ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú và đa dạng. Trải qua quá trình lịch sử phát triển trên 4000 năm, nhân dân ta có nhiều tri thức, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong phòng và điều trị bệnh. Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, các kinh nghiệm và tri thức sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng trở nên có nhiều lợi thế và ưu điểm. Việc kế thừa và phát triển nền Y Dược học cổ truyền đang là nhiệm vụ quan trọng của ngành Dược Việt Nam. Giảo cổ lam là tên thường dùng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một dược liệu thành phần hoạt chất chủ yếu là saponin có tác dụng hạ mỡ máu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống ung thư, chống viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, giải tỏa stress… Giảo cổ lam phân bố ở nhiều nước như: Nhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á... Tại Việt Nam, Gynostemma pentaphyllum lần đầu tiên phát hiện tại vùng núi Phanxipang (Lào Cai) vào năm 1997. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về sinh học, thành phần hóa học và tác dụng của loài cây này. Nhiều sản phẩm từ Giảo cổ lam đang được lưu hành trên thị trường: trà giảm béo Giảo cổ lam, trà Giảo cổ lam Tuệ Linh hạ lipid máu… Năm 2009, Hoàng Văn Lâm và cộng sự 27 đã công bố thêm một loài mới thuộc chi Gynostemma Blume, bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam là Gynostemma longipes C.Y. Wu in C.Y. WU S.K. Qua khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học thấy Gynostemma longipes có thành phần gần giống với Gynostemma pentaphyllum nhưng lại có hàm lượng saponin cao hơn hẳn. Nằm trong nhóm ý tưởng nghiên cứu và phát triển nguồn nguyên liệu Giảo cổ lam tại Việt Nam, đề tài “Phân lập và xác định một số saponin trong
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CẤN THỊ THANH LOAN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ SAPONIN TRONG GYNOSTEMMA LONGIPES C.Y.WU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CẤN THỊ THANH LOAN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ SAPONIN TRONG GYNOSTEMMA LONGIPES C.Y.WU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn dược liệu HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp. Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình chỉ bảo, động viên và hướng dẫn cho tôi những kiến thức và phương pháp nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên trong Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng ban và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Cấn Thị Thanh Loan MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phấn bố của chi Gynostemma Blume 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố Gynostemma longipes C. Y. Wu ex C. Y. Wu et S. K. Chen 4 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài khác trong chi tại Việt Nam 5 1.2. Tổng quan về saponin nhân Dammaran 6 1.2.1 Cấu trúc của saponin nhân dammran 6 1.2.2. Tác dụng và công dụng của saponin nhân dammaran 7 1.3. Các saponin trong chi Gynostemma Blume 7 1.3.1. Saponin trong chi Gynostemma Blume 7 1.3.2. Một số saponin trong Gynostemma longipes 10 1.4. Tổng quan một số phương pháp phân tách các hợp chất thiên nhiên 13 1.4.1. Sắc ký cột 13 1.4.2. Sắc ký chế hóa 14 1.4.3. Tổng quan về nhựa hấp phụ 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 16 2.1.1. Nguyên liệu: 16 2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 16 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 16 2.2. Nội dung và Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Chiết xuất 17 2.2.2. Phân đoạn hóa 17 2.2.3. Phân lập và tinh chế 17 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Thực nghiệm và kết quả 19 3.1.1. Chiết xuất 19 3.1.2. Phân đoạn hóa. 19 3.1.2. Phân lập, tinh chế và nhận dạng 28 3.2. Bàn luận 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………………………………………38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa n-BuOH D/c Butanol Dịch chiết EtOAc Ethyl actate EtOH Ethanol GCL Giảo cổ lam 1 