir do Papain chưa hoạt hoá có thành phần là hỗn hợp protein cystein disulfit

Phân tử papain có dạng gần giống hình cầu gồm hai phần phân cách nhau bằng một “vết nút” mà bề mặt của nó là phần chính của truníĩ tâm hoạt động Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử được tạo thành bởi các nhóm guanidin của gốc arginin với nhóm carboxyl Một cầu nối bên trong

và bốn cầu nối phân bố ở bên ngoài phân tử Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng[l 1]

1.2.5 Ví dụ vềprotease có nguồn gốc vi sinh vật

Protease của H IV (HIV PR): thuộc nhóm protease aspartic vì trung tâm hoạt động chứa acid aspartic

HIV PR có cấu tmc dimer chứa hai phần tương tự nhau, nhĩmg tiểu đon vị liên kết không hoá trị gồm 99 acid amin gắn kết vào cấu trúc hai phần đối xứng Cấu tiíic gồm hai phần phân cách nhau bẳng một “klie nút” mà bề mặt của nó chính là trung tâm hoạt động Klie gắn kết cơ chất gồm nhũng đoạn tưong đồng tCr mỗi tiểu đon vị và được gắn lên một bề mặt từ vị trí hoạt động của acid aspartic [3 6

Qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc và vai trò của HIV PR trong vòng đời virus HIV Đó là việc tạo ra các acid amin cho quá trình tổng hợp protein tạo virus mới Cấu trúc cơ sỏ' của HIV PR được tìm

ra là chìa khoá để hình thành nên cấu trúc nền của chất ức chế HIV chất ức chế protease Điều này đã cho phép tạo ra nhóm thuốc điều trị HIV có bản chất là ức chế HIV PR mang hiệu quả cao

Cùng với việc phân tích protease của HIV, các nhà khoa học đã tìm hiểu cấu trúc và vai trò trong vòns đời vi sinh vật của protease

Bảng 1.1 Protease của một vài vi sinh Vứí[20][27][36][37][39][63]

Plasmepsin II Aspartic protease

Kí sinh trùng

Trypanosoma cruzi

Nấm Candida albicans SAPs (Secreted Aspartic

Proteases)

Aspartic protease

1.2.6 M ột số ứng dụng của protease trong thực tiễn

Nghiên cứu protease là rất cần thiết, đặc biệt trong lĩnh vực y, dược và có rất nhiều ứng dụng trong thực tế:

- Trực tiếp sử dụng protease trong các chế phẩm thuốc điều trị.

- Dùng protease là chất trung gian để nghiên cứu, phát hiện các chất ức chế protease

Nsoài ra, protease còn được ứng dụng trong các lĩnh VỊIC khác như: làm thuốc bảo vệ thực vật,

1.3 C h ất ức c h ếp ro tea se (P rotease ỉnhibitor-PI)

1.3.1 K hái niệm

Chất ức chế protease những chất có tác dụng ức chế hoạt động của protease ở những mức độ khác nhau

Chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên vào năm

1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính chống trypsin trong huyết thanh người Đến nay, các PI đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn gốc động vật, thực vật, vi khuẩn Có thể nói không

ở tổ chức sống nào là không tồn tại PI và nhiều PI đã được tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu chất ức chế chỉ thực sự được bắt đầu vói những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất ức chế trypsin tuỵ bò Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được sử dụng

để phát hiện PI như Chymotrypsin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế

từ nấm Từ cấu trúc nền của protease, các nhà khoa học cũng đã hình thành nên rất nhiều cấu trúc chất ức chế protease ứng dụng trong thực tế phác đồ điều trị [10]

1.3.2 Phán loại chất ức chếprotease

a.Dựa vào nguồn gốc của chất ức chế protease

- Chất ức chế Protease tổng hợp như FOY- 305[48], các chất tương tự pepstatin[58],

- Chất ức chế Protease có nguồn gốc động vật như aprotinin, hirustasin,

- Chất ức chế Protease thực vật như chất ức chế loại Kunitz trypsin (trong đậu tương)[41],

- Chất ức chế Protease vi sinh vật như amastatin, E-64, bestatin,[58]

b Dựa vào các nhóm Protease bị ức chế[10][34][58]

- Serin protease inhibitor như leupeptin, antipain, chymostatin,

elastatina,

- CyStein protease inhibitor như E-64,

- Aspartic protease inhibitor như pepstatin, hydropeptatin,

- Metallo protease inhibitor như bestatin, amastatin, actinonin, histagin, Trong đó các chất ức chế loại serin protease được chú ý nghiên cíai nhiềunhất

B PI thực vậtKunitz trypsin

inhibitor

C PI vi sinh vật

E-64 Aspergillus japonicus Cystein protease

D PI tổng hợp

NHCH(R)CH(OH)CạNR % (aspartic protease)

(serin protease)

1.3.3 Cấu trúc và tính chất của chất ức chếprotease

PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có bản chất là protein được nghiên cúìa ứng dụng nhiều hơn cả Trong phân tử của chất ức chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease bị nó ức chế, gọi là trung tâm phản ứng (TTPƯ) Gốc acid amin có vai trò quan trọng nhất trong tương tác đặc hiệu với enzym gọi là acid amin của TTPƯ, ký hiệu là acid amin P l, liên kết peptid tương ứng -P l-P ’l- gọi là liên kết peptid của TTPƯ thường nằm trên bề mặt của phân tử PI trong víing có cầu disulfua Bản chất gốc P1 phản ánh tính đặc hiệu của PI Acid amin P1 của chất ức chế trypsin thường là ly sin hoặc arginin, của Chymotrypsin là methionin hoặc leucin Ngoài acid amin P l, các acid amin lân cận cũng có ảnh hưởng quan trọng đến tính đặc hiệu của chất írc chế

Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng Nếu chỉ có một TTPƯ gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn; nếu có hai TTPƯ- chất ức chế hai đầu hay đầu kép; và nếu có nhiều TTPƯ- chất ức chế nhiều đầu Các

PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử protease, các enzym này có thể có tính đặc hiệu giống hoặc khác nhau[13].Mỗi một chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc một số protease

Cho đến nay, chúng ta đã tìm ra hơn 100 chất ức chế protease trong tự nhiên được tách ra từ nhiều tổ chức khác nhau của vi khuẩn, thực vật, động vật Những PI này ức chế thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, ngăn cản cơ chất tiếp cận với vị trí xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzym suốt quá trình diễn ra sự cản trở Kích cỡ của chúng cũng đa dạng từ 50 đoạn acid amin (như chất ức chế trypsin ở thận bò) tới 400 đoạn acid amin (như chất ức chế alpha-lproteinase) Những chất ức chế serin được nghiên cứu và biết đến nhiều nhất Gần đây, một bước tiến lófn lao là đã hình thành nghiên cứu ức chế

tự nhiên của cysteine (cystatine) Trong khi đó, những hiểu biết về chất ức chế

cả aspatyl và métallo đều rất hạn chế Vì vậy, nghiên cứu chất ức chế protease vẫn còn nhiều vấn đề cần được quan tâm tìm hiểu, đặc biệt đối với chất ức chế aspartyl protease và metalloprotease[57 Ị

1.3.4 Cơ ch ế tác động của chất ức chê protease

Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ chế gần ciống nhau Chúng ngăn cản hoạt động của enzym protease trong phạm vi tế bào người hay những phần vi sinh vật mới Protease vi sinh vật cần thiết cho quá trình trưcmg thành và sinh sản tạo vi sinh vật mới cũng như giải phóng chúng lây truyền sang tế bào khác Khi các PI gắn kết vào enzym này, những vi sinh vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế bào khác được Vì vậy sẽ ngăn cản được sự lây lan vi sinh vật trong cơ thể[54].Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau [10]:

- ức chế (khoá) hoạt động của các protease bởi phản ứng tương tác protein- protein

- Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào tmng tâm hoạt động của các protease

Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương tác giữa enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến- cơ chế chuẩn giốnc cơ chất Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tưofng tự như cơ chất kết hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về cấu trúc không gian của TTPƯ chất ức chế và TTHĐ enzym theo kiểu “ổ khoá và chìa khoá” Có thể biểu diễn sự tương tác theo sơ đồ sau:

E + I ^ E-I ^ E + r

Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm thành enzym tự do cùng chất ức chế dạim ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I*

Trong dạng hiệu chỉnh, liên kết -P l-P ’l- bị thuỷ phân Phức E-I khá bền ở pH trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid, ở pH thích hợp cho hoạt động của protease trong phức E-I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết -Pl- P’l- Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác định bản chất acid amin đầu N

và đầu c , từ đó biết được bản chất acid amin P1 của PI[13]

Việc nghiên cứu về chất ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra những thuốc mới ứng dụng điều trị

Tác động của PI trong từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác nhau Việc nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của bệnh là rất cần thiết Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động theo ba cơ chế chính là;

- Úc chế sự thuỷ phân protein thành các acid amin, ngăn cản sự tổng hợp nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus (phần 2.1)

- ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển bệnh hay

là nguyên nhân gây bệnh như trong sự di căn ung tế bào ung thư (phần 2.3)

- Chất ức chế protease có vai trò ảnh hưỏng đến các quá trình sinh học trong cơ thể (các PI sinh lý) như trong quá trình cầm máu, đông máu , từ đó đưa ra thuốc aprotinin trong điều trị xuất huyết (phẩn 2.4)

PI có mặt trong hầu hết các tổ chú'c trong tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào

nó cũng đóng một vai trò nhất định Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ là rất cần thiết để phục vụ trong điều trị[10][57]

A^IẲOÍOÌ'

U- ịASV

1.3.5 M ột số ứng dụng của chất ức chếprotease

- úhg dụng của PI trong bảo vệ thực vật chống một số tác nhân gây hại

như nấm mốc, côn trùng

- úhg dụng PI trons y dược học

- Dùng PI đê thử hoạt tính và nhận dạng protease

Hiện nay, trên thế giới, các chất ức chế protease đang được nghiên CÚII và sử dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực của đòi sống Nghiên cứu, ứng dụng PI được các nhà khoa học quan tâm chú ý[21][32] Từ khi ra đòi, PI đã đem lại rất nhiều lợi ích, đặc biệt trong lĩnli vực bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ con người, úhg dụng PI trong y học là một thành tựu đáng ghi nhớ Đó chính là phác đồ điều trị HIV với PI

đã tạo ra một cuộc cách mạng, giảm tỷ lệ tử vong và đem lại nhiều hy vọng cho nhĩmg bệnh nhân phải hứng chịu căn bệnli này[17][25] ơiính từ nliũng thàiili công vód PI đã thu hút các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu, PI hiện nay đang đi sâu vào hầu như mọi loại bệnh từ điều trị bệnh lây nhiễm vi sinh vật như vữus đến nlìũng bệnh liên quan đến điều hoà cơ thể nliư ung thư, viêm, Các chế phẩm PI làm thuốc đang ngày càng phát triển (phụ lục 1)

