Nghiên cứu thành phần hóa học của quả me rừng (phyllanthus emblica l)

ĐẶT VẤN ĐỀMe rừng (tên khoa học Phyllanthus emblica L. hay Emblica officinalis Gartn.)Trên thế giới, người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về loài này. Cụ thể,về thành phần hóa học, người ta đã phân lập từ cây Me rừng nhiều hợp chất nhưacid gallic, acid chebulinic, acid ascorbic, corilagin, geraniin và các chất khác 11.Về tác dụng dược lý, các chất này đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh họcđáng chú ý như kháng khuẩn, chống viêm, giải độc do các gốc tự do và các bức xạgây ra, đặc biệt chúng còn có tác dụng phòng chống một số dạng ung thư và kìmhãm sự phát triển của virus HIV (human immunodeficiency virus)6. Hiện nay, ởẤn Độ và Trung Quốc, người ta đã thương mại hóa nhiều sản phẩm từ loài này nhưbột pha uống bổ sung vitamin C, mỹ phẩm chống lão hóa cho da. Trong khi đó, cây Me rừng ở Việt Nam là loài cây mọc hoang, có thể phát triểntrong các vùng khí hậu khắc nghiệt, nắng nóng trên cả nước và đã được đưa vàotrồng thử nghiệm 5. Trong dân gian, quả Me rừng được dùng làm nước giải khát,ngoài ra trong y học cổ truyền, nước sắc quả Me rừng được dùng làm vị thuốc chữacảm mạo, viêm họng 1. Tuy nhiên, chúng lại chưa được nghiên cứu về thành phầnhóa học để có thể sử dụng trong điều trị theo y học hiện đại như thế giới. Do đó,nghiên cứu thành phần hóa học của cây Me rừng là nghiên cứu có ý nghĩa khoa họcvà là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về loài này. Chính vì vậy, chúng tôi thựchiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng (Phyllanthusemblica L.)” với mục tiêu: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng”.

NGHIÊM THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

HỌC CỦA QUẢ ME RỪNG

(PHYLLANTHUS EMBLICA L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

NGHIÊM THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

1 Viện Dược liệu

2 Bộ môn Dược học cổ truyền

rừng (Phyllanthus emblica L.)”, em xin gửi lời cảm ơn, lòng biết ơn và tri ân sâu

sắc đến sự giúp đỡ và tận tình chỉ bảo của TS Đỗ Thị Hà, người đã hướng dẫn và giúp em giải quyết những khó khăn gặp phải trong quá trình làm đề tài của mình một cách ân cần và chu đáo nhất

Em cũng vô cùng cảm ơn sự giúp đỡ của ThS Chử Thị Thanh Huyền, người

đã cung cấp cho em những lời khuyên, những kiến thức chuyên môn cần thiết nhất

để em có thể ứng dụng và áp dụng linh động vào thực tế trong quá trình làm đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược học cổ truyền, các thầy cô giáo phòng Đào tạo, đã động viên, khuyên bảo cũng như sắp xếp công việc, thời gian để em có thể hoàn thành khóa luận suôn sẻ, cũng như tất cả các anh chị khoa Hóa thực vật, Viện Dược Liệu đã luôn sát cánh cùng em trong quá trình làm việc của mình

Trong quá trình hoàn thành đề tài, em còn gặp nhiều thiếu sót, em rất mong các quý thầy cô, anh chị đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn thiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nghiêm Thị Thanh Thảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA CHI PHYLLANTHUS L 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật của chi Phyllanthus L 2

1.1.2 Sự phân bố chi Phyllanthus L 2

1.1.3 Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Phyllanthus L 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Công dụng 5

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA LOÀI ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA L 6

1.2.1 Vị trí phân loại 6

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Me rừng (Phyllanthus emblica L.) 6

