3 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.5.3. Phân lập các chất trong phân đoạncồn 25° dịch chiết nước quả Me rừng
Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập được chất trong phân đoạn, dựa trên sự hấp phụ của các chất vào silicagel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
+ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 33,89 g cặn của phân đoạn cồn 25°với lượng tối thiểu dung môi methanol trong bình cầu, thêm 34g silica gel, lắc đều và để hấp phụ. Cất quay dưới áp suất giảm đến khô hoàn toàn. Sau đó, nghiền hỗn hợp rắn thu được trong cối sứ đến thể chất tơi xốp, đồng đều, không vón cục. Cảm quan hỗn hợp chất và silicagel khô tơi, màu vàng đồng đều.
+ Chuẩn bị cột sắc kí: Cân 340g silicagel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm 1 líthỗn hợp dung môi diclomethan – methanol – nước tỉ lệ 3:1:0,1 (tt/tt) khuấy đều cho hết bọt khí. Để yên 12 giờ. Rót từ từ hỗn dịch này lên cột, tráng dung môi nhiều lần để đưa hết silicagel lên cột. Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời thêm dung môi phía trên, làm nhiều lần để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, đưa hỗn hợp chất và silicagel đã chuẩn bị ở trên lên cột. Cho lên phía trên một lớp silicagel mỏng để tránh chất khuếch tán ngược.
UV 254 nm UV 365 nm H2SO4 10% trong cồn, t°
(tt/tt). Hứng các phân đoạn bằng bình nón 100ml, kiểm tra các phân đoạn này bằng SKLM, gộp các phần có sắc kí đồ tương tự nhau, thu được 3 phân đoạn.
Bảng 3.2. Kết quả gộp các phần có sắc ký đồ tương tự nhau từ phân đoạncồn 25º
- Phân đoạn N-1 tiến hành phân lập sắc kí cột với hệ dung diclomethan – methanol – nước tỉ lệ 2:1:0,1 (tt/tt) thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn N-1-1 phân lập sắc kí cột pha đảovới hệ dung môi methanol - nước tỉ lệ 1:4 (tt/tt) thu được 25 mg chất màu trắng kí hiệu PE002.
- Lấy 1 lượng nhỏ PE002 thu được hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH và tiến hành sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng GF254 (Merck) với hệ dung môi methanol - nước tỉ lệ 1:3. PE002 bắt màu UV254 nm, không bắt màu với UV 365 nmvà PE002 hiện sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng.
Phân đoạn Gộp bình nón Khối lượng (g)
N-1 1-24 9,42
N-2 25-36 3,36
N-3 37-54 10,54
UV 254 nm
Hình 3.11. Sơ đồ phân lập chất PE002 từ phân đoạn cồn 25º quả Me rừng 3.6. Nhận dạng chất phân lập
3.6.1.Hợp chất PE-2
Tinh thể hình kim màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 315-316°C. Hiện màu nâu ở UV 254 nm và UV 365 nm. Hiện màu vàng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng. Phổ hồng ngoại của PE-2 có các đỉnh hấp thụ cực đại tại
υmax3379 cm-1 đặc trưng của nhóm OH; υmax 1657 cm-1 đặc trưng của nhóm C=O;
υmax1028 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-C. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR thể hiện các tín hiệu ở 6,17 (1H, d, J=2,0 Hz), 6,394 (1H, d, J=2,0 Hz), 6,77 (1H, d, J=2,0 Hz), 7,00 (1H, d, J=2,0 Hz), 7,54 (1H, dd, J=2,0;8,5 Hz) và 12,46 (s, proton của liên kết hydro kiềm nối giữa –OH tại C-5 và nhóm carbonyl của C-4) cho thấy khung cơ bản của flavonol với 2 nhóm thế -OH kề nhau trên vòng thơm thứ hai. Phổ 13C cho thấy sự xuất hiện của 15 tín hiệu carbon trong đó có 1 tín hiệu của nhóm carbonyl carbon ở δC175,8 (C-3), 7 tín hiệu carbon bậc 4 ở δC 146,8 (C-2), 135,7 (C-3), 160,7 (C-5), 163,9 (C-7), 156,2 (C-9), 145,1 (C-3'), 147,7 (C-4'); 2 tín
olefin dạng =C- ở vị trí C-6, C-8, C-3', C-5', C-6' [δC 98,2; 93,4; 115,6; 115,1; 120,0]. Phổ khối của hợp chất PE-2 ghi theo chế độ ESI (-) (Phụ lục 3) cho pic phân tử [M-H]-ion ở m/z 301. Từ các dữ liệu phổ 13C và ESI-MS cho phép xác định công thức phân tử chất này là C15H10O7, (giá trị phổ khối theo tính toán 302). Từ những dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã công bố về hợp chất quercetin (Bảng 3.3), sơ bộ kết luận PE-2 được nhận dạng là quercetin.