Tại Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thuốc mới của chúng ta còn gặp nhiều khó khăn với nhiều nguyên nhân khách quan như kinh phí, nhân lực, việc tìm hiểu và nghiên cứLi về chất ức chế protease cũng chỉ mói bắt đầu Để có thể phát triển được nền y học nước nhà, phục vụ tốt cho người bệnh, chúng ta cần

có những quan tâm đúng đắn theo kịp với sự phát triển của thế giới không chỉ

về chất ức chế protease trong điều trị mà còn về vấn đề sản xuất thuốc nói chung Việt Nam có nguồn tài nguyên cây thuốc hết sức phong phú, có thể là nguồn tạo PI[15]; kết hợp giữa y học hiện đại và cổ truyền sẽ mang lại một nền y học phát triển và phù hợp vói đất nước

2 SỬ DỤNG CHẤT ức CHÊ PROTEASE TRONG ĐlỂư TRỊ

Ngày nay, chất ức chế protease được nghiên cím nsày càng nhiều và nó cũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Các nhà khoa học đã nghiên cúii tìm ra cấu trúc vai trò của protease đối với sự phát triển của vi sinh vật, qua đó tổng hợp ra các PI đặc hiệu ức chế sự nhân lên của vi sinh vật Họ

đã thành công với phác đồ điều trị virus, đặc biệt là chống lại căn bệnh thế kỷ HIV, mở ra hướng nghiên cứu thuốc điều trị ký sinh trùng, ung thư, nấm cũng như nhiều căn bệnh khác

2.1 C hất ức c h ế p ro te a se ứng dụng tron g điều trị virus

2.1.1 Vài nét về virus và thuốc điều trị

* Sơ lươc về virus

Một vài đặc điểm nổi bật trong sự lây nhiễm virus[33][2][3]:

- Sự lây nhiễm được khởi đầu bằng sự gắn kết đặc hiệu của virus vào hề mặt tế bào vật chủ Điều này cần đến protein trên bề mặt virus đó có thể là

một phần của capsid hoặc mấu protein trên envelope virus Protein bề mặt phải tiếp xúc với một thành phần của tế bào vật chủ được hoạt động như là virus receptor Chỉ những tế bào chiếm được virus receptor mới có thể lây nhiễm Trong cơ thể ngưòi, sự lây nhiễm virus thường có thể bị chống lại bởi kháng thể bao phủ lên protein bề mặt của virus, vì vậy ngăn cản sự gắn chúng vào tế bào vật chủ

- T4 và một s ố thực khuẩn thể khác được cấu tạo như nhữn^ kim tiêm đ ể tiêm a nucleic của clĩúníĩ vào hên trong tế hào vật chủ Virus trong trong

động vật và trong cơ thể con người sử dụng những cách khác nhau Một vài trong số chúng khởi động một phản ứng bên trong tế bào sau khi gắn kết lên

bề mặt tế bào; một số envelope virus tự hoà tan với màng plasma của tế bào vật chủ, giải phóng nucleocapsid vào trong tế bào chất của vật chủ Trong

những trưcmg họfp này, không có lófp áo của a.nucleic virus trong tế bào vật chủ.

- Nhiều virus ức ch ế quá trình sốnq của tế hào vật chủ, nhưng virus trong

động vật thưòỉng không cắt hoàn toàn DNA của tế bào vật chủ thành các đoạn nhỏ

- DNA của tcít cả virus đều lạm dụng rihosom của tế hcio vật chủ cho việc tổníị hợp protein của riêng mình Sự tái bản DNA và sự sao chép của

những virus nhỏ hơn dựa phần lớn vào enzym của tế bào vật chủ, nhưng những virus lớn hơn, như T4, tự tổng họfp nhiều protein mà chúng cần

- Nhữnẹ virus sốn^ trong những sinh vật có nhân điển hình(eukaryote) tái bản trong nhân hoặc trong t ế bào chất Phần lớn DNA của virus được tái

bản trong nhân, nơi mà chúng có thể chiếm đoạt DNA của tế bào vật chủ, enzym RNA polymerase, một số protein khác của sự tái bản và sao chép DNA Nhưng phần lớn RNA của virus tái bản trong tế bào chất

- T ế bào nhiễm virus của người không phải luôn luôn bị tiêu diệt hởi sự lây nhiễm Không giống như sự lây nhiễm T4 trong E coỉì, tế bào lây nhiễm

tiếp tục loại bỏ hạt virus Envelop của virus lấy từ màng nhân hay màng plasma khi virus chui ra khỏi tế bào vật chủ của nó

* Thuốc điều tri virus

Thuốc sử dụng trong điều trị virus có khả năng ức chế một hoặc một số khâu trong chu kì sao chép phát triển của virus, chủ yếu là ức chế tổng hợp acid nucleic Điển hình là[l][2][3];

- Thuốc kháng virus herpes: như Acyclovir, foscanest,

- Thuốc điều trị nhiễm virus hô hấp: như amantadin, rimantadin, ribavirin,

- Thuốc điều trị HIV (phần 2.1.2)

Hình 2.1 RNA của HIV

2.1.2 HIV/AIDS và thuốc điều trị hiện nay

Thông qua việc nghiên cứư cấu trúc cơ sở của

những protease virus và vai trò của nó trong vòng đời

của virus, các nhà khoa học đã tìm ra được cấu trúc cơ 31

sở của chất ức chế protease đặc hiệu với từng protease

virus Thành công này cho phép hình thành nên những

phác đồ điều trị virus có sự tham gia của chất ức chế protease Trong đó, PI sử dụng trong phác đồ điều trị HIV/AIDS là một ví dụ điển hình về tác dụng trong điều trị của PI

