Nghiên cứu thành phần hóa học của cây lược vàng

1ĐẶT VẤN ĐỀTừ xa xưa, các dân tộc Châu Á đã biết sử dụng các loại cỏ, cây, hoa, lá trong tnhiên để chữa trị bệnh tật. Tuy nhiên, sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cchủ yếu dựa trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loại thảo dượCùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết của con nguời vcác loại thảo dược cũng ngày càng đòi hỏi sâu sắc hơn. Việc đi sâu nghiên cứthành phần hóa học để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của các cây thuốc chữa bệnh đtrở thành một lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú ý của giới khoa học.Ở nước ta, việc sử dụng cây cỏ để chữa bệnh rất phổ biến trong dân gian. Thờgian gần đây có nhiều thông tin về tác dụng chữa bệnh có hiệu quả của cây Lượvàng còn gọi là Lan vòi. Đây là một loài cây thuộc họ Thài Lài (Commelinaceaevốn có nguồn gốc từ Trung Mỹ với tên khoa học là Callisia fragrans (LindlWoodson . Trong dân gian, Lược vàng đã được sử dụng rất rộng rãi trong việc htrợ và chữa trị các bệnh như: ung thư, bỏng, viêm, nhiễm, lao phổi, bệnh timmạch…Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của cây Lược vàng thông tin truyền miệng còn chưa được chứng minh rõ ràng bằng các nghiên cứkhoa học. Chính vì vậy, Hội người cao tuổi Việt Nam đã đề nghị Viện Hàn lâmKhoa Học và Công nghệ Việt Nam xúc tiến nghiên cứu về cây Lược vàng để tìm rnhững hoạt chất có tác dụng chữa bệnh nhằm chứng minh và làm sáng tỏ các tádụng chữa bệnh của cây Lược vàng.

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 2

1.1 Thực vật học……… 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Callisia Loefl……… 2

1.1.2 Đặc điểm chung của chi Callisia Loefl……… 2

1.1.3 Đặc điểm chung của loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson 3

1.2 Công dụng của cây Lược vàng dùng trong dân gian……… 3

1.2.1.Trên thế giới……… 3

1.2.2 Ở Việt Nam……… 4

1.2.3 Các chế phẩm của cây Lược vàng……… 4

1.3 Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và tác dụng dược

lý của cây Lược vàng……… 6

1.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học……… 6

1.3.2 Nghiên cứu về tác dụng dược lý……… 9

Chương II.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị……… 12

2.1.1 Nguyên liệu……… 12

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử……… 12

2.1.3 Thiết bị và máy móc sử dụng trong nghiên cứu……… 12

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 13

2.3.1 Phương pháp chiết xuất……… 13

2.3.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập chất sạch……… 13

2.3.3 Kĩ thuật kết tinh……… 15

2.3.4 Các phương pháp xác định cấu trúc……… 15

Chương III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.)

Woodson)……… 16

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cắn chiết etyl axetat……… 17

3.2.1.Khảo sát cắn etyl axetat bằng sắc kí lớp mỏng……… 18

3.2.2.Phân tách cắn etyl axetat để phân lập các chất sạch……… 18

3.2.2.1 Tiến hành chạy sắc kí cột……… 19

3.2.2.2 Tinh chế các phân đoạn……… 19

3.2.3 Xác định cấu trúc của các chất đã phân lập……… 25

3.2.3.1 Cấu trúc của VLV3……… 25

3.2.3.2 Cấu trúc của VLV2……… 29

3.2.3.3 Cấu trúc của VLV4……… 32

3.2.3.4.Cấu trúc của VLV5……… 34

3.3 Bàn luận……… 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 39

1H NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ proton)

13C NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (phổ DEPT)

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC)

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC)

ESI-MS: Electron Spray Impact Mass Spectrometry, phổ khối phun mù điện tử s: singlet b: broad

d: doublet o: overlapping

t: triplet dd: double doublet

q: quartet dq: double quartet

δH, δC: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm: parts per million, phần triệu

TLC: Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng

CC: Column Chromatography, Sắc kí cột thường

EC50: Nồng độ có hiệu quả trên 50% tế bào thử nghiệm

LD50: Liều gây chết 50% động vật thử nghiệm

Kt: kết tinh

Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh cho tiện tra cứu

Bảng 3.2 Giá trị Rf của VLV4 trong các hệ dung môi khác nhau

Bảng 3.3 Giá trị Rf của VLV2 trong các hệ dung môi khác nhau

Bảng 3.4 Giá trị Rf của VLV3 trong các hệ dung môi khác nhau

Hình 1.2 Một số chế phẩm từ cây Lược vàng được bán ở Nga

HÌnh 1.3 Một số chế phẩm từ cây Lược vàng ở Việt Nam

Hình 1.4 Các hợp chất phenolic từ cây Lược vàng

Hình 1.5 Cấu trúc của 1 số hợp chất sterol và cerebosit chiết từ cây Lược vàng Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của Isoorientin, L-Tryptophan và Ginsenoid Rg 1 Hình 3.1 Quy trình điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng

Hình 3.2 Sắc kí đồ phân đoạn etyl axetat dưới ánh sáng tử ngoại ở λ= 254 nm và sau khi phun thuốc thử ceri sulfat

