Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và độc tính cấp của cây cổ an (arcangelisia flava (l ) merr)

TRƯ NGHIÊN C THÀNH PH TÍNH C ( ARCANGELISIA FLAVA KHÓA LU BỘ Y TẾ TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N ỘI LÊ TÙNG SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PH ẦN HÓA HỌC V À Đ TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN ARCANGELISIA FLAVA (L.) MERR KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP DƯ ỢC HÀ NỘI – 2015 ỘI ỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, À Đ ỘC ẤP CỦA CÂY CỔ AN (L.) MERR ) ỢC SĨ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ TÙNG SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN (ARCANGELISIA FLAVA (L.) MERR) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.TS. Hoàng Quỳnh Hoa 2. DS. Đỗ Phương Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian va tâm huyết tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Dược sĩ Đỗ Phương Lan, người hướng dẫn, người thầy thứ hai, đã theo sát tôi trong tiến trình, giúp tôi vượt qua khó khăn, bỡ ngỡ. Tôi cũng rất cảm ơn Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Bạn Nguyễn Thị Lương – A2K65, bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Linh, đã sát cánh cùng tôi, luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình làm khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, các giảng viên trong trường đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình rèn luyện, học tập tại trường. Cuối cùng xin được gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình người thân đã tạo quan tâm chăm sóc, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Tùng Sơn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……………………………………………………… 2 1.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA BECCARI 2 1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari 2 1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam 2 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 6 1.4. CÔNG DỤNG 7 1.5. SƠ LƯỢC VỀ BERBERIN 7 1.5.1. Công thức hóa học và tính chất 7 1.5.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng 8 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 9 1.6.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 9 1.6.2. So sánh giữa HPTLC và TLC 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………12 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 12 2.1.1. Nguyên vật liệu 12 2.1.2. Thiết bị 13 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2.1. Về thực vật 14 2.2.2. Về thành phần hoá học 14 2.2.3. Về tác dụng sinh học 14 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật 14 2.3.2. Nghiên cứu về hóa học 15 2.3.3. Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT …20 3.1.1. Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu 20 3.1.2. Giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 21 3.1.3. Đặc điểm vi học bột dược liệu 21 3.1.4. Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá 22 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 25 3.2.1. Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học 25 3.2.2. Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng 27 3.2.3. Bán định lượng berberin trong alcaloid toàn phần của AR7 29 3.3. Kết quả thử độc tính trên chuột nhắt trắng 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 Về thực vật 37 4.2. Về thành phần hóa học 37 4.3. Về thử độc tính cấp trên chuột 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADC Analog-to-digital converter BR Berberin DD Dung dịch HPTLC High performance thin layer chromatography LDL Low-density lipoprotein PƯ Phản ứng SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography TT Thuốc thử UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức hóa học của một số chất được phân lập từ Arcangelisa flava (L.) Merr. Hình 1.2. Công thức hóa học của các furanoditerpen được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr. Hình 1.3. Công thức hóa học của dihydroberberine (4) và 20-hydroxyecdysone (5). Hình 3.1. Ảnh các mẫu nghiên cứu Hình 3.2. Ảnh hình thái quả và hạt của mẫu AR4 Hình 3.3. Đặc điểm bột dược liệu của 3 mẫu AR4, AR7, AR8 Hình 3.4. Các hình ảnh vi phẫu lá cây Cổ an trong nghiên cứu Hình 3.5. Các hình ảnh vi phẫu cuống lá cây Cổ An Hình 3.6. Sắc ký đồ alcaloid toàn phần của cây Cổ an ở bước sóng 254 và 366nm Hình 3.7.Hình ảnh chồng píc của sắc ký đồ của hệ 4 ở bước sóng 366nm Hình 3.8. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 1 Hình 3.9. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 2 Hình 3.10. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 3 Hình 3.11. Đồ thị khảo sát độ pha loãng của mẫu AR7 Hình 3.12. Đường chuẩn định lượng berberin mẫu AR7 ở độ pha loãng 400 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh một số tham số của HPTLC và TLC. Bảng 2.1. Địa điểm và ngày thu hái 3 mẫu cây Cổ an. Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml). Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu. Bảng 3.2. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn Bảng 3.3. Kết quả sắc ký đồ các dịch chiết alcaloid toàn phần ở hệ 4 ở bước sóng 366nm. Bảng 3.4. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn. Bảng 3.5. Khảo sát độ pha loãng của dung dịch thử. Bảng 3.6. Kết quả bán định lượng berberin ở mẫu AR7 ở độ pha loãng 400 lần Bảng 3.7. Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ Bảng 3.8. Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực vật bậc cao, được sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền thống. Ngoài các tác dụng thường được biết đến như tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp, v.v, ngày nay y học hiện đại đã phát hiện thêm các tác dụng mới của berberin như điều trị ung thư, tiểu đường, v.v[2], [17], [33]. Trên thế giới đã xác định được 150 loài có chứa berberin thuộc 23 chi và 7 họ[7]. Ở Việt Nam đã xác định được các chi cho berberin gồm Coscinium, Cyclea (Menispermaceae), Berberis, Podophyllum, Mahonia (Berberidaceae), Euodia, Toddalia (Rutaceae), Coptis, Thalictrum (Ranunculaceae) và một số chi họ Papaveraceae. Tuy nhiên việc khai thác tràn lan đã khiến các nguồn dược liệu chứa berberin ngày càng trở nên khan hiếm và có nguy cơ cạn kiệt. Cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) là một loài cây được đồng bào dân tộc sử dụng nhiều làm thuốc chữa bệnh. Trên thực tế, qua điều tra tại thực địa, nghiên cứu nhận thấy đây là một nguồn dược liệu chứa berberin quý hiếm. Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước- nhiệm vụ quỹgen "Đánh giá tiềm năng di truyền một số nguồn gen dược liệu chứa Berberin ở Việt Nam", thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa họcvà độc tính cấp của cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.)” với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của mẫu cây Cổ An (Arcangelisia flava (L.) Merr.). 2. Định tính thành phần hoá học và thành phần alcaloid chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng. 3. Bán định lượng berberin trong cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.)bằng phương pháp HPTLC. 4. Thử độc tính cấp của cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) trên chuột. 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA BECCARI 1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari Arcangelisia là một chi trong họ Tiết dê (Menispermaceae), được lấy tên của nhà thực vật học người Italia Giovani Arcangeli (1840-1921), có tên thường dùng là Dây hoàng liên hoặc Cổ an [8]. Chi Arcangelisia có 4 loài, phân bố ở Châu Á: 3 loài ở Đông Nam Á và một loài ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, có 1 loài [8], phân bố chủ yếu ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai [9]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi ArcangelisiaBeccari Cây dây leo lớn hóa gỗ. Lá có cuống dài, phiến lớn; gân gốc 3-5; gân lá hình chân vịt, gân giữa mang mỗi bên 1-2 gân. Cụm hoa chùm ở nách lá, phân nhánh hình bông. Hoa đực có 6 lá đài mà 3 cái ngoài nhỏ, 3 cái trong hơi lớn hơn các cánh hoa; cánh hoa 3; nhị 9-12, chỉ nhị không rõ, bao phấn dính nhau thành hình đầu, có 4 thùy ít phân biệt, mở ngang. Hoa cái có bao hoa như hoa đực; lá noãn 3, mỗi cái chứa 2 noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc. Quả hạch có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng –trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt ngoài có lông. Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong cứng. Hạt có nhiều phôi nhũ quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [8], [34]. 1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam 1.1.3.1. Arcangelisia loureiri(Pierre) Diels– Vẩy đắng, Dây hoàng liên, Cổ sơn long Dây leo to hóa gỗ, cành già có khía. Lá đơn, mọc so le, hình trứng tròn hoặc hình bầu dục rộng, dài 8-12 cm, rộng 6-10cm, đầu nhọn, gốc gần bằng ngang; gân gốc 3-5; cuống lá phình ở gốc và ở ngọn, dài 3-8 cm. Cụm hoa chùm, ở nách lá trên các nhánh già. Cụm hoa đực nhỏ, dài 8cm, phân nhánh hình bông, không cuống, lá bắc hình tam giác; lá đài ngoài 3, 3 gần hình thuyền; nhị 9 hướng ngoài, rất ngắn. [...]