* Đại cương về HIV/AIDS

Hình 2 2 Vòng đòi của virus HIV

Qua trình sao chép ngược

REVERSE TRANCRIPTASE

S ự HOÀ M ÀNG I - S HIV RNA

PROTEASE INHIBITOR

DNA virus HIV hợp

nhất vào DNA nvười

khác với các virus khác là thông tin di truyền của HIV là chuỗi ARN nên cần

có sự phiên mã ngược từ ARN thành AND nhờ enzym sao chép ngược (reverse transcriptase- RT)[2][3],

HIV có khả năng đặc biệt là kháng lại thuốc điều trị theo cơ chế sau[12]: Khi virus xâm nhập vào cơ thể, bộ gen virus sẽ chèn vào DNA tế bào vật chủ qua một cơ chế sao mã ngược, sử dụng men sao mã ngược (RT) biến RNA virus thành DNA virus và chèn vào DNA tế bào vật chủ Trong thời gian

đó, chúng như hoàn toàn bất hoạt và có vẻ như “biến mất” trong tế bào vật chủ, khiến chúng trở nên "không thể xác định"- nhất là trong trường hợp có sự xuất hiện của thuốc Tuy nhiên, trong tất cả thời gian còn lại, chúng đều hoạt động rất mạnh và DNA virus trong DNA vật chủ có tác dụng như một mạch khuôn mẫu, luôn sao mã thành mRNA virus Chúng nhanh chóng sử dụng tối

đa các nucleic có sẩn của tế bào đủ để tổng hợp mRNA vims, giải mã thành các protein virus với số lượng rất lớn trong thời gian rất ngắn

Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra chìa khoá bí ẩn trong cách hành động của virus HIV trong cơ thể Chúng có thể "bật/tắt" bộ gen của chúng theo một cơ chế dưói sự điều khiển của một gen trong chính bộ gen virus Cơ chế này rất hiệu quả khi HIV tấn công được vào một tế bào lympho T- CD4 đang "ngủ", có tên là tế bào ghi nhớ lympho T (memory T cells) Các tế bào T này bất hoạt khi cơ thể không cần một đáp ứng miễn dịch (khi không có tác nhân gây bệnh xâm nhập) và chúng trở thành các tế bào T hoạt động khi có đáp ứng miễn Chính sự khác biệt giữa các gen được "bật/tắt"trong tế bào T hoạt động và bất hoạt mà HIV có thể bật/tắt gen điều khiển của nó khiến nó

có thể "ngủ đông" tế bào T ngủ để tránh sự phát hiện của thuốc; hoặc thức dậy

và nhanh chóng chiếm ưu thế bằng cơ chế tự nhân đôi và sinh sản với tốc độ cao của HIV trong tế bào T hoạt động Nhờ vậy, chúng tránh được sự "đối đầu" trực tiếp vói các phân tử thuốc mạnh mẽ

* Thuốc điều trị HP//AIDS

a Sơ lươc về thuốc kháns retroviru (Anti Retrovirus Drus- ARD)ị52]: là

những thuốc được dùng để điều trị lây nhiễm virus HIV Những loại ARD khác nhau sẽ tác dụng vào các giai đoạn khác nhau trong vòns đời của HIV

Sự kết họfp ba hay bốn loại ARD theo nhiều cách được gọi là liệu pháp kháns; retrovirus cực mạnh (Highly Active Anti Retrovirus Therapy- HAART)

Phác đồ điều trị theo hướng dẫn rất phức tạp Đầu tiên là việc tấn công thuốc ồ ạt, sau đó thận trọng hơn và chỉ sử dụng phác đồ HAART tại thời điểm từ 350- 500 tế bào CD4+ T/mm^ Cuối cùng phác đồ này chỉ được sử dụng khi có 200- 350 tế bào CD4+ T/ mm^

Khi sử dụng phác đồ điều trị này, bệnh nhân phải tuân theo những nguyên tắc nghiêm ngặt trong sinh hoạt đặc biệt là chế độ ăn Trong khi đó, thuốc lại gây ra nhiều tác dụng không mong muốn Vì vậy, quá trình điều trị gặp rất nhiều khó khăn

Tliuốc kháng retrovirus bao gồm những loại thuốc sau;

+ Nhóm ức ch ế men sao chép n^ược (Reverse Transcriptase Inhibitors -

RTIs): ức chế hoạt động của enzym sao chép ngược (reverse transcriptase) Khi thiếu enzym này sẽ HIV sẽ không thể tạo được AND cơ bản từ RNA của

nó RTIs ở ba dạng:

- Loại ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid (Nucleoside analog Reverse Transcriptase Inhibitors- NARTIs hay NRTIs): đây là lớp ARD được phát triển đầu tiên gồm các thuốc như zidovudine (AZT),

didanosine, zalcitabine, stavLidine,

- Loại ức chế enzym sao chép ngược phi nucleosid (Non- Nucleosid Reverse Transcriptase Inhibitors-NNRTIs hay non- nukes); là lớp ARD được phát triển thứ ba, gồm các thuốc như nevirapine, delavirdine, efaverenz

- Loại ức chế enzym sao chép ngược tưofng tự nucleotid (Nucleotide analog Reverse Transcriptase Inhibitors- NtARTIs hay NtRTIs): Thông thường trong cơ thể, những nucleosid tương đồng sẽ biến đổi vào trong nucleotid Uống chúng trực tiếp cho phép loại bỏ những bước là nguyên nhân sây độc Lớp này gồm các thuốc như tenofovir, adefovir.