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa, các dân tộc Châu Á đã biết sử dụng các loại cỏ, cây, hoa, lá trong tự nhiên để chữa trị bệnh tật Tuy nhiên, sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cỏ chủ yếu dựa trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loại thảo dược Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết của con nguời về các loại thảo dược cũng ngày càng đòi hỏi sâu sắc hơn Việc đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của các cây thuốc chữa bệnh đã trở thành một lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú ý của giới khoa học

Ở nước ta, việc sử dụng cây cỏ để chữa bệnh rất phổ biến trong dân gian Thời gian gần đây có nhiều thông tin về tác dụng chữa bệnh có hiệu quả của cây Lược vàng còn gọi là Lan vòi Đây là một loài cây thuộc họ Thài Lài (Commelinaceae)

vốn có nguồn gốc từ Trung Mỹ với tên khoa học là Callisia fragrans (Lindl.)

Woodson Trong dân gian, Lược vàng đã được sử dụng rất rộng rãi trong việc hỗ trợ và chữa trị các bệnh như: ung thư, bỏng, viêm, nhiễm, lao phổi, bệnh tim mạch…

Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của cây Lược vàng là thông tin truyền miệng còn chưa được chứng minh rõ ràng bằng các nghiên cứu khoa học Chính vì vậy, Hội người cao tuổi Việt Nam đã đề nghị Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam xúc tiến nghiên cứu về cây Lược vàng để tìm ra những hoạt chất có tác dụng chữa bệnh nhằm chứng minh và làm sáng tỏ các tác dụng chữa bệnh của cây Lược vàng

Theo hướng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc có công dụng quý báu và kết hợp với đề tài nghiên cứu khoa học của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chúng tôi đã lự

ng nghiên cứu của khóa luận này với tiêu đề

“Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Lược vàng” theo các mục tiêu sau:

- Phân lập các chất có trong cắn etyl axetat;

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Thực vật học

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Callisia Loefl

Cây Lược vàng thuộc chi Callisia Loefl., một chi thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) Vị trí của chi Callisia Loefl trong hệ thống phân loại thực vật được

Chi: Callisia Loefl

Cây Lược vàng còn có tên gọi là Lan vòi, Địa lan vòi, Lan rủ, Bạch tuộc giả khóm…

1.1.2 Đặc điểm chung của chi Callisia Loefl

Callisia Loefl là một chi nhỏ thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) Chi này

có khoảng 20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bố ở Mexico Những loài thuộc chi có dạng thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi là cây một năm Rễ mảnh, vài loài có dạng củ Thân trườn hoặc bò sát Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn, không cuống Cụm hoa dạng xim như tán, xếp xít, không cuống, được bao bọc bởi

lá bắc, hoa mọc ở nách lá hoặc ở ngọn, thường gồm nhiều chùy hoặc gié, đơn vị được tạo bởi các cặp xim Lá bắc khó nhận, nhỏ hơn 1 cm; không có lá mo; có các

lá dạng lá bắc tồn tại Hoa lưỡng tính, đối xứng tỏa tròn; đài rời, gần bằng nhau; cánh hoa rời, màu trắng hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dài bằng nhau [13]

Đa số các loài thuộc chi Callisia Loefl được trồng làm cảnh như: Callisia

repens (Jacquin) Linnaeus, Callisia elegans Alexander ex H E Moore… Ở Trung

Quốc chỉ có một loài được nhập trồng làm cảnh là Callisia repens (Jacquin)

Linnaeus [12] Ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy các loài thuộc chi này phân bố

trong tự nhiên Trong vài năm trở lại đây, loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson

được nhập trồng vào nước ta với tên gọi là Lược vàng hay Lan vòi

1.1.3 Đặc điểm của loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson

Hình 1.1 Cây Lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woodson

Cây thảo nhiều năm, thân mọng nước có thể dài tới 100 cm hoặc hơn, phân nhánh với thân bò ở gốc Lá mọc tập trung ở ngọn thân, rải rác ở phía dưới, dạng mác thuôn, dài 18-25 cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn và thường có sọc tía Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chùy dài tới 60 cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dài 10-15mm;

lá đài trong suốt, màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-6mm; cánh hoa bóng, trong suốt, màu trắng, mỏng, có dạng trứng hẹp; nhị 6 Cây ra hoa vào mùa xuân [13]

Cây ưa những nơi đất màu mỡ, ẩm, thoát nước tốt và che bóng một phần Nếu trồng ở nơi nhiều ánh sáng, lá thường chuyển sang màu tía và thân mọc thấp Cây được nhân trồng bằng hạt và cành giâm

Lược vàng được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá đẹp và dễ trồng Người ta thường trồng Lược vàng trong các chậu treo để thân buông rủ tạo dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà Do khả năng phát triển nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực vật nhập trồng xâm lấn”

1.2 Công dụng của Lƣợc vàng dùng trong dân gian

1.2.1 Trên thế giới

Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) được sử dụng nhiều ở Nga

Nó được dùng như một cây thuốc dân gian để chữa các bệnh dạ dày-ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường đường hô hấp như: ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung thư