1.2.3 Phân bố 7

1.2.4 Bộ phận dùng 7

1.2.5 Thành phần hóa học của loài Phyllanthus emblica L 7

1.2.6 Tác dụng dược lý và công dụng 15

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học 20

2.3.2 Phương pháp chiết xuất 20

2.3.3 Phương pháp phân lập chất 20

2.3.4 Các phương pháp xác định cấu trúc 22

3 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 23

3.2 Chiết xuất các phân đoạn từ quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.) 23

3.3 Định tính các phân đoạn dịch chiết quả Me rừng bằng sắc ký lớp mỏng 25

3.4 Phân lập các chất hóa học trong quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.) từ cặn ethyl acetat 26

3.4.1 Định tính dịch chiết ethyl acetat quả Me rừng bằng sắc ký lớp mỏng 26

3.4.2 Phân lập các chất trong phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột 26

3.5 Phân lập các chất hóa học trong quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.) từ dịch chiết nước 29

3.5.1 Phân lập các phân đoạn từ dịch chiết nước của quả Me rừng 29

3.5.2 Định tính dịch chiết nước quả Me rừng bằng sắc ký lớp mỏng 29

3.5.3 Phân lập các chất trong phân đoạn cồn 25° dịch chiết nước quả Me rừng 30

3.6 Nhận dạng chất phân lập 32

3.6.1 Hợp chất PE-2 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHỤ LỤC 4

AW Aceton – nước

Bảng 1.3 Công dụng của một số loài thuộc chi Me 6

Bảng 1.4 Các hợp chất trong cây Me rừng thuộc nhóm tannin 8

Bảng 1.5 Các chất hóa học trong cây Me rừng thuộc nhóm flavonoid 12

Bảng 1.6 Các acid hữu cơ trong cây Me rừng 14

Bảng 1.7 Tổng hợp tác dụng dược lý của một số hợp chất trong cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) 16

Bảng 3.1 Kết quả gộp các bình nón có sắc ký đồ tương tự nhau 27

Bảng 3.2 Kết quả gộp các phần có sắc ký đồ tương tự nhau từ phân đoạn cồn 25º 31 Bảng 3.3 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE-2 và quercetin 33

Bảng 3.4 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE002 và acid gallic 35

Bảng 3.5 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE003 và methyl gallat 36

Hình 3.2 Dược liệu quả Me rừng 24

Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ quả Me rừng 24

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính bằng phương pháp TLC cao cồn 96º, caocác phân đoạn n-hexan, cao EtOAc, cao nước của cao cồn 96° quả Me rừng 25

Hình 3.5 Sắc ký đồ định tính phân đoạn EtOAc dịch chiết quả Me rừng 26

Hình 3.6 Sắc ký đồ của PE-2, PE003 và cắn EtOAc với hệ dung môi DMW = 5:1:0,1 28

Hình 3.7 Sơ đồ phân lập chất PE-2, PE003 từ phân đoạn ethyl acetat quả Me rừng 28

Hình 3.8 Quy trình phân lập các phân đoạn từ cao nước quả Me rừng 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ định tính phân đoạn cồn 25° dịch chiết nước quả Me rừng 30

Hình 3.10 Sắc ký đồ của PE002 và cắn cồn 25° với hệ dung môi MW=1:3 31

Hình 3.11 Sơ đồ phân lập chất PE002 từ phân đoạn cồn 25º quả Me rừng 32

Hình 3.12 Công thức cấu tạo của PE-2 – quercetin 33

Hình 3.13 Công thức cấu tạo của PE002 – acid gallic 35

Hình 3.14 Công thức cấu tạo của PE003 – methyl gallat 36

Me rừng (tên khoa học Phyllanthus emblica L hay Emblica officinalis Gartn.)

Trên thế giới, người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về loài này Cụ thể,

về thành phần hóa học, người ta đã phân lập từ cây Me rừng nhiều hợp chất như acid gallic, acid chebulinic, acid ascorbic, corilagin, geraniin và các chất khác [11]

Về tác dụng dược lý, các chất này đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, chống viêm, giải độc do các gốc tự do và các bức xạ gây ra, đặc biệt chúng còn có tác dụng phòng chống một số dạng ung thư và kìm

hãm sự phát triển của virus HIV (human immunodeficiency virus)[6] Hiện nay, ở

Ấn Độ và Trung Quốc, người ta đã thương mại hóa nhiều sản phẩm từ loài này như bột pha uống bổ sung vitamin C, mỹ phẩm chống lão hóa cho da