H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton MeOH Methanol NXB Nhà xuất bản PƯ Phản ứng SK Sắc ký SKC Sắc ký cột STT Số thứ tự TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của các saponin trong G. pentaphyllum 9 Bảng 3.1. Kết quả định tính saponin và flavonoid 21 Bảng 3.2. Hệ dung môi chiết rắn lỏng 28 Bảng 3.3. Sắc ký đồ của B1 với các hệ dung môi 30 Bảng 3.4. Sắc ký của B t với các hệ dung môi 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1. Cấu thức trong mặt phẳng của khung Dammaran 8 Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum 9 Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7 8 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của glycoside A 11 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Glycoside B 11 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của vinagynosteside A 12 Hình 1.7. Công thức cấu tạo của EL1 13 Hình 3.1. Sơ đồ qui trình chiết xuất 19 Hình 3.2. Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn hóa bằng nhựa hấp phụ 22 Hình 3.3.Sắc ký đồ của các phân đoạn 24 Hình 3.4. Sơ đồ qui trình làm giàu phân đoạn saponin N 80 26 Hình 3.5. Sắc ký đồ P4 27 Hình 3.6. Sắc ký đồ của B 2.1 ,B 2.2 32 Hình 3.7. Sắc ký đồ của Bv 33 Hình 3.8. Sơ đồ quá trình phân lập B 1 , B t 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú và đa dạng. Trải qua quá trình lịch sử phát triển trên 4000 năm, nhân dân ta có nhiều tri thức, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong phòng và điều trị bệnh. Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, các kinh nghiệm và tri thức sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng trở nên có nhiều lợi thế và ưu điểm. Việc kế thừa và phát triển nền Y Dược học cổ truyền đang là nhiệm vụ quan trọng của ngành Dược Việt Nam. Giảo cổ lam là tên thường dùng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một dược liệu thành phần hoạt chất chủ yếu là saponin có tác dụng hạ mỡ máu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống ung thư, chống viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, giải tỏa stress… Giảo cổ lam phân bố ở nhiều nước như: Nhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á Tại Việt Nam, Gynostemma pentaphyllum lần đầu tiên phát hiện tại vùng núi Phanxipang (Lào Cai) vào năm 1997. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về sinh học, thành phần hóa học và tác dụng của loài cây này. Nhiều sản phẩm từ Giảo cổ lam đang được lưu hành trên thị trường: trà giảm béo Giảo cổ lam, trà Giảo cổ lam Tuệ Linh hạ lipid máu… Năm 2009, Hoàng Văn Lâm và cộng sự [27] đã công bố thêm một loài mới thuộc chi Gynostemma Blume, bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam là Gynostemma longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Qua khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học thấy Gynostemma longipes có thành phần gần giống với Gynostemma pentaphyllum nhưng lại có hàm lượng saponin cao hơn hẳn. Nằm trong nhóm ý tưởng nghiên cứu và phát triển nguồn nguyên liệu Giảo cổ lam tại Việt Nam, đề tài “Phân lập và xác định một số saponin trong 2 Gynostemma longipes C. Y. Wu” có mục đích nghiên cứu sâu hơn về thành phần saponin của loài Gynostemma longipes với hai mục tiêu cụ thể là: 1. Chiết xuất và tinh chế được phân đoạn giàu saponin. 2. Phân lập và xác định một số saponin trong phân đoạn thu được. [...]... loài thu c chi Gynostemma Blume đã đư c công bố là Gynostemma pentaphyllum, Gynostemma laxum [6], [7], [11], và Gynostemma longipes C Y Wu in C Y WU & S K Chen [27] 1.1.3 Đ c điểm th c vật và phân bố Gynostemma longipes C Y Wu ex C Y Wu et S K Chen Đ c điểm th c vật: C y d y leo, thân c nh mảnh, c 5 g c hình ngũ gi c, mỗi gióng dài 10-20 cm, đường kính 0,2-0,3 cm, lông d y ở mấu Lá kép chân vịt, cuống... OHC Me O OH HO O HO Hình 1.5 C ng th c cấu tạo c a Glycoside B 11 Năm 1993 [41], Changde đã nghiên c u trên G longipes m c tại tỉnh Vân Nam - Trung Qu c và tách đư c 2 chất c c u tr c dạng tinh thể Một chất đã đư c x c định là α-spinasterol glucoside Chất c n lại đư c x c định là c c u tr c của flavonoid ho c flavonol Năm 1997, Guo và c ng sự đã phân lập đư c 3 saponin nhân dammaran trong đó c 1 saponin. .. hấp phụ vào silicagel đã đư c hoạt hóa ở 110 C trong 1 giờ Sau đó silica gel đã hấp phụ c n đư c bay hơi dung môi đến khô tơi rồi chuyển lên c t Lần lượt chiết bằng c c hệ dung môi c độ phân c c kh c nhau thu đư c c c phân đoạn 2.2.3 Phân lập và tinh chế Để phân lập c c chất, chúng tôi sử dụng c c phương pháp c bản như s c ký c t pha đảo C1 8 và s c ký lớp mỏng điều chế + S c ký c t pha đảo C1 8, pha... khử, c c nguyên tố vi lượng như Al, Si, Ca, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag C ng theo c c nghiên c u n y, c c saponin trong chi Gynostemma Blume chủ y u thu c nhóm Dammaran Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm c u tr c hóa h c n y 1.2.1 C u tr c của saponin nhân dammran Dammaran là nhóm saponin triterpenic, phần aglycon c a nhóm n y c c u tr c 4 vòng và một mạch nhánh Số carbon c a... 1.7 C ng th c cấu tạo c a EL1 13 1.4 Tổng quan một số phương pháp phân tách c c hợp chất thiên nhiên 1.4.1 S c ký c t Nguyên t c: Một mẫu thử đư c nạp lên trên đầu c t chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxit) C t chứa chất hấp phụ n y đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển d c theo c t sẽ làm di chuyển c c cấu tử c a mẫu thử, do c c cấu tử n y c độ phân. .. n y nên chúng tôi quyết định dùng phân đoạn n y tiếp t c nghiên c u phân lập 3.1.3 Phân lập, tinh chế và nhận dạng saponin 3.1.2.1 Sử dụng s c ký c t pha đảo a C n phân lập: C n đư c làm khô c a phân đoạn P4, đư c chia làm 2 lần để đưa lên c t - C t s c ký: C t th y tinh c khóa và nút mài, đường kính 1,5cm, chiều dài 100 cm, rửa sạch, s y khô, c định trên giá theo chiều thẳng đứng - Chất nhồi c t:... -CH3, -CHO, c c alcol và ít phổ biến hơn c là nhóm ch c ceton ở vị trí C- 19 (R3) Nhóm -OH c ng c ở vị trí C- 2(α) và C- 12(β) [32] C c saponin dạng ocotillon c c u nối epoxy tại vi trí C- 17 c ng đư c phát hiện với c u tr c 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [31] C c saponin trong giảo c lam đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ c ... ổn định c t bằng c ch rửa nhiều lần bằng nư c cất đến khi dịch rửa giải trong, sau đó khóa c t - Hấp phụ dịch chiết lên c t: Dịch chiết đư c đưa từ từ lên c t, cho dịch ch y xuống đến sát bề mặt nhựa, khóa c t, để khoảng 30 phút để dịch chiết đư c ổn định trên c t - Rửa giải c c phân đoạn: + Đưa nư c cất lên c t, mở khóa cho dịch ch y xuống, duy trì lượng dung môi trên c t sao cho nhựa luôn ngập trong. .. tiên c a nhóm saponin nhân sâm đư c tìm th y ngoài họ Araliaceae [32] Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII c ng tìm th y trong loài Gymnema sylvestra [42] C c saponin c n lại chiếm phần lớn c c gypenosid đư c phát hiện lần đầu ở loài Gynostemma pentaphyllum C u tr c một số saponin trong Gynostemma pentaphyllum đư c trình b y ở hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.1 R6 R4 20 R5 R7 a b CH2OH OH c OH... phân c c và phân c c Theo độ phân c c đư c chia thành phân c c y u, phân c c trung bình và phân c c mạnh Đư c sử dụng nhiều hiện nay gồm c c loại nhựa: D101, DA201, D, chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111, WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9… [25] b Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin Ứng dụng chính c a nhựa hấp phụ là để tinh chế c c loại đường, hấp phụ khí, xử lý nư c thải, . đề tài Phân lập và x c định một số saponin trong 2 Gynostemma longipes C. Y. Wu c m c đích nghiên c u sâu hơn về thành phần saponin c a loài Gynostemma longipes với hai m c tiêu c thể. Đ c điểm th c vật và phấn bố c a chi Gynostemma Blume 3 1.1.3. Đ c điểm th c vật và phân bố Gynostemma longipes C. Y. Wu ex C. Y. Wu et S. K. Chen 4 1.1.4. Đ c điểm th c vật và phân bố một. C- 3(β) và C- 20. C c nhóm ch c tiêu biểu là -OH, -CH 3 , -CHO, c c alcol và ít phổ biến hơn c là nhóm ch c ceton ở vị trí C- 19 (R3). Nhóm -OH c ng c ở vị trí C- 2(α) và C- 12(β) [32]. C c saponin