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây Lược vàng được người dân sử dụng theo kinh nghiệm hoặc truyền miệng để chữa khỏi (hoặc giảm nhẹ) các bệnh như: viêm răng lợi, sâu răng, viêm họng, viêm mũi dị ứng, viêm xoang, ho, cảm cúm, viêm phế quản, hen, viêm tai giữa, thối tai, băng huyết, cầm máu vết thương, bỏng, đau đầu mất ngủ, viêm bờ

mi mắt, đau mắt đỏ,mẩn ngứa, trĩ, đi ngoài, đau dạ dày, táo bón, gút, ung thư vú, ung thư dạ dày Ngoài ra, Lược vàng còn có hoạt tính chống oxy hóa, chống tiểu đường, hạ mỡ máu [9] Người dân sử dụng cây Lược vàng bằng các phương pháp hết sức đơn giản như:

- Nhai lá, nuốt cả nước lẫn bã;

- Giã nát để đắp vết thương, xoa bóp, dịt băng cầm máu, làm tan máu tụ, bầm tím;

- Dùng lá, thân cây, vòi và rễ ngâm rượu trắng;

- Phơi khô lá pha nước sôi, nấu nước uống như uống nước chè;

- Nấu thành canh rau trong bữa ăn;

- Nấu cao, sau đó pha loãng uống, bôi da;

- Xay thành nước sinh tố (pha thêm đường, sữa, mật ong )

1.2.3 Các chế phẩm từ cây Lƣợc vàng

Tại Nga, hiện có rất nhiều dược phẩm-mỹ phẩm bào chế từ cây Lược vàng

đã được bán trên thị trường Ví dụ:

- Loại kem trị mụn "Basket Plant" (Hình 1.2a);

- Thuốc Callisia Fragrans Drops (Gold Mustach) dùng để chữa đau lưng, viêm khớp (Hình 1.2b);

- Kem phòng và trị đau gót chân “Foot creme” (Hình 1.2c);

- Sản phẩm “Basket Plant with Potentill tube 125 ml” hỗ trợ chữa viêm khớp, chống oxi hoá, bồi bổ cơ thể (Hình 1.2d);

- Thực phẩm chức năng “BasketPlant Callisia fragrans” hỗ trợ hệ tuần hoàn và

Hình 1.2 Một số sản phẩm từ cây Lược vàng được bán ở Nga

Ở Việt Nam cũng đã có một số sản phẩm có chứa cây Lược vàng như:

- Trà túi lọc Thiên Phúc có tác dụng thanh nhiệt, giải độc toàn bộ cơ thể, hỗ trợ và ngăn ngừa bệnh tật, hỗ trợ rối loạn tiêu hóa, hỗ trợ gan, huyết áp, tiểu đường, bào mòn sỏi thận, khôi phục viêm đường tiết niệu, tăng cường sinh lực, làm đẹp da…(Hình 1.3a);

- Trà túi lọc Tâm Lan có tác dụng giải độc cơ thể, thanh nhiệt, điều hòa huyết áp-tim mạch, suy nhược thần kinh, mất ngủ, thoái hóa đốt sống, ung thư, rối loạn tiêu hóa, loét hoành tá tràng, trĩ nội, lở loét da, viêm gan, xơ gan, trị các bệnh về thận, tiểu đường (Hình 1.3b)

(a) (b)

Hình 1.3 Một số chế phẩm từ Lược vàng ở Việt Nam

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây Lƣợc vàng

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

 Trên thế giới:

Cho đến nay có một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lược vàng trong đó phần lớn là công trình của các nhà khoa học Nga Hầu hết các công bố đều được thực hiện trong khoảng 5 năm trở lại đây, điều đó chứng tỏ cây Lược vàng mới được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Đầu tiên phải kể đến nghiên cứu của TS Olennikov, Viện Sinh họcThực nghiệm-Viện Hàn lâm Khoa học Nga về thành phần các chất phenolic trong cây Lược vàng Nhóm nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc của các axit gallic, axit caffeic, axit chicoric, axit ferulic, các flavonoids (quercetin, kaempferol), coumarins (umbelliferon, scopoletin) và antraquinons (aloe-emodine) Những hợp chất này được biết có nhiều hoạt tính sinh học hấp dẫn như chống oxi hoá, kháng viêm, chống ung thư,chữa tiểu đường, điều hoà miễn dịch…[19]

Axit galic Axit caffeic Axit chicoric

Aloe-emodin Umbelliferon Scopoletin

Quercetin Kaempferol

Hình 1.4 Các hợp chất phenolic từ cây Lược vàng

Khi nghiên cứu về thành phần axit amin bằng cách phân tích, so sánh thời gian lưu với 24 amino axit chuẩn, nhóm nghiên cứu của TS Nikolaeva đã phát hiện thấy trong dịch ép thân và lá tươi cây Lược vàng có chứa 15 axit amin tự do (6 axit amin cần thiết) và 14 axit amin liên kết (7 axit amin cần thiết) bao gồm: Asparagin, Axit aspartic, Threonin, Serin, Glutamin, Axit glutamic, Glycin, Anilin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Tyrain, Phenylalanin, Arginin, và Axit γ-aminobutyric Ngoài ra thành phần vô cơ cũng được khảo sát và kết quả phù hợp với công bố của TS Olennikov trước đó [18]