+ Nhóm ức chếprotease (Protease Inhibitors- Pis):

Pis ức chế hoạt động của protease của HIV và do đó ngăn cản sự sao chép virus vì HIV sử dụng protease của nó để phân huỷ tiền protein tạo acid amin cho việc hình thành hạt virus HIV mới Đây là lớp ARD được phát triển thứ hai gồm có các thuốc saquinavir, ritonavir,indinavir, tivanavir,

Chúng ta sẽ nghiên cứu kỹ về nhóm này ở phần 2.1.3

+ Nhóm ức ch ế xâm nhập (Fusion Inhibitor): ức chế việc xâm nhập (vào

bên trong) của HIV qua màng tế bào, ngăn chặn sự lây nhiễm của những tế bào chưa nhiễm bệnh Đại diện của nhóm là enfuvirtide

Sự phối hợp các ARD : là sự kết hợp nhiều ARD vào trong một viên thuốc

như:

- Combivir = zidovudine (AZT) + lamivudine (3TC)

- Trizivir = abacavir (ABC) + AZT + 3TC

b Han chế của ARD

- Giống như những thuốc điều trị virus khác, thuốc điều trị HIV cũng gây

độc tế bào Hoạt động sao chép của virus thực hiện trong tế bào vật chủ nên các thuốc muốn tiêu diệt được virus thì phải xâm nhập được vào trong tế bào, khi virus bị tiêu diệt thì tế bào cũng bị phá huỷ

- Virus HIV đột biến gen và kháng lại phác đồ chuẩn HAART, do đó cần phải tìm ra những biện pháp chống lại sự kháng thuốc đó

- Quá trình sử dụng liệu pháp điều trị rất phức tạp, gây nhiều khó khăn cho bệnh nhân trong sinh hoạt và chế độ ăn[6J[12J[52]

2.1.3 Protease inhibitor sử dụng trong điều trị HIV/AIDS

Chất ức chế protease là một nhóm thuộc những thuốc kháng retrovirus, được phát triển thứ hai sau nhóm ức chế enzym sao chép ngược[52]

* Lọi ích của chất ức chếprotease

Cho đến năm 1995, các bác sỹ điều trị vẫn chỉ có thuốc ức chế enzym sao chép ngược để ngăn chặn HIV, vì vậy tỷ lệ tử vong cao và có nhiều biến chứng

Vào mùa đông năm 1995- 96, những chất ức chế protease HIV đầu tiên được giới thiệu (saquinavir, indinavir, ritonavir), đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc chăm sóc sức khoẻ cho người nhiễm HIV Một vài thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng hoạt tính của PI trong phác đồ HAART có tác dụng ngăn chặn HIV và làm tăng số lượng tế bào CD4 Vì vậy, sự ra đời của những chất này cùng với việc sử dụng phác đồ kết hợp thuốc đã làm giảm rõ rệt tỷ lệ tử vong, kéo dài đời sống cho người bệnh[25] HAART là một trong nhiều yếu tố làm tỷ lệ tử vong do AIDS ở Mỹ năm 1997 giảm 47% Năm

1997, lần đầu tiên kể từ năm 1990, AIDS rời khỏi danh sách là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại Mỹ, từ thứ 8 tụt xuống thứ 14[17]

Cho đến nay, PI vãn là một phác đồ điều trị hàng đầu cho bệnh nhân HIV, cả vói những bệnh nhân đã kháng với các phác đồ khác và những bệnh nhân HIV tiến triển[6][17][25]

Cơ ch ế tác dụng- Các PI ức chế protease HIV-1 Enzym này chịu trách

nhiệm phân cắt chuỗi gag và gag-pol của virus thành những chuỗi nhỏ hơn có chức năng cho phép virion HIV hoàn thiện Quá trình phân cắt và hoàn thiện diễn ra trong giai đoạn cuối của vòng đời HIV ức chế enzym protease sẽ ngăn cản giải phóng các acid amin cũng như quá trình tạo virion mới và như vậy sẽ ngăn chặn được quá trình lây lan virus sang tế bào mới PI có tác dụng trên cả

tế bào HIV cấp và mạn tính[17][53J[54]

* Hạn ch ế của chất ức chê protease sử dụng trong điều trị HIV

Không lâu sau khi chúng ta ca ngợi thành công của PI trong phác đồ cơ bản HAART, thực tế đã cho thấy không phải mọi thứ đều tốt đẹp- những vấn

đề như sô lượng viên thuốc, phải sử dụng thường xuyên hay tác dụng không mong muốn xảy ra trong thời gian dùns thuốc khiến nhiều người lo ngại Tuổi thọ của bệnh nhân tăng lên nhưng lại phải lo lắng về sự xuất hiện của những độc tính kéo dài

Điều trị HIV-1 bằng PIs cần uống liều thường xuyên với số lượng viên lớn (đôi khi hơn 10 viên một ngày) Saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir

và lopinavir/ritonavir khi uống cần phải chú ý đến chế độ ăn uống Chỉ có amprenavir (APV) là không chịu ảnh hưởng của thức ăn Liều của indinavir cần uống nhiều nước để tránh gây sỏi thận Sự thay đổi hình thức mới đây của nelfinavir (NFV) từ 250mg lên 650mg một gói đã giảm số lượng phải uống từ

Cuối cùng, hạn chế của những thuốc này là chế độ thực hiện nghiêm ngặt

và phủ nhận chất lượng của cuộc sống Những vấn đề này đã cho thấy việc quan trọng là lựa chọn xem có kéo dài sự sống hay không để tránh những tác dụns không mong muốn[25]

