3 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4.2. Phân lập các chất trong phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột
Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập được chất trong phân đoạn, dựa trên sự hấp phụ của các chất vào silicagel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
UV 254 nm UV 365 nm H2SO4 10% trong cồn, t°
+ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 300 g cặn của phân đoạn ethyl acetat với lượng tối thiểu dung môi methanol trong bình cầu, thêm 300 g silica gel (tỉ lệ 1:1 (kl/kl)), lắc đều và để hấp phụ. Cất quay dưới áp suất giảm đến khô hoàn toàn. Sau đó, nghiền hỗn hợp rắn thu được trong cối sứ đến thể chất tơi xốp, đồng đều, không vón cục. Cảm quan hỗn hợp chất và silicagel khô tơi, màu vàng đồng đều.
+ Chuẩn bị cột sắc kí: Cân 1000g silicagel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm 1lítdung môi diclometan, khuấy đều cho hết bọt khí. Để yên 12 giờ. Rót từ từ hỗn dịch này lên cột, tráng dung môi nhiều lần để đưa hết silicagel lên cột. Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời thêm dung môi phía trên, làm nhiều lần để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, đưa hỗn hợp chất và silicagel đã chuẩn bị ở trên lên cột. Cho lên phía trên một lớp silicagel mỏng để tránh chất khuếch tán ngược.
+ Giải hấp phụ: Bằng hệ dung môi diclomethan – methanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực 50:1 đến 1:1 (tt/tt). Hứng các phân đoạn bằng bình nón 100ml, kiểm tra các phân đoạn này bằng SKLM, hệ dung môi khai triển CH2Cl2 – MeOH = 3:1 (tt/tt), quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ1= 254 nm, λ2= 365nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng.Gộp các phần có sắc ký đồ tương tự nhau, thu được 5 phân đoạn:
Bảng 3.1. Kết quả gộp các bình nón có sắc ký đồ tương tự nhau Phân đoạn Gộp các bình nón Khối lượng (g)
E-1 1 -15 40,34
E-2 16 -19 20,42
E-3 20 2,32
E-4 21 - 23 30,46
E-5 24 -27 50,62
- Tiến hành phân lập phân đoạn E-3bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : nước với tỉ lệ 1:1 thu được 20mg chất màu vàng kí hiệu PE-2.
- Phân đoạn E-2tiến hành phân lập sắc ký cột pha thường với hệ dung môi diclomethan – methanol tăng dần độ phân cực từ 20:1-5:1 (tt/tt) thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn E-2-3 (3,2g) phân lập tiếp bằng sắc kí cột pha đảo với hệ dung môi aceton - nước tỉ lệ 1:1 (tt/tt) thu được 30 mg chất màu trắng kí hiệu PE003. - Lấy 1 lượng nhỏ chất PE-2, PE003 thu được hòa tan trong lượng tối thiểu
MeOH và tiến hành sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng GF254 (Merck) với hệ dung môi diclomethan – methanol– nước = 5:1:0,1 (tt/tt). PE-2, PE003 bắt màu UV 254 nm, UV 365 nm và PE-2 hiện vết màu vàng, PE003 hiện vết màu nâu sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng.
Hình 3.6. Sắc ký đồ của PE-2, PE003 và cắn EtOAc với hệ dung môi DMW = 5:1:0,1
Hình 3.7. Sơ đồ phân lập chất PE-2, PE003 từ phân đoạn ethyl acetat quả Me rừng
dịch chiết nước