- Chuẩn bị cột chạy sắc kí: Cột thủy tinh, đường kính 4 cm, dài 50 cm được rửa sạch, sấy khô, treo lên giá thẳng đứng. Rót từ từ 30 g Sephadex LH-20 đã được ngâm cho trương nở hoàn toàn bằng metanol trong vòng 3h. Để ổn định cột trong vòng 24h.
Cho cắn vào cột: hòa tan hoàn toàn 6,65 g cặn EtOAc vào lượng MeOH tối thiểu. Mở khóa cột cho dung môi chảy xuống đến sát bề mặt Sephadex LH-20 thì dùng pippet hút chất bơm nhẹ nhàng lên đầu cột.
- Rửa giải với dung môi metanol 100% với tốc độ 20 giọt/phút, hứng các phân đoạn vào từng ống thủy tinh riêng biệt với thể tích dịch khoảng 8-10 ml.
- Khảo sát các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH(9:1). Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat. Gộp các phân đoạn ống có sắc kí đồ giống nhau.
Kết quả thu được 4 phân đoạn trong đó:
+ Phân đoạn F1 (ống 1-10) chủ yếu chứa các chất keo bẩn có khối lượng 0,65 g. + Phân đoạn F2 (ống 11-22) trên sắc kí đồ cho 2vết chất chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf=0,1 và Rf= 0,2. Khi loại hết dung môi thu được1,57 g.
+ Phân đoạn F3 (ống 23-35) trên sắc kí đồ cũng có 2 vết chất chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ= 254 nm và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf =0,33 và 0,45. Sau khi cất loại dung môi thu được 3,20 g chất. + Phân đoạn F4 (ống 36-45) chứa các chất kém phân cực hiện màu rất yếu dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và thuốc thử ceri sulfat. Khối lượng là 0,72 g.
3.2.2.2.Tinh chế các phân đoạn:
Phân đoạn F2:
Phân đoạn F2 (1,57 g) tiếp tục được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ silica gel theo phương pháp nhồi cột khô và tẩm mẫu lên silica gel và rửa giải bằng phương pháp gradient hỗn hợp n-hexan và diclometan (hàm lượng diclometan tăng dần từ 0%-100%). Hứng các phân đoạn vào ống thủy tinh với thể
tích mỗi ống khoảng 20-25 ml. Khảo sát các phân đoạn ống bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi diclometan/metanol (9/1). Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu với thuốc thử ceri sulfat, gộp các phân đoạn ống có sắc kí đồ giống nhau. Kết quả thu được 5 phân đoạn trong đó có:
+ Phân đoạn F2.2 (ống 30-45) trên sắc kí đồ có một vết chính không phát quang dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) nhưng hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat ở Rf = 0,4. Cất loại dung môi thu được chất rắn màu vàng, rửa bằng axeton thu được 15 mg chất rắn vô định hình màu trắng, kí hiệu VLV6.
+ Phân đoạn F2.4 (ống80-93) trên sắc kí đồ có một vết chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat ở Rf= 0,3. Sau đó loại hết dung môi và kết tinh lại trong hỗn hợp metanol/diclometan thu được 89 mg chất sạch dưới dạng tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV5. Nhiệt độ nóng chảy của chất là 264-265 oC.
Kiểm tra độ tinh khiết của VLV5 bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết quả trên sắc ký đồ cả 3 hệ chỉ cho 1 vết chất.
B 3.1. Giá trị Rfcủa VLV5 trong các hệ dung môi khác nhau
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
1 n- Hexan : axeton 2:8 0,70
2 Diclometan : metanol 85 : 15 0,38
Dưới ánh sáng
ngoại (λ= 254 nm)
Hiện màu với thuốc thử ceri sulfat
Tinh thể VLV5
Hình 3.3. Sắc kí đồ và hình ảnh tinh thể của VLV5
+ Phân đoạn F2.5 (ống 94-105) trên sắc kí đồ có một vết chính hiện màu đen dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm) và màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat ở Rf=0,25. Sau đó loại hết dung môi và kết tinh lại trong hỗn hợp metanol/diclometan thu được 20 mg chất sạch dưới dạng tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV4. Nhiệt nóng chảy của chất là 253-254o
C.