Công thức cấu tạo của PE-2 – quercetin (Hình 3.12)
Hình 3.12. Công thức cấu tạo của PE-2 – quercetin
Dữ liệu phổ NMR của chất PE-2 được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE-2 và quercetin
Vị trí Phổ NMR của PE-2 (CDCl3/MeOD) Phổ NMR của quercetin (CDCl3/MeOD)[3] δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) C2 146,8 146,0 C3 135,7 135,6 C4 175,8 176,5 C5 160,7 161,0 C6 98,2 6,17 (1H, d, 2,0 Hz) 98,2 6,20 (1H, d, 2,0 Hz) C7 163,9 165,0 C8 93,4 6,39 (1H, d, 2,0 Hz) 93,5 6,50 (1H, d, 2,0 Hz) 7 8 9 10 6 4 2 3 5 1' 2' 3' 4' 5' 6'
C9 156,2 152,6 C10 103,0 103,0 C1' 122,0 122,0 C2' 115,6 7,66 (1H, d, 2,0 Hz) 117,1 7,80 (1H, d, 2,0 Hz) C3' 145,1 140,0 C4' 147,7 146,2 C5' 115,1 6,88 (1H, d, 2,0 Hz) 115,6 7,00 (1H, d, 2,0 Hz) C6' 120,0 7,53 (1H, dd, 2,0;8,5 Hz) 120,0 7,70 (1H, dd, 2,0;8,3 Hz) 3.6.2. Hợp chất PE002
Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 236-237°C. Hiện màu nâu ở UV 254 nm, không hiện màu ở UV 365 nm. Hiện màu nâu đen sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng.
Phổ hồng ngoại của PE002 có các đỉnh hấp thụ cực đại tại υmax3496, 3282 cm-1 đặc trưng của nhóm OH; υmax1668 cm-1 đặc trưng của nhóm C=O, υmax1426, 1438, 1541 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR thể hiện một tín hiệu đơn ở δH 7,08 (2H, s) đặc trưng cho proton ở vị trí H-2 và H-6. Phổ 13C cho thấy sự có mặt của 1 tín hiệu của nhóm carbonyl carbon ở δC170,6 (C-7); 3 tín hiệu carbon bậc 4 ở δC122,0 (C-1), 139,7 (C-4) và 146,4 (C-3,5); 1 tín hiệu carbon bậc 3 của hai carbon ở vị trí 2 và 6 [δC 110,5]. Hợp chất PE002 là một dẫn chất của acid benzoic có 3 nhóm thế OH ở vị trí 3, 4 và 5. Từ những dữ liệu phổ thu được, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã công bố về hợp chất acid gallic (Bảng 3.4), sơ bộ kết luận PE002 được nhận dạng là acid 3,4,5-trihydroxybenzoic hay acid gallic có công thức phân tử là C7H6O5.
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của PE002 – acid gallic
Dữ liệu phổ NMR của chất PE002 được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE002 và acid gallic
Vị trí
Phổ NMR của PE002 (CDCl3/MeOD)
Phổ NMR của acid gallic (CDCl3/MeOD)[7] δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) C1 122,0 122,1 C2 110,5 7,09 (1H, s) 110,3 7,08 (1H, s) C3 146,4 146,4 C4 139,7 139,5 C5 146,4 146,4 C6 110,5 7,09 (1H, s) 110,3 7.08 (1H, s) C7 170,6 170,5 3.6.3. Hợp chất PE003
Tính chất của PE003: Tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 201- 202ºC.Hiện màu nâu ở UV 254 nm và UV 365 nm. Hiện màu nâu sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng. Phổ hồng ngoại của PE003 có các đỉnh hấp thụ cực đại tại υmax3410, 3296 cm-1 đặc trưng của nhóm OH; υmax1677 cm-1 đặc trưng của nhóm C=O; υmax1438, 1541 và 1613cm-1đặc trưng của dây nối đôi C=C thơm. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR thể hiện một tín hiệu đơn ở δH 7,15 (2H, s) đặc trưng cho 2 proton vòng thơm đối xứng ở vị trí H-2 và H-6 và một tín hiệu proton của nhóm methoxyδH 3,82 (3H, s). Phổ 13C và DEPT-NMR cho thấy sự có mặt của 1 tín hiệu của nhóm carbonyl carbon ở δC166,8 (C-7); ba carbon thơm bậc 4 thế bởi
1 2 3 4 5 6 7
nhóm hydroxy ở vị trí 3, 4 và 5 có giá trị chuyển dịch hóa học tương ứng δC 145,6 (C-3), δC 138,3 (C-4) vàδC 145,6 (C-5); một tín hiệu carbon thơm bậc 4 tại δC 121,3 (C-1) và hai tín hiệu carbon methin thơm đối xứng tại δC 109,4 (C-2 và C-6). Các tín hiệu phổ ghi nhận được của hợp chất PE003 tương tự các dữ liệu phổ của hợp chất methyl gallat (Bảng 3.5).Do vậy, sơ bộ kết luận PE003 được nhận dạng là methyl gallat. Công thức cấu tạo C8H8O5.