Tliông qua việc tìm hiểu về những hạn chế của PI trong điều trị để nghiên

cứi\ tìm ra những biện pháp khắc phục đem lại hy vọng sống có chất lượno;

cho người bệnh

* Những thách thức của chất ức chếprotease

Chất ức chế protease vấp phải một thách thức lớn khi những chất ức chế enzym sao chép ngược phi nucleosid (NNRTIs, non-nukes) ra đời Đây là những thuốc dung nạp tốt ở đường tiêu hoá Thực tế đã chứng minh phác đồ điều trị với NNRTIs tốt hơn phác đồ cơ sở PI trong phần lófn bệnh nhân cả khi

số lượng virus cao hay số lượng tế bào CD4 rất thấp Gần đây, sự cải tiến trong việc hình thành non- nukes efavirenz đã sản xuất một loại thuốc dùng một viên trên ngày- một tiêu chuẩn trong công nghiệp Như vậy, PI cũng cần phải được nghiên cứư sâu hơn nữa để hạn chế những tác dụng không mong muốn

và tăng hoạt tính của thuốc[25

^Phcit triển những PI được tăng cường tác dụng (Boosted PI)

Các chất ức chế protease của HIV (HIV PIs) được chuyển hoá thông qua

hệ thống cytocrom P450 3A4 ở gan Khi dùng ritonavir cùng với các PI khác,

nó sẽ làm tăng nồng độ trong máu của tất cả các chất này, trừ nelíinavir (những PI này được gọi là những chất ức chế protease được hiệp đồng tác dụng -Boosted PI) Việc tăng cường tác dụng này làm giảm liều thông thường

và số lượng viên cho saquinavir, indinavir, amprenavir và loại trừ hạn chế trong chế độ ăn của indinavir

Tác dụng dược lý của lopinavir tăng lên dẫn đến những sản phẩm có liên quan về phương diện lâm sàng, hình thành sự phối họp lopinavir/ritonavir (LPV/RTV) Trong những nghiên cứu chủ đạo, những liệu pháp chứa Boosted

PI LPV/RTV đã cho thấy hoạt lực mạnh hofn liệu pháp chứa nefinavir và đặc biệt ở cả những bệnh nhân có số lượng virus cao Vì những nghiên cứu này mà ngày nay LPV/RTV là một phần cấu thành nên liệu pháp chống retrovirus được ưu tiên hàng đầu trong phác đồ điều trị ban đầu.

Hiện nay, Boosted PIs được sử dụng ngay từ những ngày đầu điều trị nhưng vãn tồn tại nhiều hạn chế Sự kết họp LPV/RTV và sự hình thành nelfinavir dưới dạng viên 625mg là một nỗ lực tốt nhằm giảm số lượng viên thuốc phải dùng Vấn đề còn lại chỉ là những tác dụng không mong muốn trên

bộ máy tiêu hoá, sự tăng cholesterol máu và một số bệnh nhân phản ứng với ritonavir nên không thể sử dụng lựa chọn này [25]

Hình 2.3.So sánh nồng độ Boosted PI và Unboosted PI trong máu[54

Hours After Dose

Chú thích:

Drug concentration: nồng độ thuốc

Hours After Dose: thòi gian sau khi dùng thuốc

PI with boost= Boosted PI: PI đã được tăng cường tác dụng

PI without boost= Unboosted PI: PI không được tăng cường tác dụng

^Những thách thức trong phác đồ điều trị và những chất ức chê protease mới

Từ năm 1995, điều trị HIV tiếp tục được phát triển trong cả tiên lượng bệnh và lựa chọn thuốc Sử dụng phác đồ HAART điều trị HIV có sự xem xét

về hoạt tính, hiệu quả kéo dài và khả năng dung nạp ở đường tiêu hoá nên HIV không thực sự là tai hoạ chết ncười nữa Hiện nay, liệu pháp cơ sở của những chất ức chế enzym sao chép ngược phi nucleosid cho phép lựa chọn số lượng viên rất thấp và tính chịu thuốc tốt Sức đề kháng của thuốc là một cân nhắc cần thiết trong việc lựa chọn điều trị, thậm chí cho cả liệu pháp điều trị đầu tiên đối với bệnh nhân mới mắc Những vấn đề cần thực hiện nghiêm ngặt chính là số lượng viên thuốc, liều thường xuyên và chế độ ăn uống Những thử nghiệm lâm sàng thuốc mới cần được đánh giá đúng đắn về độc tính (cả ngắn hạn và dài hạn), điều này đã không được nhìn nhận đúng khi phát minh ra liệu pháp PIs đầu tiên[25][60]

Phân tích được những hạn chế của phác đồ PIs, thấy được những thách thức cần giải quyết sẽ giúp cho chúng ta tiếp tục nghiên cứu và tìm ra được những PI mới có nhiều ưu việt hơn[7] Tliật vậy, ba thuốc HIV PI mới đang đón nhận được sự chú ý vì những thử nghiệm mới đây trên lâm sàng; Có hai thuốc đã được FDA cấp giấy phép lull hành là atazanavir (ATV) và fosamprenavir (APV); còn tipranavir hiện nay vẫn đang ở giai đoạn ba của thử nghiệm lâm sàng Sự cải thiện hoạt tính, khả năng dung nạp thuốc ở đường tiêu hoá, liều linh động và sức đề kháng của thuốc đã khởi động những quan tâm mới vào vai trò mà PI thể hiện trong việc điều trị cho bệnh nhân HIV

a Atazanavir (ATV, Reyataz)

