Thiết kế đoạn mồi để định danh cây gừng

Chức năng: Bộ môn Di truyền - chọn giống là đơn vị nghiên cứu trực thuộc Viện Lúa ĐBSCL có chức năng bảo tồn tài nguyên di truyền cây lúa và một số cây trồng khác trong vùng trồng lúa,

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường Đại Học Bách khoa Đà Nẵng Ban chủ nhiệm khoa Hóa, bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện để em tiếp xúc với thực tế thông qua thực tập Tốt nghiệp

Bộ môn di truyền và chọn giống – Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tiếp

nhận và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt khoảng thời gian em thực tập tại đây.Các thầy cô và các anh chị trong bộ môn đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và chỉ bảo

em trong suốt khoảng thời gian em thực tập

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Lang, anh Trần Minh Tài không những đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập mà còn truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báo trong cuộc sống

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy Bùi Xuân Đông, cô Đoàn Thị Hoài Nam cùng toàn thể các bạn 10SH và gia đình của em đã quan tâm và ủng hộ giúp em hoàn thành tốt đợt thực tập này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả!

Các thành tựu về giải mã bộ gen người, bộ gen cây lúa, bộ gen chuột, nhân bản

động vật đã mở ra một thời kỳ mới giúp con người hiểu biết, có thể chữa khỏi một sốbệnh nan y, nâng cao sức khỏe và đời sống con người Tuy nhiên, việc triển khai các ứng dụng sinh học phân tử thường gặp các trở ngại khi số lượng vật chất di truyền

(DNA, RNA) cần thiết trong mẫu thấp Để có đủ số lượng mẫu, người ta có thể dùng phương pháp tạo dòng (cloning) hoặc phổ biến hơn là phản ứng PCR Để thực hiện được phương pháp này, các nhà sinh học cần phải biết thông tin về trình tự cần nhân bản và từ đó phải xác định được trình tự các đoạn mồi cần thiết để có thể khuếch đại đặc hiệu trình tự mong muốn

Trong bộ Gừng (Zingiberales) ở Việt Nam, họ Gừng (Zingiberaceae) là họ có số lượng loài nhiều nhất Đây là một họ có nhiều đại diện có giá trị làm thuốc chữa bệnh, nhiều loài được sử dụng làm gia vị, làm cảnh

Vì vậy, việc nghiên cứu phân loại họ Gừng ở nước ta một cách có hệ thống là điều

vô cùng cần thiết

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về Viện Lúa ĐBSCL

Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long (Cuu Long Delta Rice Research Institute hay CLRRI) là một viện nghiên cứu và đào tạo có địa chỉ xã Tân Thạnh,

huyện Thới Lai, thành phố Cần Thơ, Việt Nam với tổng diện tích 366 ha Tiền thân của viện này là Trung tâm Kỹ thuật Nông nghiệp đồng bằng song Cửu Long được

thành lập theo quyết định số 41 NN-TC/QĐ ngày 8 tháng 1 năm 1977 Trung tâm này

đã được Chủ tịch Hội đồng Bộ trưởng đổi tên như hiện nay vào năm 1985

Với những đóng góp đáng kể trong nghiên cứu và sản xuất nông nghiệp, từ năm

2002 trở đi Viện được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho phép mở rộng

chức năng hoạt động thành Viện nghiên cứu nông nghiệp vùng

Hình 1.1: Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long 1.2 Bộ môn di truyền

a Chức năng: Bộ môn Di truyền - chọn giống là đơn vị nghiên cứu trực thuộc

Viện Lúa ĐBSCL có chức năng bảo tồn tài nguyên di truyền cây lúa và một số cây trồng khác trong vùng trồng lúa, nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống lúa, giống câytrồng cạn, rau màu theo hướng phát triển bền vững, đáp ứng mục tiêu phát triển của

b Nhiệm vụ:

- Thu thập, bảo quản, đánh giá, tư liệu hóa và sử dụng hợp lý qũy gen cây lúa và một số cây trồng khác trong vùng trồng lúa, để thực hiện mục tiêu đa dạng sinh học, sửdụng vật liệu bố mẹ có định hướng đáp ứng yêu cầu cải tiến giống cây trồng

- Nghiên cứu genome học và genome học chức năng cây trồng mục tiêu; phát triển những lĩnh vực mới như proteomics, transcriptomics; ứng dụng tin sinh học, đáp ứng nhu cầu nghiên cứu cơ bản về di truyền phân tử, công nghệ di truyền, kết hợp với các phương pháp truyền thống làm cơ sở chọn tạo giống lúa, các giống cây trồng cạn và rau màu

- Nghiên cứu khai thác vật liệu di truyền từ nguồn hoang dại và loài bản địa, làm đadạng nguồn gen, kết hợp với đột biến gen, biến dị somatic hoặc gametic, xây dựng

chiến lược chọn lọc trên cơ sở di truyền số lượng, nhằm tạo chọn giống năng suất cao,

ổn định, chống chịu stress sinh học và phi sinh học, gia tăng hàm lượng dinh dưỡng nông sản

- Thực hiện các phương pháp chuyển gen, du nhập gen mục tiêu từ ngân hàng gen vào giống cây trồng, kết hợp với hồi giao cải tiến, ứng dụng dấu chuẩn phân tử trong chọn giống (MAS), đánh giá hiệu qủa chọn lọc tính trạng mục tiêu, phân tích QTL, phân tích chuỗi trình tự gen mục tiêu, thiết kế những cặp mồi liên kết chặt chẽ với gen mục tiêu, hoàn thiện không ngừng qui trình chọn giống truyền thống và phân tử

- Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống: Chức năng genome , Công nghệgen, Kỹ thuật di truyền , Kiểm tra về GMO các cây có liên quan

- Tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh, thực tập sinh sau Tiến sĩ (post-doct),sinh viên đến thực tập về di truyền-giống; đào tạo tiến sĩ chuyên ngành di truyền -

giống

- Thực hiện các hoạt động so sánh năng suất, phân tích tương tác GxE, trồng thử, chuyển giao giống mới ở các địa phương trong vùng mục tiêu

- Thực hiện công tác khảo nghiệm giống lúa ở các vùng sinh thái khác nhau

- Thực hiện các đề tài, dự án hợp tác quốc tế về các lĩnh vực có liên quan.(1)

1.3 Thiết kế đoạn mồi

1.3.1 Khái niệm

Mồi (primer) là một đoạn Nucleotide ngắn (oligonucleotide), có khả năng bắt cặp với sợi DNA khuôn mạch đơn, tạo ra vùng khởi động cho quá trình tổng hợp sợi DNA mới nhằm khuếch đại số lượng lớn DNA

Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử

Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng mồi thích hợp mang tính quyết định đối với sản phẩm PCR thu được

1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi và những yêu cầu của mồi

1.3.2.1 Nguyên tắc thiết kế primer

Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta

muốn ứng dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao

Nhằm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải thiết kế chính xác “oligonucleotide primer”

Mỗi được thiết kế đúng giúp chúng ta tránh tạo ra những sản phẩm PCR không

chuyên tính, giống như hiện tượng phân biệt giữa cDNA và DNA của bộ gen trong RNA-PCR

Các nguyên tắc trong thiết kế primer được Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang

(2004) nghiên cứu như sau:

- Primer nên có chiều dài chuỗi trình tự khoảng 17-28 base

- Hàm lượng G+C khoảng 50-60%

- Nhiệt độ Tm khoảng 55-800C

- Ở đầu 3’ primer có một G hoặc C, hoặc CG hoặc GC nếu nhiều hơn sẽ thúc đẩy hiện tượng “priming” nhầm ở các trình tự giàu G hoặc C nên được tránh