Một nghiên cứu của Viện Hoá thực vật, Viện Khoa học Uzebekistan cho thấy

lá và thân Lược vàng chứa nhiều dầu béo gồm các axit béo trung tính như hydrocarbon parafin, olefin và hydrocarbon thơm; carotenoid; sterol triterpen axetate, triacylglycerids, axit béo tự do, triterpenol, triterpenic axit và chlorophyl; các glycolipid: sulfolipids, digalactosyldiglyceride, sterolglycoside, cerebroside và monogalactosyldiglyceride; nhóm phospholipid:phosphatidylinosite (PI),

phosphatidylglycerine(PG), phosphatidic axit (PA) Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện thấy các vitamin C, PP và B2 cũng như các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cr, Ni

và Cu trong nước ép Lược vàng Bằng phương pháp định tính trên sắc ký lớp mỏng,

nhóm nghiên cứu cũng phát hiện ra sự có mặt của các sterol cũng như các triterpenol, các chất màu như carotenoit, xanthophyl và chlorophyl [11]

Ở trong nước, các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Lược vàng cũng chỉ mới được thực hiện trong những năm gần đây Năm

2008, nhóm nghiên cứu của TS Trịnh Thị Điệp tại Viện Dược liệu đã định tính sơ

bộ thành phần hoá học của thân, lá Lược vàng và cho biết chúng có chứa flavonoit, carotenoit, phytosterol, axit hữu cơ, chất béo, đường tự do và polysacharit [9] Tiếp

đó, nhóm nghiên cứu đã phân lập và xác định được một số hợp chất sterol (stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside), một hợp chất cerebosit (2-amino-1,3,4-octadecanetriol-N-(2-hydroxyhexacosanoyl) (Hình 5) [4] Các kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của một Luận án Thạc sĩ tại trường ĐH Đà Nẵng[3]

Hình 1.5 Cấu trúc của một số hợp chất sterol và cerebosit chiết từ cây Lược vàng Mới đây, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được hợp chất Isoorientin từ dịch chiết metanol của cây Lược vàng trồng ở Việt Nam (Hình1.6) [9] Hợp chất Ginsenoside Rg1, một trong những chất saponin quan trọng trong các cây thuộc chi Nhân sâm

(Panax), cũng đã được phát hiện trong cây Lược vàng [6] Ngoài ra, trong cây Lược

vàng axit amin L-tryptophan cũng đã được phân lập và xác định cấu trúc [5]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của Isoorientin, L-Tryptophan và Ginsenoid Rg1

1.3.2 Các nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý:

Mặc dù cây Lược vàng được sử dụng rất rộng rãi ở Nga và Việt Nam trong việc hỗ trợ và chữa trị các bệnh như: ung thư, bỏng, viêm nhiễm, lao phổi, bệnh tim mạch… Tuy nhiên tác dụng dược lý của cây này lại chưa được nghiên cứu nhiều

TS Misin đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cây Lược vàng và đã xác định được rằng thành phần chống oxy hóa chiếm 73,2% và 119,3 mg/l trong dịch chiết lá và thân tươi tương ứng [17]

Công bố của nhóm nghiên cứu TS Shantanova, Viện Sinh học Thực nghiệm Nga cũng chứng tỏ tác dụng hạ nồng độ malondialdehyde (MDA-sản phẩm của quá trình peroxy-hoá lipid) của nước ép búp non Lược vàng trên động vật thực nghiệm [23] Nghiên cứu này cũng cho thấy dịch ép nước có tác dụng tăng hoạt động của

cơ, liều uống 1 lần 10,0 mL/kg sẽ tăng khả năng chạy lên 21% so với nhóm kiểm soát Sự gia tăng đáng kể trong độ bền sau khi lặp đi lặp lại việc cho chuột thử

nghiệm với liều là 5,0 mL/kg trong 7 ngày Thời gian chạy tăng lên gần gấp ba lần

so với nhóm kiểm soát

Một nhóm các nhà khoa học tại trường ĐH Ben-Gurion, Israel đã cho thấy dịch chiết cồn lá Lược vàng có tác dụng ức chế virus HSV-1 và HSV-2 ở nồng độ

EC50 là 16,5 và 15 µg/mL Trong khi đó dịch chiết nước không có tác dụng với HSV-1 và HSV-2 nhưng có tác dụng với chủng VZV với liều EC50 là 17 µg/mL [21]

Ngoài các nghiên cứu về tác dụng dược lý, đáng chú ý là nghiên cứu của một nhóm nghiên cứu tại trường ĐH Griffith, Úc đăng trên tạp chí Veterinary Dermatology về khả năng gây viêm da tiếp xúc trên chó thí nghiệm của dịch chiết nước cây Lược vàng Nghiên cứu này đã chứng minh dịch chiết nước cây Lược vàng có khả năng gây viêm da tiếp xúc trên chó thí nghiệm [16]