Trong khi đó, cây Me rừng ở Việt Nam là loài cây mọc hoang, có thể phát triển trong các vùng khí hậu khắc nghiệt, nắng nóng trên cả nước và đã được đưa vào trồng thử nghiệm [5] Trong dân gian, quả Me rừng được dùng làm nước giải khát, ngoài ra trong y học cổ truyền, nước sắc quả Me rừng được dùng làm vị thuốc chữa cảm mạo, viêm họng [1] Tuy nhiên, chúng lại chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học để có thể sử dụng trong điều trị theo y học hiện đại như thế giới Do đó, nghiên cứu thành phần hóa học của cây Me rừng là nghiên cứu có ý nghĩa khoa học

và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về loài này Chính vì vậy, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng (Phyllanthus

emblica L.)” với mục tiêu: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng”

Nội dung chính của đề tài như sau:

- Thu hái mẫu nguyên liệu đầy đủ cành, lá, quả để thực hiện giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ quả Me rừng

- Đo phổ (MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA CHI PHYLLANTHUS L

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, cây Me rừng Phyllanthus

emblica L thuộc chi PhyllanthusL., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)[2].Theo một số

tác giả khác, chi Phyllanthus L còn được gọi là chi Me, thuộc về phân họ Me (Phyllanthoideae) trong họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)[6]

1.1.1 Đặc điểm thực vật của chi Phyllanthus L

Cây dạng thảo, dạng bụi hoặc gỗ nhỏ, đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc Lá đơn, nguyên, mọc cách; thường xếp thành 2 dãy trên các cành nhỏ, mảnh trông giống như một lá kép lông chim; cuống ngắn; có lá kèm Hoa mọc ở nách lá, đơn độc hoặc hợp thành chùm xim với 2-3 hoa hay nhiều hơn Hoa nhỏ, đơn tính; không tràng, đài 4-6 thùy Hoa đực có 2-6(-15) nhị; chỉ nhị rời hoặc hợp, bao phấn rời hoặc dính nhau, ngoại hướng, bầu tiêu giảm Hoa cái thường không có nhị; bầu thượng, có cuống hoặc không cuống, 3(-12) ô, mỗi ô 2 noãn, vòi nhụy mảnh, thường 3, rất ít khi nhiều hơn, rời hoặc dính nhau ở gốc Quả nang Hạt thường có

3 cạnh[6]

1.1.2 Sự phân bố chi Phyllanthus L

Chi Me (PhyllanthusL.) là một chi lớn, có trên 700 loài, phân bố chủ yếu ở

các nước nằm trong khu vực nhiệt đới Trên thế giới, hiện đã biết có khoảng 200 loài ở châu Mỹ, khoảng 100 loài ở châu Phi và 100 loài ở vùng Malesian Riêng Trung Quốc hiện đã biết khoảng 30 loài, phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam)[6].Trung tâm đa dạng và phong phú nhất của chi Me nằm trong khu vực kéo dài từ Ấn Độ đến các nước Đông Dương, Philippin và New Guinea.Ở châu Mỹ, miền nam Brazil cũng là một trung tâm đa dạng của chi Me với số loài tương đối phong phú[6]

Ở Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ (1992) đã mô tả và thống kê được 43 loài Gần đây Nguyễn Nghĩa Thìn (1995, 1998, 2003, 2007) đã ghi nhận có khoảng 45 loài,

quý hiếm còn ít được nghiên cứu và có vùng phân bố hẹp, chỉ gặp ở một vài địa phương trên đất nước ta[6]

1.1.3 Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Phyllanthus L

Cho đến nay đã có rất nhiều các tác giả trên thế giới nghiên cứu về thành

phần hóa học của các loài thuộc chi Me (PhyllanthusL.) như loài P acidus, P

urinaria hay loài P emblica… Kết quả cho thấy, các loài thuộc chi này chứa nhiều

các hợp chất thuộc nhóm triterpen, tannin, coumarin… Bảng 1.1 liệt kê chi tiết hơnthành phần hóa học của các loài này [11]:

Bảng 1.1 Các chất hóa học có trong một số loài thuộc chi Phyllanthus L

Loài Nhóm chất Hợp chất

P acidus Triterpen Lupeol, β-amyrin, phyllanthol

Lignan Phyllanthosid

P.amarus

Benzenoid Acid gallic, corillagin, acid 4-O-galloylquimic

Flavonoid Gallocatechin, rutin, quercetin-3-O-glucopyranosid

Tannin

Phyllanthusiin 1,6-digalloylglucopyranose, geraniin, amariin, furosin, acid geraniinic, acid amariinic, elaeocarpusin

P emblica

Alcaloid Zeatin, zeatin nucleotid, zeatin ribosid

Benzenoid Acid chebulic, acid chibulinic, corilagin,

glucose-3-6-di-O-galloyl, acid gallic, gluco-gallin, ethyl gallat Coumarin Acid ellagic

Diterpen Giberellin A-1,3,4,7,9

Flavonoid Leucodelphinidin, rutin

Sterol β-sitosterol

P

reticulatus

Benzenoid Acid pyrogallic

Coumarin Acid ellagic

Benzenoid Acid gallic

Coumarin Acid trimethylester dehydrochebulic, acid

methylbrevifolin carboxylat ellagic

Flavonoid Astragalin, quercetin, quercitrin, isoquercitrin, rutin,

kaempferol Tanin Geraniin

Ester Montanoic acid ethyl ester

Phytallat Phyllester

Sterol Daucosterol, β-sitosterol

Triterpen Lupeol acetat, β-amaryl

1.1.4 Tác dụng dược lý

Năm 1998, Calixto João B và cộng sựđã thấy rằng các hợp chất flavonoid, phenol, tannin và steroid có trong hầu hết các loài thuộc chi Phyllanthus L.đều có

tác dụng giảm đau thông qua cơ chế ức chế thần kinh trung ương Loài P niruricó

tác dụng điều trị sỏi thận trên các đối tượng là người, chuột (đã được cấy sỏi trước đó),tế bào Medullar ống thận chó thông qua cơ chế ngăn cản sự gia tăng của các tinh thể calcium oxalat, giảm hình thành các khối sỏi mới, giúp làm tăng lượng nước tiểu và độ thanh thải creatinin.Các nghiên cứu thử nghiệm trên người và

động vật đều cho thấy các hợp chất nhóm tannin thủy phân phân lập từ loài P

amarus có tác dụng ức chế mạnh virus viêm gan B, làm giảm sự có mặt kháng

nguyên của virus viêm gan B Dịch chiết methanol của loài P emblica và một số

hợp chất hóa học của loài này như putranjivain A, các flavonoid và acid digallic khác thể hiện tác dụng ức chế enzym phiên mã ngược của virus HIV Ngoài ra, rất

bảng 1.2 [11]

Bảng 1.2 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Phyllanthus L

Tên khoa học Tác dụng dược lý

Phyllanthus

sellowianus

 Chống co thắt cơ trơn, được thử nghiệm trên hồi tràng chuột lang, cơ trơn tử cung chuột nhắt và cơ vòng niệu quản chó

Phyllanthus niruri

 Giúp điều trị các bệnh sỏi thận, nhiễm trùng sinh dục, viêm gan B, kiểm soát các bệnh lý đường hô hấp, đái tháo đường

 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy P.niruri

cótác dụng làm giảm co thắt cơ trơn ở hồi tràng chuột lang, bàng quang, tử cung chuột nhắt, niệu quản và cơ trơn mạch máu chó

Phyllanthus urinaria  Tác dụng hạ đường huyết

Bảng 1.3 Công dụng của một số loài thuộc chi Me

Toàn cây Nguồn cung cấp tannin

Chó đẻ răng cưa (P.urinaria), Me

rừng (P emblica), Phèn đen (P

reticulatus), Chùm ruột (P acidus)

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA LOÀI ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA L

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Me rừng (Phyllanthus emblica L.)