Giá trị Tm trong khoảng 56-620C tạo ra quá trình “annealing” đạt kết quả tốt

Nhưng trong phản ứng PCR nhiệt độ Tm của mồi có thể biến thiên trong vòng 2-30C

1.3.2.2 Các thông số cơ bản để thiết kế mồi

Mục đích của thiết kế mồi là có được sự cân bằng giữa hai kết quả: sự chuyên tính

và sự hiệu quả của PCR Sự chuyên tính được xem xét dựa trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần “priming” nhầm trên tổng số lần “priming” (sự lai giữa primer và dây nền tại

vị trí mục tiêu của nó) Tính hiệu quả của một mồi là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết

về kết quả sản phẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, một cặp mồi có thể khuếch đại ra một sảnphẩm

Một chuỗi mã DNA nào đó đã được cung cấp, người ta có thể phân tích mồi trên phần mềm máy tính, để có một cân bằng giữa hai mục tiêu

Chiều dài mồi (primer length):

Cả tính đặc hiệu và thời gian bắt cặp ít nhất một phần phụ thuộc vào chiều dài mồi, yếu tố này quyết định sự thành công của PCR

Mồi có chiều dài càng lớn thì khả năng bắt cặp của mồi càng ít hiệu quả Để tối ưu hóa phản ứng PCR, người ta sử dụng mồi có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo Tmkhoảng 540C hoặc hơn chút ít, như vậy tính đặc hiệu của sản phẩm PCR và hiệu suất phản ứng sẽ cao Những nucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) chỉ được sử dụng rấthạn chế trong các phản ứng PCR.(2)

Tùy thuộc vào kích thước genemo sinh vật, chúng ta sẽ có một độ dài tối thiểu, sai biệt hơn kém nhau vài nucleotide Chiều dài tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PC là

18 nucleotide.(3)

Phần trăm GC (GC Content Percentage):

Hàm lượng GC chiếm khoảng 50 – 70% thì cho kết quả tốt Nucleotide G và C phảiđược phân bố đều khắp trình tự mồi Cần tránh có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để ngăn khả năng bắt cặp không đặc hiệu

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Primer Melting Temperature):

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ tại đó có 50% phân tử DNA sợi đôi bị tháo

xoắn thành sợi đơn

Nhiệt độ nóng chảy tăng theo độ dài của mồi Chiều dài tối ưu của mồi vào khoảng 18-24 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 550C đến 800C Có một số công

thức để tính nhiệt độ nóng chảy của mồi dựa vào số lượng các nucleotide thành phần (A,G,C và T).

Nucleotide cuối của Mồi (trình tự đầu 3’):

Vị trí đầu 3’ trên primer là cần thiết để khống chế mồi sai vị trí, do đó cần phải xác định cẩn thận Khi ta xác định được một nucleotide acid, hai base đầu tiên rong codon của nó hoặc ba base trong trường hợp nó được mã hóa bằng codon đơn (methionine vàtryptophan) thì hai hoặc ba base đầu này được dùng như đầu 3’ Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’của primer và khuôn mẫu cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn, và giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai (mismatch) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer

Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng gắn primer nhầm và

ngăn cản hiện tượng tương đồng trong cùng một cặp primer Nếu không xác định cẩn thận nucleotide ở đầu 3’ thì hiện tượng primer-dimers sẽ xảy ra, và với tính chất bổ sung cho nhau thì sản phẩm PCR lúc bấy giờ sẽ là một sự khuếch đại của chính primerchứ không phải của DNA khuôn mẫu

Các trình tự mồi bổ sung

Nên thiết kế mồi không có vùng tương đồng bên trong mồi vượt quá 3 cặp base Nếu mồi có một vùng tự tương đồng như thế, nó sẽ quay lại bắt cặp bổ trợ, tạo ra cấu trúc sợi kép (còn gọi là cấu trúc bậc 3 hay cấu trúc kẹp tóc), ảnh hưởng đến ciệc bắt cặp khuôn