Ở nước ta, mới đây nhóm nghiên cứu của TS Trịnh Thị Điệp tại Viện Dược liệu đã xác định được liều độc cấp LD50 của cao đông khô dịch ép lá và cao etanol 50% thân Lược vàng là 18,5 g và 21,3 g cao/kg thể trọng tương đương 1075,6 và 1115,2 g nguyên liệu tươi/kg thể trọng chuột nhắt Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cho thỏ uống liên tục 60 ngày cao đông khô dịch ép lá liều tương đương 6; 18; 60 g lá tươi và cao etanol 50% thân Lược vàng liều tương đương 1,2; 3,6 và 12,0 g thân Lược vàng tươi/kg/ngày gây ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê đến các chỉ số huyết học và chức năng gan, thận và chức năng tạo máu so với đối chứng sinh lý Tuy nhiên, với liều sử dụng một số cá thể có hiện tượng gan bị viêm khoang cửa và xung huyết cầu thận [7] Nhóm nghiên cứu này cũng chứng minh 2 cao này có tác dụng chống viêm mạn rõ rệt trên mô hình chuột gây u hạt bằng amian Các mẫu nghiên cứu ở liều 0,2; 0,4 g cao đông khô lá và 0,023; 0,046 và 0,092 g cao etanol 50% thân Lược vàng/kg thể trọng cũng có tác dụng giảm đau ngoại biên nhưng lại không thể hiện rõ ràng tác dụng giảm đau theo chơ chế thần kinh trung ương ở cùng mức liều sử dụng Ở các mức liều này Lược vàng cũng có tác dụng chống oxi hoá trên mô hình chuột nhắt trắng, cụ thể hàm lượng MDA trong gan chuột giảm tới 43,24 và 56,59% so với lô đối chứng bệnh lý [8] Trước đó, nhóm nghiên cứu này cũng đã chỉ ra rằng với liều 50 g nguyên liệu tươi/kg thể trọng, cao chiết nước từ lá

và cao chiết nước cồn từ thân không có tác dụng giảm phù nề trên chuột thực nghiệm Tuy nhiên,

chủng Staphylococcus aureus [2]

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu cây Lược vàng được thu hái ở trung tâm giáo dục - lao động xã hội Hải Phòng (Xã Gia Minh, huyện Thủy Nguyên) vào tháng 9/2012 Cây được tách riêng thân, vòi và lá Sau đó phơi khô, thái thành các đoạn nhỏ dài khoảng 2-3cm rồi đem nghiền thành bột mịn và được bảo quản trong túi ni lông ở nơi khô ráo Mẫu dược liệu được TS Trần Thế Bách - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định tên khoa

học là Callisia fragrans (Lindl.) Woodson họ Thài lài (Commelinaceae) Mẫu tiêu

bản số LV 01 được lưu tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử

- Dung môi: axeton, n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol

- Thuốc thử ceri sulfat

- Bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 có độ dày 0,2 mm của hãng Merck

- Pha tĩnh dùng cho sắc kí cột là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230 -

400 (Mesh) của hãng Merck và Sephadex LH-20 (Sigma)

- Dung môi đo phổ là metanol-d 4

2.1.3 Thiết bị và máy móc sử dụng trong nghiên cứu

- Tủ sấy dược liệu SHELLAB

- Cân phân tích PRESICA

- Cân kĩ thuật

- Máy cất quay chân không BUCHI ROTAVAPOR

- Cột sắc ký bằng thủy tinh

- Đèn soi UV (λ = 254 nm)

- Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz

- Máy đo phổ khối Agilent 1120

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy BUCHI melt point B-545

- Kính hiển vi Scopetek CT-1

- Các dụng cụ: bình nón, lọ thủy tinh, pipet, ống đong, bình cầu…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Khóa luận này tập trung nghiên cứu về thành phần hóa học của vòi cây Lược

vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) theo các mục tiêu sau:

- Phân tách các chất trong cắn chiết bằng dung môi etyl axetat;

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất

Mẫu thực vật sau khi đã sấy khô và nghiền nhỏ được chiết bằng phương

pháp ngâm ở nhiệt độ phòng trong metanol 3 lần Từ dịch chiết metanol này sẽ điều chế các cắn chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo phương pháp chiết phân bố

2.3.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập chất sạch

Để phân tích và phân tách các cắn chiết của cây cũng như phân lập các chất sạch sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) dưới trọng lực dung môi với pha tĩnh là silica gel và Sephadex LH-20

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 Dung môi triển khai sắc kí là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng như: n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol

Sắc kí cột chủ yếu dùng cột thường với pha tĩnh là silica gel, rửa giải với các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol… với pha tĩnh là Sephadex LH-20 thì rửa giải bằng dung môi metanol và hỗn hợp metanol/diclometan

 Cột silica gel:

- Tiến hành nhồi cột:

+ Phương pháp nhồi cột ướt: Silica gel (cỡ hạt 40-60µm) được khuấy, ngâm trong dung môi phù hợp cho thấm đều (khoảng 1 giờ) Rót từ từ dung dịch silica gel

đã thấm ướt theo thành cột (đã được lót một ít bông ở dưới đáy), vừa rót vừa gõ nhẹ vào thành cột để silica gel phân bố đều trong cột Ổn định cột bằng cách dùng bơm

áp lực nén dung môi qua cột cho tới khi thấy cột silica gel trong đồng nhất

+ Phương pháp nhồi cột khô: Silica gel (cỡ hạt 40-60µm) được cho từ từ lên cột (đã được lót ở đáy một ít bông), vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột Sau đó cho dung môi lên và ổn định cột bằng cách dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho tới không còn bọt khí ra khỏi cột nữa Sau khi dung môi chảy gần sát bề mặt silica gel thì cho chất lên cột