Cây nhỡ, phân cành nhiều, cao 5-7 m, có khi hơn Cành nhỏ mềm, có lông

Lá nhỏ thuôn hẹp, dài 9-10 mm, rộng 2-3 mm, xếp xít nhau thành 2 dãy, nom như một lá kép lông chim, mặt trên màu lục xám, mặt dưới nhạt hơi hồng; lá kèm rất nhỏ [1]

màu vàng gồm nhiều hoa đực và ít hoa cái; hoa cái có cuống ngắn hơn hoa đực nhiều, có 6 lá đài dày hơn, bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn [1]

Quả thịt hình cầu, to bằng quả táo ta, có khía rất mờ, vị chua chát, ăn được; hạt màu nâu đỏ [1]

Mùa hoa quả: Tháng 5 - 10 [1]

Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa, khắp các vùng núi (dưới 1000m) và trung du thuộc nhiều tỉnh từ Bắc vào Nam, nhất là các tỉnh miền núi trung du phía Bắc

Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn và có thể sống được trên nhiều loại đất, kể

cả ở vùng đồi khô cằn, đất nhiều sỏi đá và nghèo dinh dưỡng Cây rụng lá vào mùa đông Sau mùa ra lá non mới đến mùa hoa, ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11, số lượng hoa quả trên 1 cây khá nhiều, tái sinh tự nhiên bằng hạt[1]

1.2.4 Bộ phận dùng

Đến nay quả, lá, vỏ cây, rễ của cây Me rừng đều đã được dùng để chữa bệnh Trong đó, quả chín đã phơi khô được ghi vào Dược điển Trung Quốc năm 1977 (Bản in tiếng Anh) [1]

1.2.5 Thành phần hóa học của loài Phyllanthus emblica L

Cây Me rừng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu, theo các kết quả đã xác định, thành phần hóa học của Me rừng gồm có các hợp chất:

Flavonoid, carbohydrat, acid phenolic, tannin, nhựa mủ… Cụ thể được tổng hợp ở

Cấu trúc hóa học

Tài liệu tham khảo

Acid gallic

Quả,

lá, cành

[20], [13], [22]

Acid chebulinic Quả [20]

Emblicanin A Quả [10]

Rutin Lá, cành [22]

1.2.5.3 Các acid hữu cơ

Bảng 1.6 Các acid hữu cơ trong cây Me rừng

Tên hợp chất Bộ phận

Tài liệu tham khảo

1.2.6.1 Tác dụng dược lý

Đến nay, tác dụng dược lý của cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.)đã được

nghiên cứu khá phong phú và đa dạng Trong số đó phải kể đến một số nghiên cứu tác dụng dược lý của các hợp chất có giá trị quan trọng trong quả Me rừng như phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, emblicanin A, emblicanin B, acid gallic…

Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư của phyllaemblicin B và phyllaemblicin C đã được công bố bởi Zhang Y J năm 2004 [23]

Năm 2005, Duan W và cộng sự đã công bố tác dụng ngăn cản quá trình xơ

vữa động mạch của corilagin và 1,6-di-O-galloyl-β-D-glucose qua cơ chế ức chế sự

oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp [12]

Năm 2011, Xiang Y đã chứng minh 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose có tác dụng chống HSV (herpes simplex virus) cả loại 1 và loại 2 bằng cách bất hoạt

virus ngoại bào và ức chế sinh tổng hợp virus trong tế bào vật chủ [19]

Năm 2013, nhóm tác giả thuộc trường đại học Baghdad đã công bố tác dụng

kháng khuẩn chống lại tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, trực khuẩn mủ xanh

Pseudomonas aeroginosa, trực khuẩn gây bệnh đường hô hấp Klebsiella của acid

gallic, acid ellagic, quercetin, acid chebulinic và acid chebulagic [24]

Ngoài ra, nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới còn công bố các kết quả nghiên cứu khác nhau chứng minh tác dụng dược lý của các chất trong cây Me rừng, các kết quả này được thể hiện ở bảng 1.7

Bảng 1.7 Tổng hợp tác dụng dược lý của một số hợp chất trong cây Me rừng

(Phyllanthus emblica L.)

Tài liệu tham khảo

Chống oxy hóa, tạo phức chelat với các kim loại màu,

ức chế nguyên tố Fe2+ là nguyên nhân gây peroxy lipid [15]

Ni2+tốt hơn so với lượng tương đương vitamin C dùng riêng

[6]

1.2.6.2 Công dụng

Hầu hết các bộ phận của cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) đều được sử

dụng trong dân gian để chữa bệnh Trong các tài liệu về các bài thuốc và công dụng của các loài cây ở Việt Nam, các thầy thuốc đã sử dụng cây Me rừng hết sức đa dạng

Theo GS.TS Lã Đình Mỡi và cộng sự, lá của cây Me rừng được sử dụng để chữa phù thũng, viêm da, mẩn ngứa, hạt của quả được dùng để chữa hen, viêm cuống phổi và thiểu năng mật, rễ của loài này được dùng để chữa huyết áp cao, đau thượng vị, viêm ruột và lao hạch bạch huyết [6]

Ở Indonesia, nhân dân dùng nước sắc quả Me rừng khô trị tiêu chảy ra máu, đắp thịt quả lên đầu chữa nhức đầu, chóng mặt và sốt Ở Mianma và Thái Lan, dịch

ép quả Me rừng nhuận tràng và chữa viêm mắt; nước sắc lá trị sốt và bệnh da Vỏ rễ

là thuốc làm săn Ở Lào, Campuchia, quả Me rừng trị tiêu chảy, đau bụng và những rối loạn khác ở bụng Ở Ấn Độ, quả Me rừng tươi hoặc phơi khô được dùng chữa bệnh Scorbut, đái tháo đường, sốt, viêm phế quản, ho và làm thuốc lợi tiểu[1]

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

- Dung môi: n-hexan, ethyl acetat, aceton, diclometan, metanol, nước, cồn…

theotiêu chuẩn dược điển Việt Nam IV

- Tủ sấy dược liệu Memmert, Binder-FD115

- Cân phân tích PRESICA 262SMA-FR

- Cân kĩ thuật PRECISA BJ 610C

- Máy cất quay chân không BUCHI ROTAVAPOR 220, ROTAVAPOR

-Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart-SMP3

- Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance 500 MHz

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR): Impac 410-Nicolet FT-IR

- Máy đo phổ khối (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu hái mẫu nguyên liệu đầy đủ cành, lá, quả để thực hiện giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ quả Me rừng

- Đo phổ (MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học

Mẫu tiêu bản tươi (có đủ tiêu chuẩn để định loại bao gồm cơ quan sinh sản

(hoa), và cơ quan sinh dưỡng (cành non, lá) cùng các thông tin ghi chép tại thực địa) thu hái tại Cao Bằng được gửi sang Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam để giám định tên khoa học

2.3.2 Phương pháp chiết xuất

Chiết nóng quả Me rừng (thái nhỏ, sấy khô) với cồn 96° Sau đó, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cao đặc Hòa tan cao đặc trong nước, chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần Sau đó gộp dịch

chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn các phân đoạn tương ứng 2.3.3 Phương pháp phân lập chất

Sử dụng các phương pháp sắc ký như: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột phathường (CC), sắc ký cột pha đảo, sắc ký cột trao đổi ion

F254(Merck) Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một số trong số các dung

môi thường dùng như: Diclomethan, methanol, aceton, n-hexan, ethyl acetat, nước Sắc ký cột pha thường với pha tĩnh là silica gel, rửa giải bằng các dung môi n-

hexan, ethyl acetat, diclomethan, methanol, nước

Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là silica gel C18, rửa giải bằng các dung môi methanol, aceton, nước

- Tiến hành cho chất lên cột trước khi chạy sắc ký:

Tùy vào lượng chất và dạng chất mà có thể chọn một trong hai cách:

+Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: Hòa tan hoàn toàn chất vào một lượng tối thiểu dung môi thích hợp rồi dùng pipet hút chất và nhẹ nhàng bơm lên đầu cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt

+Nạp mẫu chất ở dạng bột khô: Hòa tan chất vào một lượng tối thiểu dung môi thích hợp rồi tẩm lên một lượng tối thiểu silica gel, sau đó để bay hơi hết dung môi đến khô thu được dạng bột khô tơi