Bảng 3.2.Giá trị Rf của VLV4 trong các hệ dung môi khác nhau
STT Dung môi Tỷ lệ Rf
1 n- Hexan : axeton 2:8 0,69
2 Diclometan : metanol 85 : 15 0,38
Dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254nm)
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiện màu với thuốc thử ceri sulfat
Tinh thể VLV4
Hình 3.4. Sắc kí đồ và hình ảnh tinh thể của VLV4
Tinh chế phân đoạn F3
Phân đoạn F3 tiếp tục được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ silica gel theo phương pháp nhồi cột khô và tẩm mẫu trên silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/diclometan (1:1, 500 mL), diclometan 100% (500 mL), diclometan/metanol (100:2, 300 mL) và diclometan/metanol (100:4, 1500 mL). Thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 20-25 mL.
Khảo sát các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi diclometan/metanol(9:1). Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat, gộp các phân đoạn ống có sắc kí đồ giống nhau.
Kết quả thu được 5 phân đoạn trong đó có:
+ Phân đoạn F3.1 (1-30) có một vệt chất chính không phát quang dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm nhưng hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf=0,7. Sau khi cất loại dung môi và kết tinh trong hệ diclometan/metanol thu được 40 mg tinh thể màu trắng dạng phiến, kí hiệu VLV1.
+ Phân đoạn F3.3 (46-60) có một vết chính phát quang màu đen dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm và hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có
Rf=0,5. Sau khi loại hết dung môi và kết tinh trong hệ metanol/n-hexan thu được 50 mg tinh thể màu trắng, kí hiệu VLV2, nóng chảy ở 245-246 o
C.
Bảng 3.3.Giá trị Rf của VLV2 trong các hệ dung môi
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
1 n- Hexan : axeton 2:8 0,74
2 Diclometan : metanol 85 : 15 0,58
3 Etyl axetat : metanol 9 : 1 0,50
Dưới ánh sáng tử ngoại (λ= 254 nm)
Hiện với thuốc thử ceri sulfat
Tinh thể VLV2
Hình 3.5. Sắc kí đồ và hình ảnh tinh thể của VLV2
+ Phân đoạn F3.4 (60-66) trên sắc kí đồ có một vết hiện màu xanh đen với thuốc thử ceri sulfat có Rf= 0,45 (hệ Diclometan/metanol là 9:1). Cất loại dung môi thu được 289,3 mg chất. Kết tinh lại trong hệ dung môi metanol/n-hexan thu được 250 mg chất tinh thể hình lăng trụ, màu trắng, nóng chảy ở 253-254 oC. Kí hiệu là
VLV3.
Bảng 3.4. Giá trị Rf của VLV3 trong các hệ dung môi khác nhau
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
1 n- Hexan : axeton 2:8 0,71
2 Diclometan : metanol 85 : 15 0,55
Dưới ánh sáng tử ngoại(λ= 254 nm)
Hiện với thuốc thử ceri sulfat
Tinh thể VLV3
Hình 3.6. Sắc kí đồ và hình ảnh tinh thể của VLV3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.7. Quy trình phân tách cắn etyl axetat và phân lập các chất sạch
F4 (0,72 g) ( F3.1 F3.2 F3.3 F3.4 VLV1 (40 mg) Kt. trong CH2Cl2/ MeOH VLV2 (50 mg) VLV3 (250 mg) Kt. trong MeOH / n-hexan Cắn etyl axetat (6,65 g) F1 (0,65 g) ( CC, Sephadex LH-20, MeOH
CC,Silica gel, n- hexan/ CH2Cl2 (1: 1), CH2Cl2 (100%), CH2Cl2/ MeOH(100/2 →100/4) F2 (1,57 g) ( F3 (3,20 g) ( CC, Silica gel, gradient n-hexan/CH2Cl2 (0 100%) F2.1 F2.2 F2.3 F2.4 F2.5 VLV5 (89 mg) Kt. trong MeOH/ CH2Cl2 VLV4 (20 mg) VLV6 (15 mg) Rửa bằng Axeton