... học - Định tính thành phần hoá học chính trong mẫu nghiên cứu - Chiết xuất và định tính alcaloid toàn phần trong các mẫu nghiên cứu - Bán định lượng các thành phần alcaloid chính của các mẫu thu thập được 2.2.3 Về tác dụng sinh học - Thử độc tính cấp cao đặc thân Cổ an trên chuột nhắt trắng 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 2.3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái Mô tả các đặc điểm hình... 100 và 200 ml; bình định mức 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Về thực vật - Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu - Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu - Làm tiêu bản vi phẫu thân, mô tả, quan sát đặc điểm cấu tạo giải phẫu - Quan sát, mô tả đặc điểm bột dược liệu 2.2.2 Về thành phần hoá học. .. Arcangelisa flava (L. ) Merr.còn jatrorrhizin, dihydroberberin và 20- hydroxyecdyson là những sản phẩm tự nhiên được phân lập lần đầu tiên[24] Hình 1.3.Công thức hóa học của dihydroberberin ( 4) và 20-hydroxyecdyson ( 5) 6 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC Dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L. ) Merr.cho tác dụng chống oxi hóa trung bình với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)... nổi hoặc quan sát bằng mắt thường, từ đó mô tả các đặc điểm hình thái các cơ quan dinh dưỡng (rễ, thân, l ) và cơ quan sinh sản (nếu c )[ 4], [5] So sánh các đặc điểm hình thái mô tả được với các đặc điểm ghi trong khoá phân loại của Thực vật chí Trung Quốc, sơ bộ giám định tên khoa học [34] 15 2.3.1.2 Làm tiêu bản vi học thực vật Tiêu bản vi học các cơ quan dinh dưỡng của các mẫu nghiên cứu được làm... nước, hơi tan trong ị ạng n ethanol, khó tan trong ether Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan eth ạng n trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong chloroform và ether Dạng ớc ực v muối sulfat dễ tan trong n ớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất ối nước đối nên không có đồng phân quang học [15] ồng 8 Hóa tính: Hóa tính của N+: berberin có tính chất... quả của mẫu AR8 21 3.1.2 Giám định tên khoa h của các mẫu nghiên cứu nh học Các đặc điểm hình thái c các mẫu nghiên cứu, đối chiếu với các tài liệu m của i chi tham khảo về thực vật [28], [34 ]và so sánh với tiêu bản lưu tại Phòng tiêu bản Bộ t i b môn Thực vật Các m t mẫu nghiên cứu được sơ bộ giám định tên khoa học là nh h Arcangelisia flava (L. ) Merr Menispermaceae Merr., A B C Hình 3.1 Ảnh các m nghiên. .. xoan, dài 2 cm, vàng, trên đế hoa phù rộng Phân bố: Loài phân bố ở Thái Lan, Việt Nam và Nam Trung Quốc, ở nước ta chỉ gặp ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai Thu hái quanh năm, rửa sạch, thái lát, phơi khô [9] 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Theo nghiên cứu của Thornber (197 0), alcaloid nhân isoquinolin gồm palmatin và jatrorrhizinvà alcaloid berberin đã được ghi nhận phân lập từ Arcangelisa flava (L. ). .. tinophylol và 6-hydroxyfibleucin đã được phân lập từ Arcangelisia flava (L. ) Merr [21] Năm 2011, theo Toshisada Suzuki và các cộng sự, hai hợp chất furanoditerpen mới là 2a,3a-epoxy-2,3,7,8 a-tetrahydropenianthic acid methyl ester và 2a,3a epoxy2,3-dihydropenianthic acid methyl ester đã được phân lập và phát hiện từ rễ của Arcangelisiaflava (L. ) Merr.[30] 5 Hình 1.2 Công thức hóa học của các furanoditerpen... methanol, chloroformcho tác dụng gây độc tế bào đối với tôm mặn (brine shrimp) và dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với liều LC50 và IC50 giá trị lần lượt là 210-278 và 8-12µg/ml [20] Hoạt tính kháng khuẩn của Arcangelisia flava (L. )Merr được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán đĩa với dịch chiết nước của Arcangelisia flava (L. )Merr., sử dụng 3 vi sinh vật:Salmonella typhii, Staphylococcus aureus và. .. camera Nikon DS Fi2 [13] 2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 2.3.2.1 Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm theo tài liệu Thực tập dược liệu [13] 2.3.2.2 Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng ( 1) Chiết xuất alcaloid Cân chính xác khoảng 1,0g bột dược liệu Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100: 1) Đun hồi lưu cách thủy 30 . Nam", thực hiện đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa họcvà độc tính cấp của cây Cổ an (Arcangelisia flava (L. ) Merr .) với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ TÙNG SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN (ARCANGELISIA FLAVA (L. ) MERR) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người. trong cây Cổ an (Arcangelisia flava (L. ) Merr.)bằng phương pháp HPTLC. 4. Thử độc tính cấp của cây Cổ an (Arcangelisia flava (L. ) Merr .) trên chuột. 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. CÁC NGHIÊN CỨU