-Chạy sắc ký: Tiến hành chạy cột với hệ dung môi lựa chọn Hứng dịch rửa giải vào những bình nón (ống nghiệm) với lượng thích hợp, sau đó chấm sắc ký lớp mỏng để tiến hành gộp các phân đoạn giống nhau

2.3.4 Các phương pháp xác định cấu trúc

Các hợp chất tinh khiết sau khi phân lập được hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó được xác định cấu trúc bằng sự kết hợp các kết quả dữ liệu phổ như phổ khối (ESI-MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) Quá trình đo phổ được thực hiện tại Viện Hóa học - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam và Đại học Chungnam – Hàn Quốc, sử dụng các máy đo phổ: Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance 500 MHz, máy đo phổ hồng ngoại (IR): Impac 410-Nicolet FT-IR,máy đo phổ khối (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II

3.1.Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu: Quả hình cầu, có khía mờ, đường kính 15-20 mm, mọng nước, màu vàng xanh, quả chín màu vàng nhạt Vị chua, hơi chát Hạt cứng có 3 cạnh màu nâu Lát cắt ngang quả thấy hạt chia thành 3 phần, mỗi phần có 2 noãn

Hình 3.1 Quả Me rừng

Mẫu nghiên cứu được PGS TS Trần Huy Thái và PGS TS Vũ Xuân

Phương ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định tên khoa học là Phyllanthus

emblica L họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Phụ lục 1)

3.2 Chiết xuất các phân đoạn từ quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.)

3kg quả Me rừng tươi sau khi được thái nhỏ và sấy khô được chia làm 3 phần bằng nhau, mỗi phần 1kg Đem mỗi phần chiết nóng trong cồn ethanol 96° ở nhiệt độ 80ºC trong thời gian 3 giờ × 3 lần Lọc các dịch chiết, đem gộp rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1,15kg cao cồn Hòa cao trong 1 lít nước,

chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, EtOAc tỉ lệ 1:1, lắc 3 lần, gộp dịch chiết,

thu được dịch chiết các phân đoạn Sau đó đem cất thu hồi dung môi các dịch chiết

đó dưới áp suất giảm, thu được các cắn n-hexan (12,3 g), ethyl acetat (355 g), nước

(382,19 g) Sơ đồchiết xuất các phân đoạn quả Me rừng được tóm tắt như sau:

Hình 3.2 Dược liệu quả Me rừng

Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ quả Me rừng

Mục đích: Khảo sát các phân đoạn quả Me rừng bằng sắc ký lớp mỏng để lựa

chọn phân đoạn có nhiều vết đậm, Rf khác nhau, giúp thuận lợi cho quá trình tách các chất bằng sắc ký cột

Tiến hành: Hòa tan lượng nhỏ cặn n-hexan quả Me rừng trong 1ml

cloroform Hòa tan lượng nhỏ cao cồn 96º, cặn ethyl acetat, cặn nước trong 1 ml methanol Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng với bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254

(Merck) đã hoạt hóa với các hệ dung môi khác nhau trong đó hệ dung môi Cloroform - MeOH – Nước = 3:1:0.1 cho kết quả tốt nhất được thể hiện trên hình:

Từ kết quả khảo sát bằng TLC phân đoạn n-hexan, phân đoạn ethyl acetat,

phân đoạn nước và cao cồn 96° dịch chiết Me rừng, chúng tôi thấy: Cặn ethyl acetat

có nhiều vết đậm, bắt màu ánh sáng tử ngoại, hiện vết khá gọn, các vết này có Rf

cách xa nhau trên bản mỏng; cặn nước hiện lên 1 vết chính, bắt màu ánh sáng tử ngoại Chính vì vậy, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước được chọn để tiến hành phân lập các hợp chất của quả Me rừng

trong cồn, t°

UV 254 nm

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính bằng phương pháp TLC cao cồn 96º, caocác phân

đoạn n-hexan, cao EtOAc, cao nước của cao cồn 96° quả Me rừng