- Tiến hành cho chất lên cột trước khi chạy sắc ký: tùy vào lượng chất và dạng chất

mà có thể chọn 2 cách:

+ Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: Nếu hỗn hợp chất cần tách tan trong dung môi đầu tiên triển khai cột thì chất được hòa tan hoàn toàn vào một lượng tối thiểu dung môi này rồi dùng pipet hút chất và nhẹ nhàng bơm lên đầu cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt

+ Nạp mẫu chất ở dạng bột khô: hòa tan chất vào một lượng tối thiểu dung môi thích hợp rồi tẩm lên một lượng tối thiểu silica gel,sau đóđể bay hơi hết dung môi đến khô thu được dạng bột tơi

- Chạy sắc ký: Tiến hành chạy cột với hệ dung môi được lựa chọn Hứng dịch rửa giải vào những bình (lọ) với lượng thích hợp, sau đó chấm sắc ký lớp mỏng để tiến hành gộp các phân đoạn giống nhau

 Cột Sephadex LH-20

Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt: chuẩn bị cột thủy tinh khô, được lót một ít bông ở đáy.Sephadex LH-20 được ngâm trương nở trong MeOH (3 giờ) rồi rót từ từ vào cột và để ổn định cột trong vòng 24 giờ (cột được tái

sử dụng nhiều lần sau khi nhồi) Hòa tan cắn chất cần tách với hệ dung môi thích hợp, sau đó đưa lên cột bằng pipet và tiến hành rửa giải các chất Hứng dịch rửa giải vào những bình (lọ), sau đó tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng để gộp các phân đoạn giống nhau

2.3.3 Kỹ thuật kết tinh

Các bước của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hòa tan hoàn toàn hợp chất rồi để kết tinh ở nhiệt độ thích hợp (thường ở nhiệt độ lạnh), gạn hoặc lọc tinh thể ra khỏi dịch cái và để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong vòng 1-2 h Sau đó,làm khô tinh thể dưới áp suất giảm trong 30 phút trước khi đem đi xác định điểm chảy hay phân tích quang phổ Trong đó, lựa chọn dung môi thích hợp có tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh

2.3.4 Các phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp của các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phương pháp phổ khối (ESI-MS) và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân,gồm phổ một chiều (1H NMR, 13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (HSQC, HMBC)

2.3.4.1 Phổ khối lượng (MS):

Phổ khối là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+hay các ion giả phân tử [M+H]+

và [M-H]-…từ đó xây dựng công thức phân tử Phổ khối lượng sử dụng phương pháp ion hóa bằng phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam

2.3.4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương

tác spin-spin J

Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy nhãn hiệu Bruker Avance

500 MHz với TMS là chất chuẩn nội

Chương III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.)

Woodson)

Mẫu vòi cây Lược vàng tươi được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khô rồi sấy ở

50oC trong vòng 3h Sau khi nghiền mẫu khô thành bột thu được 2,6 kg Nguyên liệu dưới dạng bột (2,6 kg) được ngâm chiết với metanol ba lần (24h/lần,10L/lần) Gộp các dịch chiết lại với nhau và cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm đến khi thể tích còn lại là 2L thấy có kết tủa Lọc riêng phần kết tủa thu lấy phần dịch Pha loãng dịch metanol đã cô đặc bằng nước cất (500 mL) rồi tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan và etyl axetat, mỗi dung môi chiết 3 lần (500mL/lần) Gộp chung dịch của 3 lần chiết và làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cắn chiết tương ứng là n-hexan (16,97 g), etylaxetat (7,8 g)

Hàm lượng cắn etyl axetat được tính theo công thức :

Trong đó :

H % : Hàm lượng cắn thu được

mc : Khối lượng cắn thu được (g)

mdl : Khối lượng dược liệu khô đem chiết (g)

Như vậy, hàm lượng cắn etyl axetat là :

Hình 3.1 Quy trình điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng:

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cắn chiết etyl axetat

Sau khi chiết xuất vòi cây Lược vàng theo quy trình trên, chúng tôi thấy cắn hexan có dạng keo lỏng màu xanh đen rất nhớt, cắn etyl axetat có dạng keo đặc màu nâu đen và cắn metanol có dạng keo rắn màu nâu đen Kết quả khảo sát sơ bộ ban đầu cho biết các thành phần chính của mẫu tập trung chủ yếu ở cắn etyl axetat và cắn metanol Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi tập trung phân lập các chất

n-có trong cắn etyl axetat

- Pha loãng bằng nước cất (500 mL)

- Phân bố với n-hexan (3 lần, 500 mL/lần) Dịch chiết MeOH có kết tủa

- Ngâm chiết bằng MeOH (3 lần, 10 L/lần)

- Cất loại bớt MeOH xuống còn 2 L

3.2.1 Khảo sát cắn etyl axetat bằng sắc kí lớp mỏng

Rf=0,03 và Rf= 0,25

Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn etyl axetat dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm (a) và sau khi phun thuốc thử ceri sulfat (b)

3.2.2 Phân tách cắn etyl axetat để phân lập các chất sạch

Nhằm phân lập các chất sạch có trong cắn etyl axetat, cắn chiết này được phân tách sơ bộ bằng phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ Sephadex LH-20