1.3.3 Các phần mềm và chương trình dùng trong thiết kế mồi

1.3.3.1 Chương trình ClustalW

Chương trình clustal là dãy các phiên bản phần mềm phân tích kết quả thí nghiệm

về cấu trúc chuỗi DNA hay protein, bằng phương pháp so sánh đồng thời giữa tất cả các chuỗi mà người yêu cầu đã lựa chọn cung cấp cho chương trình (về khối lượng, vị trí các đoạn đứt hay đoạn chèn đặc hiệu…) để tìm kiếm phát hiện ra những đặc điểm đồng nhất, đặc điểm gần gũi hay phân ly giữa chúng Qua đó, chương trình sẽ xây

dựng cây tiến hóa và cung cấp thông tin liên quan để dự đoán đặc tính của chuỗi phân

tích Clustal có nhiều phiên bản trong đó có phiên bản ClustalW, được viết bằng ngôn ngữ TUBRO C, có thể chạy trên nhiều môi trường khác nhau: UNIX, MAC, PC.

1.3.3.2 Các phần mềm thiết kế và lựa chọn đoạn mồi

Chương trình thiết kế và lựa chọn đoạn mồi (primer design softwares) là chương trình tìm kiếm và xác định đoạn nucleotide tương đồng với cấu trúc chuỗi DNA đem phân tích, phục vụ cho nhân gen PCR hay sử dụng cho nhiều kỷ thuật lai ứng dụng khác Để giải quyết nhiệm vụ trên, nhiều phần mềm đã được xây dựng và cung cấp cho người dùng như DNA Club, OLIGO primer analysis sofware, Molecular Biology Insights, FastPCR hay Primer 3

1.3.3.2.1 Chương trình FastPCR

FastPCR là một trong những công cụ mạnh để thiết kế mồi

Hình 1.2: Giao diện của chương trình FastPCR

Các bước thực hiện:

- Chép lại chuỗi trình tự (định dạng FASTA, EMLP) và dán vào cửa sổ input

- Lựa chọn các thông số cho mồi (bao nhiêu %GC, ) với nhiều phương án

- Chọn Run (F5) để chạy chương trình, xuất hiện file output với các định dạng như ASCII text, XML và excel

Trên bảng kết quả (result) dạng notepad gồm tên các mồi, trình tự các mồi, Tm,

%GC, Q Có rất nhiều mồi để lựa chọn cho phản ứng PCR

1.3.3.2.2 Chương trình thiết kế Primer-3

Primer-3 là một trong số các chương trình ứng dụng để thiết kế đoạn mồi của

Rozen và Skeletsky Chương trình Primer-3 được cung cấp cho người sử dụng xử lý trực tuyến qua địa chỉ truy cập

Chương trình Primer-3 thiết kế mồi dựa trên cơ sở dử liệu phân tích của các đoạn mồi tương ứng đã biết trong các ngân hàng dữ liệu

1.3.3.2.3 Chương trình thiết kế Primer-BLAST

Hình 1.4: Giao diện trực tuyến chương trình primer-BLAST(5)

Primer-BLAST đã được phát triển tại NCBI để giúp người dùng thiết kế các mồi cho phản ứng PCR Nó dùng Primer-3 để thiết kế mồi và sau đó gửi chúng vào

BLAST tìm kiếm đối với người sử dụng lựa chọn cơ sở dữ liệu

Các bước thực hiện:

Nhập dữ liệu: thông thường chuỗi trình tự được viết theo định dạng FASTA

Đặt chế độ xử lý

Nhấn nút: “Get primer”