Công thức cấu tạo của PE003 – methyl gallat (Hình 3.14):
Hình 3.14. Công thức cấu tạo của PE003 – methyl gallat
Dữ liệu phổ NMR của chất PE003 được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của PE003 và methyl gallat
Vị trí
Phổ NMR của PE003 (CDCl3/MeOD)
Phổ NMR của methyl gallat (CDCl3/MeOD)[14] δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) C1 121,3 120,3 C2 109,4 7,15 (1H, s) 108,9 7,00 (1H, s) C3 145,6 145,3 C4 138,3 138,8 C5 145,6 145,3 C6 109,4 7,15 (1H, s) 108,9 7,00 (1H, s) C7 166,8 167,9 OMe 3,82 (3H, s) 3,80 (3H, s) CH3 1 2 3 4 5 6 7
Hiện nay trên thế giới,một số lượng lớn các nghiên cứu về thành phần hóa học của quả Me rừng đã được thực hiện, cho nhiều phát hiện mới về các hợp chất trongquả Me rừng. Tuy nhiên tại Việt Nam, các nghiên cứu về quả Me rừng còn khá ít, trong đó nghiên cứu về thành phần hóa học của quả Me rừng hiện chưa có. Các kết quả trong khóa luận này là những kết quả về nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng đầu tiên tại Việt Nam và sau khi tham khảo các tài liệu, các kết quả này phù hợp với các kết quả đã được nghiên cứu trên thế giới trước đó.
Ở khóa luận này, chúng tôi mới chỉ phân lập được 3 chất sạch từ dịch chiết ethyl acetat, và dịch chiết nước của quả Me rừng có kí hiệu là PE-2, PE002 và PE003. Cấu trúc của chúng đã được xác định là quercetin (PE-2), acid gallic (PE002) và methyl gallat (PE003) dựa trên sự kết hợp các dữ liệu phổ NMR và phổ khối lượng (ESI-MS).
Trong 3 chất đã phân lập được thì cả quercetin, acid gallic và methyl gallat đều là những chất có tác dụng sinh học rất tốt. Như acid gallic là chất có tác dụng kháng khuẩn, đối kháng các loại vi khuẩn gây ra bệnh tật cho cá nhân mỗi người cũng như dịch bệnh trên toàn cầu như tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh… Quercetin lại có tác dụng rất tốt trên hệ thống kênh Calci trong cơ thể, có thể ứng dụng để điều trị các bệnh tim mạch và nội tiết… Methyl gallat cùng với acid gallic là 2 chất có tác dụng chống oxy hóa trong cơ thể, ngăn cản lại quá trình gây độc của các nguyên tố kim loại cũng như các gốc tự do có trong cơ thể do quá trình làm việc lao động hàng ngày.
Như vậy, rất có thể sự có mặt của các pseudotanin trong quả Me rừng cùng với các acid hữu cơ khác liên quan đến tác dụng nổi bật đang được tìm kiềm trong cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) trong thời gian gần đây. Có thể thấy, nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng tại Việt Nam mở ra một hướng nghiên cứu rất có giá trị trong nghành y học của nước nhà. Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học cuả cây Me rừng là rất quan trọng đối với việc làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh của cây Me rừng.