3.2.2.1 Tiến hành chạy sắc kí cột

- Chuẩn bị cột chạy sắc kí: Cột thủy tinh, đường kính 4 cm, dài 50 cm được rửa sạch, sấy khô, treo lên giá thẳng đứng Rót từ từ 30 g Sephadex LH-20 đã được ngâm cho trương nở hoàn toàn bằng metanol trong vòng 3h Để ổn định cột trong vòng 24h

Cho cắn vào cột: hòa tan hoàn toàn 6,65 g cặn EtOAc vào lượng MeOH tối thiểu Mở khóa cột cho dung môi chảy xuống đến sát bề mặt Sephadex LH-20 thì dùng pippet hút chất bơm nhẹ nhàng lên đầu cột

- Rửa giải với dung môi metanol 100% với tốc độ 20 giọt/phút, hứng các phân đoạn vào từng ống thủy tinh riêng biệt với thể tích dịch khoảng 8-10 ml

- Khảo sát các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH(9:1) Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=

254 nm và hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat Gộp các phân đoạn ống có sắc kí đồ giống nhau

Kết quả thu được 4 phân đoạn trong đó:

+ Phân đoạn F1 (ống 1-10) chủ yếu chứa các chất keo bẩn có khối lượng 0,65 g + Phân đoạn F2 (ống 11-22) trên sắc kí đồ cho 2vết chất chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf=0,1

và Rf= 0,2 Khi loại hết dung môi thu được1,57 g

+ Phân đoạn F3 (ống 23-35) trên sắc kí đồ cũng có 2 vết chất chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ= 254 nm và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf =0,33 và 0,45 Sau khi cất loại dung môi thu được 3,20 g chất + Phân đoạn F4 (ống 36-45) chứa các chất kém phân cực hiện màu rất yếu dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và thuốc thử ceri sulfat Khối lượng là 0,72 g

3.2.2.2.Tinh chế các phân đoạn:

tích mỗi ống khoảng 20-25 ml Khảo sát các phân đoạn ống bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi diclometan/metanol (9/1) Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu với thuốc thử ceri sulfat, gộp các phân đoạn ống có sắc kí đồ giống nhau Kết quả thu được 5 phân đoạn trong đó có:

+ Phân đoạn F2.2 (ống 30-45) trên sắc kí đồ có một vết chính không phát quang dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) nhưng hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat ở Rf = 0,4 Cất loại dung môi thu được chất rắn màu vàng, rửa bằng axeton

thu được 15 mg chất rắn vô định hình màu trắng, kí hiệu VLV6

+ Phân đoạn F2.4 (ống80-93) trên sắc kí đồ có một vết chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat ở Rf= 0,3 Sau

đó loại hết dung môi và kết tinh lại trong hỗn hợp metanol/diclometan thu được 89

mg chất sạch dưới dạng tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV5 Nhiệt độ nóng chảy của

chất là 264-265 oC

Kiểm tra độ tinh khiết của VLV5 bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi

có độ phân cực khác nhau, kết quả trên sắc ký đồ cả 3 hệ chỉ cho 1 vết chất

B 3.1 Giá trị R f của VLV5 trong các hệ dung môi khác nhau

Rf=0,25 Sau đó loại hết dung môi và kết tinh lại trong hỗn hợp metanol/diclometan

thu được 20 mg chất sạch dưới dạng tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV4 Nhiệt nóng

Dưới ánh sáng tử

ngoại (λ= 254nm )

Hiện màu với thuốc thử ceri sulfat

Tinh thể VLV4

Hình 3.4 Sắc kí đồ và hình ảnh tinh thể của VLV4

 Tinh chế phân đoạn F3

Phân đoạn F3 tiếp tục được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ silica gel theo phương pháp nhồi cột khô và tẩm mẫu trên silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/diclometan (1:1, 500 mL), diclometan 100% (500 mL), diclometan/metanol (100:2, 300 mL) và diclometan/metanol (100:4, 1500 mL) Thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 20-25 mL

Khảo sát các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi diclometan/metanol(9:1) Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat, gộp các phân đoạn ống có sắc kí

đồ giống nhau

Kết quả thu được 5 phân đoạn trong đó có:

+ Phân đoạn F3.1 (1-30) có một vệt chất chính không phát quang dưới ánh sáng

tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm nhưng hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat

có Rf=0,7 Sau khi cất loại dung môi và kết tinh trong hệ diclometan/metanol thu

được 40 mg tinh thể màu trắng dạng phiến, kí hiệu VLV1

+ Phân đoạn F3.3 (46-60) có một vết chính phát quang màu đen dưới ánh sáng

tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có

Rf=0,5 Sau khi loại hết dung môi và kết tinh trong hệ metanol/n-hexan thu được 50

mg tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV2, nóng chảy ở 245-246 oC

Bảng 3.3.Giá trị R f của VLV2 trong các hệ dung môi

250 mg chất tinh thể hình lăng trụ, màu trắng, nóng chảy ở 253-254 oC Kí hiệu là

F3.1 F3.2 F3.3 F3.4

VLV1

(40 mg)

Kt trong

CH2Cl2/ MeOH

VLV2

(50 mg)

VLV3

(250 mg)