Atazanavir được FDA cấp giấy phép liru hành vào tháng 7-2003 Đây là thuốc thứ hai được chấp nhận với liều dùns một lần/ngày (cùns với amprenavir đã được tăng tác dụns;- boosted amprenavir) Khi sử dụng cùn2 với ritonavir, nồng độ trong máu của ATV tăng lên (còn gọi là ATV đã được tăng tác dụng- Boosted ATV) Liều thường dùng là hai viên capsul 200mg/l lần/ ngày ATV ít gây xáo trộn lipid trong máu và húu hẹn sức đề kháng tốt trong phác đồ điều trị cho người mới mắc bệnh Thử nghiệm lâm sàng trên những bệnh nhân mới mắc cho thấy tác dụng tốt của ATV, tương tự như efavirenz Tuy nhiên, thử nghiệm trên những bệnh nhân đã mắc bệnh lâu thì tác dụng không tốt bằng LPV/ RTV Nhìn chung, ATV có khả năng dung nạp tốt ở đường tiêu hoá, dù nó có hơi nhiều tác dụng không mong muốn trên hệ tiêu hoá hơn NFV (nelfinavir) ATV được dùng một lần hai viên/ ngày là số lượng viên nhỏ nhất so với bất kì HIV PI nào đang lưu hành trên thị trường Không

có tác dụng lên cholesterol và triglycerid trong máu là một đặc điểm khác biệt của ATV so với những PI khác

Tác dụng không mong muốn cơ bản của ATV là làm tăng nồng độ bilirubin trong máu (bilirubin là một sản phẩm của sự chuyển hoá trong san), dãn đến bệnh vàng da (11%), vàng mắt (9%) trên lâm sàng Nhưng tác dụng này hiếm khi dẫn đến việc ngưng điều trị Những triệu chứng này sẽ mất đi khi ngừng điều trị Trong một số bệnh nhân còn xuất hiện những dấu hiệu khác thưòỉng trên điện tim Những thay đổi này không có triệu chứng bệnh nhưng cũng cần được cảnh báo và sử dụng thận trọng đối với những bệnh nhân có tiền sử bệnh tim

b Fosamprenavir f908, APV, Lexiva)

Fosamprenavir được FDA cấp giấy phép vào tháng 10-2003 Sự chuyển hoá của 908 bị ức chế bởi ritonavir, cho phép tăng tác dụng điều trị với liều hai lần/ ngày Đặc điểm bất lợi nhất của 908 là gây phát ban Sức đề kháng tốt trong phác đồ điều trị cho bệnh nhân mới, hoạt tính mạnh hơn nelfinavir Không có sự hạn chế ăn uống khi dùng 908

Cũng giống như ATV, 908 tạo khả năng dung nạp tốt ở đưcmg tiêu hoá

So với nelfinavir, tỷ lệ gây tác dụng không mong muốn trên bộ máy tiêu hoá của 908 thấp hơn, bệnh nhân uống 908 ít bị tiêu chảy hơn cả khi 908 đã được tăng cường tác dụng khi dùng với ritonavir

c Tipranavir (TPV)

Hiện nay, tipranavir vẫn đang trong giai đoạn ba của thử nghiệm lâm sàng trên những cá thể nhiễm HIV TPV là lớp thay thế mới đầu tiên, những chất ức chế không peptid của HIV-1 protease Những đặc tính dược động học của TPV liên quan đến sự tăng cường tác dụng của ritonavir TPV cũng gây tác dụng không mong muốn trên hệ tiêu hoá như loại PI liên họp, nhưng vãn

là thuốc kháng virus được khuyên khích sử dụng

Hoạt tính và khả năng hấp thu tốt ở đường tiêu hoá của atazanavir và 908 góp thêm những lựa chọn quan trọng mới trong việc chăm sóc cho người bệnh HIV Cùng với những PI khác trong sự phát triển và tăng tỷ lệ của sức đề kháng của thuốc khởi đầu, lớp PI đã cho thấy một sự đổi mới cần quan tâm trong việc điều trị những bệnh nhân mới mắc[25]

So với những chất ức chế protease đầu tiên thì ATV và 908 có số lượng viên thấp hơn, cải thiện nhiều khả năng chịu thuốc cũng như mức độ ảnh hưởng lên bộ máy tiêu hoá Tuy nhiên, việc phát minh những thuốc PI mới chưa thể dừng lại ở đây vì vẫn còn nhiều vấn đề cần phải được cải thiện để tăng tính an toàn khi sử dụng như sự tương tác thuốc- thuốc của PI rất khó

nắm bắt, đặc biệt là atazanavir[17][25], những biến chứng cần đến sự định lượng của những nghiên cứư, Chính vì vậy, chúng ta cần phải tìm hiểu và nghiên cứu PI nhiều hơn nữa.

2.1.4 P1 trong điều trị nhiễm một sô virus khác

Từ thành công trong phá đồ điều trị HIV/AIDS, PI vãn đang tiếp tục được nghiên cứu trong nhiều bệnh lây nhiễm virus khác như viêm gan c (HCV), bệnh hespes virus[20][63], .Trong điều trị HCV, hai công ty về dược phẩm Gilead Sciences và Achiillion cũng đã đưa chế phẩm GS 9132 vào giai đoạn I của thử nghiệm lâm sàng (15/8/2005) GS 9132 chính là một chất ức chế protease, ngăn cản qúa trình sao chép của HCV và hứa hẹn sẽ đem lại kết quả điều trị HCV tốt trong tương lai[61]

Hiện nay, hai loại virus có cấu trúc với nhiều điểm tương đồng cũng đang được nghiên cứu nhiều, đó là virus gây ra hội chứng viêm đường hô hấp cấp (SARS) và virus gây đại dịch cúm ở gia cầm và người (virus H5N1) Cả hai bệnh này đều có tỷ lệ gây tử vong cao, có thể tạo ra đại dịch, đe dọa đến toàn

bộ thế giới Vì vậy, nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị chúng là rất cần thiết và cấp bách Trong một bài viết được đưa lên tạp chí Clinical Virology của bác sỹ Andrea Sanvarino, đã trình bày về việc loại thuốc chống HIV có tên là Kaletra kết họp với hai loại thuốc PI là ritonavir và lopinavir có thể cho ra lợi ích tiềm năng cho việc chữa trị virus SARS dù virus này không sinh ra loại protease giống như của HIV Mặt khác ông cũng cho biết, mô phỏng trên máy tính đã cho thấy PI có vai trò quan trọng khống chế SARS có tên là 3CL-pro cũng giống một thành phần trong PI của H5N1[18] Như vậy có thể thấy rằng các

PI có thể chống lại virus H5N1 và SARS một cách hiệu quả, từ đó PI sẽ là hướng nghiên cứu tìm ra phác đồ điều trị hai loại bệnh nguy hiểm này

Qua tất cả những thử nghiệm và ứng dụng PI trong thực tế điều trị HIV,

có thể thấy rằns PI là một dược liệu tiềm năng trong điều trị nhiễm virus

2.2 C h ất ức c h ế p ro te a se tron g điều trị k í sinh trùng

2.2.1 Bệnh sốt rét

*'Bênh sốt rét và thuốc điều tri

Đây là bệnh truyền nhiễm do kí sinh trùng sốt rét (KST SR) gây ra, có 4

loài là: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malañae và Plasmodium ovale.

Bệnh sốt rét lây truyền qua đường máu; qua côn trùng trung gian là muỗi Anopheles, qua đường truyền máu từ mẹ sang con trong lúc mang thai[5]

Theo thống kê mỗi phút lại có khoảng bốn trẻ em chết vì sốt rét Trên thế giới, số lượng nhiều nhất lên tới 3 triệu người chết/năm từ 500 triệu ca lâm sàng và ước tính hơn 2 tỉ người, trên 40% dân số có nguy cơ mắc bệnh Điều này cho thấy phần lớn những trưcmg hợp bị sốt rét có nhiều tác hại gây tử vong bằng tổng số người chết vì AIDS hơn 15 năm qua[27]

Sốt rét phân bố khắp vùng nhiệt đới (trong đó có Việt Nam), được giới hạn bởi sự phân bố muỗi Anopheles Hiện nay, tỉ lệ mắc bệnh này đang tăng

do một vài nhân tố: (1) tính kháng thuốc của KST tăng lên, (2) tính kháng thuốc trừ sâu của muỗi tăng lên, (3) phạm vi phân bố của bệnh tăng lên (do sự tàn phá rừng và sự di cư vào các thành phố )

Bệnh sốt rét có thể được ngăn chặn trên hai mặt: (1) tấn công vector muỗi

để giảm tỉ lệ lây truyền, (2) ngăn chặn và điều trị lây nhiễm trên người Biện pháp xử lý bằng phun thuốc trừ sâu và dùng màn tẩm thuốc đã giảm được sự lây truyền mặc dù vấn đề kháng thuốc trừ sâu vẫn đang tiến triển Bảo vệ bằng miễn dịch của cơ thể cũng đã được chý ý nhưng cho đến nay vẫn chưa có vaccin đặc hiệu[27] Vì vậy, ngày nay, phương pháp bảo vệ của chúng ta vẫn

là việc sử dụng một số nhóm thuốc đã được biết đến như[2][3]:

- Thuốc cắt cơn (thuốc diệt thể phân liệt trons hồníĩ cầu): quinin, chloroquin, mefloquin,

- Thuốc chống tái phát (diệt thể vô tính ở chu kỳ ngoại hồng cầu của p vivax và p maỉariae)- primaquin.

- Thuốc chống lây truyền (diệt giao tử): primaquin

- Thuốc dự phòng (diệt thể vô tính ở chu kỳ tiền hồng cầu): chloroquin, closLianid, fansidar,

Thuốc điều trị sốt rét được sử dụng theo một phác đồ nhất định

Tuy nhiên, hiểu biết về tác động của nhiều loại thuốc, như chloroquin, trụ cột của liệu pháp hoá học chống sốt rét hơn 40 năm qua vẫn còn nghèo nàn Liệu pháp điều trị ngày càng bị KST SR kháng Vì vậy, mục tiêu mới cần thiết là can thiệp vào những con đường sinh hoá của KST Các chất ức chế protease của KST đã được nghiên cứu như là một mục tiêu quan trọng tạo ra một liệu pháp điều trị mới có hiệu quả[23][27]

^Chất ức chếprotease sử duns tron2 điều tri sốt rét

Các nhà khoa học đã tìm ra được hai nhóm protease chính của KST SR,

đó là;

- Falcipain: thuộc nhóm cystein protease, được phân lập từ

p /aỉcipanim.

- Plasmepsins (gồm plasmepsin I, II): thuộc nhóm aspartic protease.

Qua nhiều thử nghiệm thực tế đã cho thấy các protease này có vai tròquan trọng trong vòng đòi của KST SR và liên quan tới sự phá huỷ hemoglobin

Từ những phát hiện về falcipain, các nhà khoa học đã nghiên cứu tác

dụng của các chất ức chế lên sự phát triển của p falciparum trong hồng cầu

nuôi cấy Thể vô tính với hình thái bất thường đã được quan sát trên những KST sau 6h ủ bệnh với những chất ức chế cystein protease- leupeptin (20- 100|.iM) hoặc E-64 (140|.iM) Sự bất thưÒTig của thể vô tính là kết quả ức chế hoạt động của cystein protease (falcipain) hơn là triệu trứng chung của độc

tính trên Plasmodium, trước đó những họp chất khác bao gồm chất ức chế