1.3.3.3 Chương trình phân tích cấu trúc tương đồng BLAST

WU-BLAST2 là chương trình so sánh cấu truc của chuỗi DNA, chuỗi amino axit phân tích với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu, nhằm tìm kiếm

chuỗi (hay một số chuỗi) tương đồng nhất với chuỗi kiểm tra Sau đó, người phân tích

sẽ khai thác các thông tin về đặc tính đã biết của các chuỗi trong ngân hàng để dự đoánxác định cấu trúc và đặc tính của chuỗi cần kiểm tra này Về phương diện kỷ thuật, chương trình BLAST cho phép phát hiện sự tương đồng cấu trúc ở hai mức độ là mangtính cục bộ ở một vùng hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau

1.4 Tổng quan về Gừng

1.4.1 Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng

Chi gừng Zingiber Bochmer gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới châu Á và châu Úc Trung tâm phong phú và đa dạng nhất của chi gừng là Đông Nam Á Riêng tại Trung Quốc hiện đã biết khoảng trên 20 loài Trong số các loài gừng trồng thì loài Zingiber officinale Roscoe được trồng phổ biến nhất

Loài gừng Zingiber officinale Roscoe đã được trồng rộng rãi từ rất lâu đời ở các nước nhiệt đới châu Á Đến nay vẫn chưa thấy loài gừng này mọc dại ở bất cứ khu vựcnào trên thế giới Một số giả thiết cho rằng gừng có nguồn gốc ở Ấn độ, từ đây nó

đựơc đưa đến các nước châu Âu, các nước Đông Phi bởi những thương nhân Ả Rập Hiện nay gừng Zingiber officinale đã được đưa trồng ở hầu khắp các nước trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm

Ở Việt Nam gừng Z officinale được trồng trên khắp các địa phương từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi.(6)

1.4.2 Đặc điểm chung của Gừng

Thông tin cơ bản

Tên thường gọi: Gừng

Tên khác: Khương, Gừng thuốc

Tên tiếng Anh: Zingiber

Thuộc họ Gừng - Zingiberaceae(7)

Mô tả

Cây thảo, sống lâu năm, cao 1m Thân rễ nạc, mọc bò ngang, phân nhiều nhánh Lámọc so le thành hai dãy, hình mác thuôn, thắt lại ở gốc, đầu nhọn, dài 15 -20cm, rộng 2cm, không cuốn, có bẹ nhẵn,lưỡi bẹ nhỏ dạng màng, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục sẫm bóng,mặt dưới nhạt, có gân giữa hơi trắng nhạt khi vò có mùi thơm

Cán hoa dài cỡ 20cm, mang cụm hoa hình bông, dài khoảng 5cm, gồm nhiều hoa mọc sít nhau Hoa có tràng hoa màu vàng xanh, có thuỳ gần bằng nhau nhọn Cánh môi ngắn hơn các thuỳ của tràng, màu tía với những chấm vàng Nhị hoa màu tím

Quả mọng

Bộ phận dùng

Thân rễ (thường gọi là củ )- Rhizoma Zingiberis, có tên là Can Khương

Thân rễ, thu hái vào màu đông, dùng tươi là sinh khương, phơi hoặc sấy khô là can khương Còn dùng tiêu khương ( gừng khô thái lát dày, sao sém vàng, đang nóng, vẩy vào ít nước, đậy kín Để nguội); bào khương (gừng khô đã bào chế); thán khương

(gừng khô thái lát dày, sao cháy đen tồn tính)

Có thể cất tinh dầu từ gừng với hiệu suất 1 -2,7% hoặc điều chế nhựa dầu gừng từ bột gừng khô với các dung môi hữu cơ, hiệu suất 4,2 – 6,5%

Thành phần hóa học:

Gừng chứa 2-3% tinh dầu với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon

sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol

Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay Thành phần chủ yếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol, trong đó gingerol chiếm tỷ lệ cao nhất.Ngoài ra, trong tinh dầu Gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol và các gingerol Cineol trong Gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều vi khuẩn.(8)

Hoạt tính sinh học của gừng