Kt trong MeOH / n-hexan

F3

(3,20 g) (

Kt trong MeOH/

CH2Cl2

VLV4

(20 mg)

VLV6

(15 mg)

Rửa bằng Axeton

3.2.3 Xác định cấu trúc của các chất đã phân lập

3.2.3.1.Cấu trúc của chất VLV3

Chất VLV3 được phân lập dưới dạng tinh thể hình lăng trụ, màu trắng, nóng

chảy ở 253-254 o

C Phổ khối ESI-MS cho pic giả phân tử [M-H]- tại m/z 333 cùng

với các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C NMR và DEPT cho phép xác định công thức phân tử của chất là C19H26O5 Phổ 1H NMR của VLV3 cho tín hiệu cộng

hưởng của 2 nhóm metyl [δH 0,89 (3H, s, H-18); 1,00 (3H, s, H-19), hai proton của các nhóm metin liên kết với oxi [δH 3,84 (1H, dt, J = 7,5; 4,0 Hz, H-2); 3,97 (1H, q,

J = 2,5 Hz, H-3)], một proton của nhóm metin [δH 3,18 (1H, ddd, J = 10,5;6,5; 2,8

Hz, H-9)] và một proton của một liên kết đôi thế 3 lần [δH 5,92 (1H, d, J = 2,5 (Hz,

H-7)] Phổ 13C NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 19 cacbon thuộc về 2 nhóm metyl, 5 nhóm metin trong đó có 2 nhóm liên kết với oxy [δC 68,16 và 68,40]

và một nhóm metin dạng olephin [δC 122,25], 6 nhóm metylen, một cacbon bậc bốn dạng olephin [δC 164,44], một cacbon bậc bốn liên kết với oxy [δC 80,24], 2 nhóm cacbonyl [δC 205,81 và 220,21] và 2 cacbon bậc bốn khác Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ HSQC và HMBC cho biết đây là một chất có khung steroit Trên phổ HMBC proton của nhóm metyl (H-19) tại δH 1,00 (3H, s) có tương tác với các tín hiệu tại δC 39,17 (C-10), δC 35,53 (C-9), δC 37,11 (C-1) và δC 51,67 (C-5) Proton của nhóm metyl (H-18) tại δH 0,89 (3H, s) có tương tác với các tín hiệu tại δC 24,71 (C-12), δC 53,93 (C-13), δC80,24 (C-14) và δC220,21 (C-17) Proton dạng olephin (H-7) tại δH 5,92 (1H, d, J = 2,5 Hz) có tương tác với các tín hiệu tại δC 35,53 (C-9),

δC 51,67 (C-5) và δC 80,24 (C-14) Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ trên cho phép xác

định chất VLV3 là Rubrosterone Rubrosterone được coi là chất ecdysteroit chuyển

hóa và đã từng được phân lập từ các cây Pfaffia glomerata và Serratula tinctoria

[22, 20]

Các phổ của chất Rubrosterone (VLV3) được trình bày dưới đây:

3.2.3.1.Cấu trúc của chất VLV2

Chất VLV2 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng Khổ khối

ESI-MS cho pic giả phân tử [M-H]- tại m/z 349 cùng với các dữ liệu trên phổ 13C NMR và DEPT xác định được công thức phân tử tương ứng của chất là C19H26O6 Phổ 13C NMR và DEPT cho phép xác định sự có mặt của 19 cacbon trong phân tử thuộc về 2 nhóm metyl [δC 17,13 và 17,58], 4 nhóm metin trong đó có 2 nhóm liên kết với oxy [δC68,32 và 70,13] và một nhóm metin dạng olephin [δC 121,00], 6 nhóm metylen và 7 cacbon bậc bốn gồm có 2 cacbon gắn với oxy [δC 80,29 và 80,40], một cacbon dạng olephin [δC 164,23], 2 nhóm cacbonyl [δC 202,5 và 219,97] và 2 cacbon bậc bốn khác Phổ 1H NMR dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm metyl [δH 0,89 (3H, s, H-18) và 0,96 (3H, s, H-19)], proton của 2 nhóm metin liên kết với oxy [δH3,94 (1H, ddd, J = 8,7; 8,3; 3,3 Hz, H-2); 4,01 (1H,

q, J = 3,0 Hz, H-3)], một proton dạng olephin [δH5,98 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-7).Tín

hiệu cộng hưởng của các proton khác xuất hiện dưới dạng các multiplet hoặc

overlap (chồng chéo lên nhau) ở vùng trường cao Phổ của chất VLV2 rất giống phổ của chất VLV3 ngoại trừ sự mất đi của một nhóm metin và thay vào đó là một cacbon bậc bốn và phân tử lượng của VLV2 lớn hơn phân tử lượng của VLV3 16

mu Điều này chứng tỏ một nguyên tử hidro của VLV3 đã được thay thế bởi một nhóm hydroxy để tạo ra chất VLV2 Kết hợp các dữ liệu phổ trên cùng với việc phân tích các phổ HSQC và HMBC đã xác định được chất VLV2 là 5β-

hydroxyrubrosterone Chất này đã từng được phân lập từ cây Serratula tinctoria [20] và cây Polypodium vulgare L [10]

Phổ 1

H và 13C NMR của VLV2 như sau: