Để phân lập các chất, chúng tôi sử dụng các phương pháp cơ bản như sắc ký cột pha đảo C18 và sắc ký lớp mỏng điều chế.
+ Sắc ký cột pha đảo C18, pha tĩnh là silica gel có thêm mạch hydrocarbon kém phân cực. Dịch rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, bản mỏng là silica gel pha đảo, có sử dụng thuốc thử vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc.
+ Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254nm (Merck), phát hiện vết chất bằng cách cắt rìa bản mỏng, phun
thuốc thử vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để phát hiện vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, phản hấp phụ bằng dung môi n-BuOH bão hòa nước.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thực nghiệm và kết quả
3.1.1. Chiết xuất
Phương pháp chiết xuất: Phương pháp chiết hồi lưu.
Cân lấy 1kg dược liệu, nghiền nhỏ và chiết hồi lưu bằng dung môi MeOH: H2O (80: 20). Toàn bộ dược liệu được chiết 3 lần, mỗi lần 2 giờ. Gộp tất cả dịch chiết được 10 lít và đem thu hồi dưới áp suất giảm đến còn 2 lít dịch chiết nước.
Hình 3.1. Sơ đồ qui trình chiết xuất
3.1.2. Phân đoạn hóa.
3.1.2.1. Sử dụng nhựa hấp phụ D101.
a. Khảo sát nhựa hấp phụ D101
- Chuẩn bị dịch chiết: Hút lấy 10 ml dịch chiết nước ở trên (tương ứng với 5 g dược liệu) lọc qua giấy lọc để chuẩn bị đưa lên cột nhựa hấp phụ.
Dược liệu (1 kg)
MeOH thu hồi
Dịch chiết trong MeOH Dịch chiết nước (2 lít) MeOH 80% Mt Nghiền Bột dược liệu
- Chuẩn bị cột nhựa hấp phụ: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2 cm, chiều dài 30 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột.
Rót từ từ nhựa hấp phụ D101 sau khi được ngâm trong nước cất lên cột, rửa thành cột, cho thêm một lớp bông ở trên để tránh xáo trộn, ổn định cột bằng cách rửa nhiều lần bằng nước cất đến khi dịch rửa giải trong, sau đó khóa cột.
- Hấp phụ dịch chiết lên cột: Dịch chiết được đưa từ từ lên cột, cho dịch chảy xuống đến sát bề mặt nhựa, khóa cột, để khoảng 30 phút để dịch chiết được ổn định trên cột.
- Rửa giải các phân đoạn:
+ Đưa nước cất lên cột, mở khóa cho dịch chảy xuống, duy trì lượng dung môi trên cột sao cho nhựa luôn ngập trong dung môi. Rửa giải cho đến khi dịch thu được hết màu, đem gộp lại, cô đến khi còn 20 ml đem lắc với n- BuOHbh/H2O 3 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch n-BuOH, cô đến còn 1 ml (M0), dùng để kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.
+ Đưa EtOH 30% lên cột, mở khóa cho dịch trên cột chảy xuống, tiếp tục rửa giải đến khi dịch thu được hết. Dịch hứng được gộp lại đem cô đến khi còn khoảng 20 ml đem chiết với n-BuOHbh/H2O, gạn lấy lớp n-BuOH. Chia dịch thu được thành 2 phần bằng nhau, cô phần 1 trên bếp cách thủy đến khi còn 0,5 ml dịch chiết n-BuOH (M30). Phần còn lại đem lắc với NaOH 10%, 3 lần, lớp NaOH hết màu, gạn lấy lớp trên, loại nước bằng natrisulfat khan, cô trên bếp cách thủy còn 0,5 ml (N30).
+ Tiếp tục đưa lần lượt EtOH 50%, 80%, 96% thu được 0,5 ml các phân đoạn M50, M80, M96, N50, N80, N96.
- Kiểm tra saponin và flavonoid trong các phân đoạn: Trong quá trình rửa giải cột, ở mỗi phân đoạn, lấy 2 ống nghiệm sạch, hứng mỗi ống 0,5 ml dịch rửa giải.
+ Kiểm tra saponin: Pha loãng bằng 2 ml nước, lắc mạnh, nếu có bọt bền là vẫn còn saponin.
+ Kiểm tra flavonoid: Thêm vài giọt NaOH 10%, màu vàng đậm lên chứng tỏ vẫn còn flavonoid.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính saponin và flavonoid.
Nhóm chất Phân đoạn
H20 EtOH 30% EtOH 50% EtOH 80% EtOH 96%
Saponin - - + ++ +
Flavonoid - + + + +
Ghi chú: (-): âm tính (+): dương tính
Hình 3.2. Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn bằng nhựa hấp phụ.
- Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
Dịch chấm sắc ký: Dùng dịch n-BuOH thu được ở trên đem chấm sắc ký. Bản mỏng Silica gel GF254 (MERCK) tráng sẵn, hoạt hoá ở 110o
C trong 60 phút.
Hệ dung môi: CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 2: 0,2).
MeOH thu hồi
Dịch chiết MeOH Dịch chiết nước 10ml dịch chiết Để 24 h, lọc Cột nhựa HP M30 M50 M80 M96 M0
H2O EtOH 30 EtOH 50 EtOH 80 EtOH 96
N50 N80 Lắc , gạn với n- BuOHbh/H2O Lắc, gạn với NaOH10% N96 Mt N30
Thuốc thử hiện màu: Dung dịch vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc.
Quan sát: Dưới đèn UV254nm và UV365nm, sau khi phun thuốc thử, sấy ở 140oC, quan sát dưới ánh sáng thường (hình 3.1).
UV365nm
TT Vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid surfuric đặc
Hình 3.3. Sắc ký đồ của các phân đoạn
Phân đoạn M0: Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng, sau khi phun thuốc thử hiện màu không thấy có vết nào. Kiểm tra phản ứng tạo bọt cho kết quả âm tính chứng tỏ nhựa D101 đã hấp phụ hoàn toàn saponin có trong dịch chiết. Điều này cũng rất phù hợp với các tài liệu nghiên cứu sử dụng nhựa hấp phụ D101 ở giai đoạn này chỉ có đường và các hợp chất màu phân cực bị rửa giải.
Phân đoạn M30 và N30: Phân đoạn này dương tính với phản ứng xác định flavonoid, nhưng âm tính với thí nghiệm tạo bọt. Trên sắc ký đồ so sánh M30 và N30 cũng thấy rất rõ sự biến mất của các vết tương ứng ở phân đoạn N30. Điều này chứng tỏ rằng flavonoid đã xuất hiện tại phân đoạn này nhưng saponin thì chưa có.
Phân đoạn M50 và N50: Phân đoạn này dương tính với các thí nghiệm phát hiện flavonoid và saponin. Trên sắc ký đồ so sánh cũng thấy rõ phân đoạn M50 nhiều hơn một số vết so với phân đoạn N50 ,các vết này đã tan vào dịch NaOH 10% khi xử lý ở trên.
Phân đoạn M80 và N80: Đây là phân đoạn có lượng saponin tập trung lớn (thí nghiệm tạo bọt rất rõ). Trên sắc ký đồ xuất hiện nhiều vết đậm cả ở M80 và N80. Tuy nhiên vẫn có một số vết biến mất ở phân đoạn N80.
Phân đoạn M96 và N96: Đây cũng là phân đoạn dương tính với cả flavonoid và saponin nhưng khi quan sát trên sắc ký đồthấy các vết rất mờ. Đặc biệt tại phân đoạn này khi quan sát ở bước sóng 366nm xuất hiện một số vết huỳnh quang đỏ, có thể là các chlorophyll.
b. Làm giàu phân đoạn saponin N80
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 8 cm, chiều dài 50 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột.
Dựa vào các kết quả thu được ở trên để áp dụng với lượng mẫu lớn hơn để thu được phân đoạn có chứa nhiều saponin N80 (48,97 g). Quy trình chiết xuất và phân đoạn như sau:
Hình 3.4. Sơ đồ qui trình làm giàu phân đoạn N80 3.1.2.2. Phân đoạn hóa bằng chiết rắn lỏng.
- Sử dụng phân đoạn giàu saponin ở trên để tiếp tục phân đoạn bằng phương pháp chiết rắn lỏng.
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa, đường kính 8 cm, chiều dài 50 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót 1 lớp bông thủy tinh ở đáy cột. Dịch chiết nước (2 lít) Cột nhựa hấp phụ D101 M80 EtOH 80% EtOH 30% N80 Lắc , gạn với n- BuOHbh/H2O Lắc, gạn với NaOH10% Để 24 giờ, lọc
- Chất nhồi cột: Hòa tan 10 g cắn N80 trong một lượng tối thiểu MeOH, lọc, sau đó bão hòa với lượng silica gel vừa đủ. Đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi khô tơi.
- Dung môi rửa giải: Hệ dung môi CH2Cl2- MeOH- H2O theo các tỷ lệ như bảng:
Bảng 3.2. Hệ dung môi chiết rắn lỏng
Hệ dung môi Tỷ lệ Thể tích (lít) CH2Cl2- MeOH- H2O 7: 1: 0,25 2 7:1,5: 0,25 2 7: 2: 0,25 2 7: 2,5: 0,25 2
- Nhồi cột: Đưa lượng tương ứng với 2 g cắn phân đoạn N80 đã hấp phụ silica gel lên cột. Rửa giải lần lượt các hệ dung môi với thể tích như trên. Dịch thu được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp lại và thu được 6 phân đoạn khác nhau P1-6 với khối lượng tương ứng 17,30 mg, 11,90 mg, 33,60 mg, 241,0 mg, 286,8 mg, 509,5 mg.
UV254nm UV365nm TT
Hình 3.5. Sắc ký đồ của phân đoạn P4
Nhận xét: Phân đoạn P4 (241,0 mg) thu được khi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 3 vết, một vết rất đậm (Rf=0,437) có thể là hoạt chất chính của dươc liệu này nên chúng tôi quyết định dùng phân đoạn này tiếp tục nghiên cứu phân lập.
3.1.3. Phân lập, tinh chế và nhận dạng saponin 3.1.2.1. Sử dụng sắc ký cột pha đảo
a. Cắn phân lập: Cắn được làm khô của phân đoạn P4, được chia làm 2 lần để đưa lên cột.
- Cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 1,5cm, chiều dài 100 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng.
- Chất nhồi cột: 50 g silica gel C18 được hoạt hóa ở 110º C trong 1 giờ. - Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- Tiến hành: Phân tán silica gel C18 trong 100 ml dung môi rửa giải, sau đó đưa lên cột. Ổn định cột bằng cách dùng bơm hút cho đến khi silica gel C18 trên cột ở mức không đổi. Cho dung môi chảy xuống sát lớp pha tĩnh, khóa cột.
- Đưa cắn lên cột: Hòa tan cắn bằng một lượng vừa đủ dung môi rửa giải rồi đưa lên cột. Cho lớp dịch chảy xuống đến sát bề mặt pha tĩnh. Cho thêm một lớp giấy lọc trên bề mặt để tránh xáo trộn.
- Rửa giải: Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm. - Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng:
+ Dịch chấm sắc ký: dịch hứng trong các ống nghiệm
+ Sử dụng bản mỏng Silica gel pha đảo (Merck) tráng sẵn, hoạt hoá ở 110oC trong 60 phút.
+ Hệ dung môi khai triển: MeOH-H20-Acetonitril (5: 2:0,5).
+ Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid H2SO4 đặc.
+ Quan sát: dưới đèn UV254nm, UV365nm và dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử.
- Kết quả: Thu được 2 phân đoạn B1, B2 với khối lượng tương ứng 11,3 mg, 223 mg.
Kiểm tra độ tinh khiết của B1:
Bảng 3.3.: Sắc ký của B1 với các hệ dung môi
Hệ dung môi Hình ảnh sắc ký Rf
Hệ I CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 1: 0,25) 0,08 Hệ II MeOH- H2O- Acetonitril (5: 2: 1) 0,20 Hệ III MeOH- Aceton- H2O (1,4: 0,2: 0,6) 0,14
Nhận xét: Dựa vào sắc ký đồ của B1 (bảng 3.3), thấy chỉ có 1 vết điều này chứng tỏ B1 tinh khiết.
b. Cắn phân lập: B2 sau khi làm bay hơi hết dung môi.
- Chuẩn bị cột, chất nhồi cột, cách tiến hành tương tự như phân lập cắn P1 - Dung môi rửa giải: MeOH-H20 (7: 3)
- Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng pha đảo với hệ dung môi MeOH-H20(7:3) - Gộp các ống nghiệm có các vết giống nhau thu được 2 phân đoạn:
• Phân đoạn B2.1: Có khối lượng 22,2 mg, soi đèn tử ngoại không thấy vết, hiện màu thuốc thử valinin/ H2SO4(đ) thấy có một vết màu tím có Rf= 0,11
• Phân đoạn B2.2: Có khối lượng 6,2 mg, soi đèn tử ngoại không thấy vết, hiện màu thuốc thử valinin/ H2SO4(đ) thấy có vết màu vàng Rf= 0,1 - Kiểm tra 2 phân đoạn B2.1, B2.2 bằng sắc ký lớp mỏng
• Silica gel GF254nm (Merck) tráng sẵn, hoạt hoá ở 110oC trong 60 phút.
• Hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (7: 1,5: 0,2),
• Thuốc thử vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc.
• Kết quả:
Phân đoạn B2.1, quan sát dưới đèn tử ngoại không thấy vết, dưới ánh sáng thường sau khi phun TT thấy có 2 vết tách rời nhau một vết màu tím Bt (Rf = 0,570), một vết màu vàng Bv (Rf = 0,656)
Phân đoạn B2.2, quan sát dưới đèn tử ngoại không thấy vết, dưới ánh sáng thường sau khi phun TT thấy có vết màu vàng đậm nhất (Rf= 0,5), (hình 3.6).
Hình 3.6. Sắc ký đồ của B2.1,B2.2,
Nhận xét: B2.1 có 2 vết tách rời nhau một vết màu tím Bt (Rf = 0,570) và một vết màu vàng Bv (Rf = 0,656) do đó chúng tôi phân lập tiếp bằng sắc ký điều chế.
3.1.3.2. Phân lập bằng sắc ký điều chế.
- Dịch chấm sắc ký: Dịch của cắn B2.2 được hòa tan trong một lượng tối thiểu n-BuOHbh/H2O
- Chuẩn bị bản mỏng Silica gel GF254nm (Merck) tráng sẵn 10 ×20 cm đã hoạt hóa 110̊C trong 60 phút.
- Hệ dung môi khai triển: CH2Cl2-MeOH-H2O (7: 1,5: 0,2) - Tiến hành:
• Dịch chấm được chấm thành băng liên tục, mỗi lần chấm một lượng khoảng 20 µg/ 1 bản mỏng.
• Tiến hành khai triển bản mỏng đã chấm trong bình thủy tinh có chứa hệ dung môi CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 1,5: 0,2) và đã bão hòa
• Phát hiện vết bằng cách cắt rìa bản mỏng, phun thuốc thử vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc, ghép lại bản mỏng như cũ để phát
hiện vùng chất, cạo lớp silica gel trên bề mặt bản mỏng cho vào trong một cốc sạch.
- Rửa giải:
• Chuẩn bị cột thủy tinh có khóa và nút mài 2×30 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót bông dưới đáy cột.
• Cho n-BuOHbh/ H2O ngập silica gel vừa cạo được của từng chất, khuấy đều, sau đó lần lượt cho lên cột, sử dụng dung môi rửa giải n-BuOHbh/ H2O, rửa cho đến khi chấm bản mỏng không thấy vết nữa thì dừng, đem cô lại thu được Bt, Bv với khối lượng tương ứng 15,3 mg, 3,3 mg.
- Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng Silica gel GF254nm (Merck) tráng sẵn, đã hoạt hoá ở 110o
C trong 60 phút.
Hệ dung môi CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 1,5: 0,2)
Quan sát dưới đèn UV254nm, UV365nm và dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu (hình 3.7).
Kiểm tra độ tinh khiết của Bt: Bảng 3.4 Bảng 3.4. Sắc ký đồ của Bt Hệ dung môi Hình ảnh sắc ký Rf UV254nm UV365nm TT Hệ I CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 1,5: 0,2) 0,56 Hệ II n-BuOH-EtOAc-H2O (4: 1: 2) 0,51 Nhận xét:
Bt, qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với 2 hệ dung môi khác nhau thấy đều hiện 1 vết trên sắc ký đồ chứng tỏ Bt tinh khiết nên chúng tôi tiến hành đo phổ cộng hưởng tử hạt nhân proton.
Bv, qua kiểm tra sắc ký lớp mỏng (hình 3.7) thấy vết tương đối tinh khiết tuy nhiên khối lượng thấp.
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình phân lập Bv và Bt
3.1.3.3. Nhận dạng các chất phân lập
Quá trình phân lập và tinh chế thu được 4 chất lần lượt là B1, B2.2, Bv và Bt. Các chất này thu được từ phân đoạn giàu saponin sau khi qua hàng loạt quá trình chiết xuất theo sơ đồ trên. Các chất này là những hợp chất không màu tan tốt trong nước, hỗn hợp cồn nước, tan rất tốt trong n-BuOH bão hòa
N80
Phân đoạn P4 Phân đoạn P1,2,3,5,6
B2 B1 B2.2 SKC pha đảo SKC silicagel SKC pha đảo B2.1 BT BV SK điều chế
nước và đều dương tính với thí nghiệm tạo bọt. Tuy nhiên chỉ có 2 chất B1 và Bt có đủ lượng để được tiếp tục xác định cấu trúc qua các thông số phổ.
a. Nhận dạng chất B1
Chất B1 ở dạng bột trắng vô định hình. Tan ít trong nước, tan trong hỗn hợp cồn nước, rất tan trong n-BuOH bão hòa nước. Phổ H1
-NMR sắc nét cho các pic xuất hiện chủ yếu thuộc 2 vùng, vùng trường cao là các tín hiệu của phần aglycon, vùng trường trung bình có 12 tín hiệu của các phân tử đường. Vì lượng chất thu được không đủ thu thập thêm các thông tin khác nên chỉ có