Hơn thế nữa, nghiên cứu thành phần hóa học của cây Me rừng còn giúp chúng ta có thể chứng minh được kết quả của các công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố trước đây ở nhiều vùng trên thế giới, qua đó có thể so sánh các kết quả đó với thành phần hóa học thực tế nghiên cứu của quả Me rừng tại Việt Nam. Đến nay, theonhư các tác giả đã công bố về thành phần hóa học của loài này, có nhiều tranh cãi và mâu thuẫn trong các tài liệu khác nhau. Chúng ta hiểu rằng đích đến cuối cùng của nghiên cứu thành phần hóa học của thực vật, cây cỏ bao giờ cũng là tìm ra những giá trị tiềm ẩn của chúng, những thứ có thể giúp tăng chất lượng cuộc sống cũng như sức khỏe và tuổi thanh xuân của con người. Có tác giả sau khi nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng thì cho rằng hoạt tính chống oxy hóa cao của loài Me rừng là do trong thành phần có chứa 2 chất có hoạt tính cao đó là Emblicanin A và emblicanin B. Cũng theo tác giả đây là 2 thành phần chính của cây có thể đem lại giá trị thực tiễn cao áp dụng cho khoa học và lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Một số tác giả thế hệ sau cũng chứng minh được sự có mặt của 2 tannin này [17]. Tuy nhiên, sau đó có nhiều nghiên cứu của các tác giả khác lại cho rằng, không tìm thấy dấu vết của chất emblicanin A và emblicanin B trong quả Me rừng, họ tìm thấy nhiều thành phần khác cũng có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thải trừ gốc tự do cho cơ thể và cho rằng các thành phần đó mới tạo ra tác dụng chống oxy hóa của Me rừng [16]. Chính vì những mâu thuẫn trong các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới như trên, việc nghiên cứu thành phần hóa học của loài Me rừng là thực sự cần thiết. Vì loài Me rừng được phân bố khá rộng rãi hơn nữa lại thích nghi rất tốt trên lãnh thổ nước ta. Với nguồn tài nguyên phong phú và dồi dào như loài Me rừng ở nước ta hiện nay, đặt ra vấn đề cần phải xác thực giá trị của loài Me rừng mọc hoang tại nhiều vùng khác nhau dọc khắp các vùng miền trên lãnh thổ. Có như vậy mới có thể tìm ra được những bí ẩn còn tiềm tàng, ẩn chứa nhiều giá trị to lớn đối với sức khỏe con người và kinh tế đất nước.
Kết luận
- Đã xác định được mẫu nghiên cứu có tên là Me rừng, Chùm ruột núi (Phyllanthus emblica L.) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
- Đã phân lập được quercetinvà methyl gallat từ dịch chiết ethyl acetat, acid gallic từ dịch chiết nước của quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.)
- Đã nhận dạng được cấu trúc hóa học của 3hợp chất phân lập từ quả Me rừng bằng các phương pháp phổ kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã được công bố là quercetin, acid gallic và methyl gallat.
Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng để xác định sự có mặt của một số hợp chất có hoạt tính sinh học cao như emblicanin A, emblicanin B… và các chất có thể dùng làm dấu vân tay hóa học và chất đối chiếu.
- Xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng các chất có hàm lượng cao trong dược liệu làm cơ sở cho xác định tiêu chuẩn dược liệu và cao.
- Tiến hành thử hoạt tính in vitro đối với những chất là mới được phân lập từ loài này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, tr. 260-262.
2. Bộ Y Tế (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr. 266, 389-395.
3. Nguyễn Văn Đậu, Lê Ngọc Thức (2006), "Đóng góp vào việc nghiên cứu hóa thực vật cây chè đắng (Ilex kaushue S.Y.Hu (Aquifoliaceae))", Tạp chí khoa học ĐHQGHN, KHTN & CN, XXII(1,2006), tr. 34-38.
4. Phạm Hữu Điển, Lê Thị Anh Đào (2004), "Chiết tách Lupeol từ lá Me rừng",
Hóa học và ứng dụng, 10, tr. 20-22.
5. Mạc Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh thái và trồng thử nghiệm cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) tại trạm đa dạng sinh học Mê Linh - Vĩnh Phúc, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, tr. 53- 72.
6. Lã Đình Mỡi và cs (2009), Tài nguyên thực vật Việt Nam-Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 220-224.
7. Nguyễn Trung Nhân, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Thị Thanh Mai (2012), "Nghiên cứu thành phần hóa học cao n-hexan của trái cây xa kê Artocarpus altilis (parkinson) Fosberg, họ Dâu tằm (moraceae)", Tạp chí phát triển KH&CN, 14(T5-2011), tr. 43-48.
8. Hoàng Thị Sản (2012), Phân loại học thực vật, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr. 124-127.
Tài liệu nước ngoài
9. Barthakur N. N., Arnold N. P. (1991), "Chemical analysis of the emblic (Phyllanthus emblica L.) and its potential as a food source", Scientia Horticulturae, 47(1–2), pp. 99-105.
"Antioxidant activity of active tannoid principles of Emblica officinalis
(amla)", Indian J Exp Biol, 37(7), pp. 676-80.
11. Calixto J. B., Santos A. R., Cechinel Filho V., Yunes R. A. (1998), "A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential", Med Res Rev, 18(4), pp. 225-58. 12. Duan W., Yu Y., Zhang L. (2005), "Antiatherogenic effects of Phyllanthus
emblica associated with corilagin and its analogue", Yakugaku Zasshi, 125(7), pp. 587-91.
13. El-Desouky S. K., Ryu S. Y., Kim Y. K. (2008), "A new cytotoxic acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L.", Nat Prod Res, 22(1), pp. 91-5.
14. Liu Xiaoli, Cui Chun, Zhao Mouming, Wang Jinshui, Luo Wei, Yang Bao,