TAP CHỈ k h o a h ọ c D H Q G H N , KHTN & CN, T.xx, sỏ' 4, 2004 THIẾT KẾ CẶP MỒI ĐẺ NHÂN ĐOẠN GEN 18S ARNR CỦA HAI LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA CRASSIPHYLLA VÀ CAMELLIA TAMDAOENSIS VƯỜN QUOC GIA TAM ĐAO N g u y ền Văn Mùi, N gu yền T rọng Bình K h o a S in h học, T rư n g Đ i học K h o a học T ự n h iên , Đ H Q G H N Mở đầu Cây trà tê n gọi ch u n g cho loài thuộc chi C am ellia (Camellia), họ chè (Theacea), chè (Theales), p h â n lớp sổ (.D illen iid ea ), lớp hai m ầm (D iotyedoneae), ng àn h thực v ật h t kín tA ngiosperm ae) [ ] Chi C am ellia có th â n gỗ h ay bụi, đơn mọc cách, mép khía rộng nơng đều, p h iến lá, cứng m àu đậm, bóng, khơng có kèm, chồi non mọc úp lên n h a u nách h ay đ ầ u cành, dai, m àu nhạt, dễ n hận Hoa to, mọc đơn độc nách lá, gốc có hai hay n h iều bắc Theo thống kê n ăm 1991, cuôn "Cây cỏ Việt N am " P h m Hộ giỏi th iệu 30 loài tên chi C am ellia N ăm 1994, dựa trê n cơng trìn h nghiên cứu tác giả người Pháp với n g h iê n cứu tác giả Nguyền Hữu Hiến th ôn g kê t ấ t họ chè Việt N am chi C am ellia có 37 lồi Cho đến tr ê n th ê giới n h nước ta, việc p h â n loại chủ yếu dựa vào đậc điểm hìn h thái, cấu tạo giải p h ẫ u bên Với p h t triể n sinh học ph â n tử công nghệ gen đà x u ấ t h iện sô ng àn h khoa học mới: ph ân loại học p h â n tử- chủ yếu dựa trê n kỹ t h u ậ t p h â n tích ADN n h ữ n g công cụ hỗ trợ đắc lực cho n h p h â n loại học việc phát h iện loài mới, giải mơi nghi ngờ vị trí p h ân Joại đ n h giá đầy đủ vê tín h đa dạn g di tru yền, q u an hệ chủng loại tiến hố n h iều lồi động vật, thực vật vi sinh vặt Các cơng trìn h nghiên cứu ứng dụng kỹ t h u ậ t p h â n loại p h â n tử góp p h ần đánh giá tín h đa dạn g sinh học, định hướng khoa học cho việc báo tồn khai thác hợp lý nguồn tà i nguyên động vật, thực v ậ t th ê giới nh nước ta, có sơ" n g h iên cứu phương pháp RAPD-PCR th iế t kê m ột số đê ph ân tích trìn h tự ADN cho p h â n loại tr [4,5] Một số loài t r tron g chi C am ellia có giá trị kinh t ế cao [6 ] Đặc b iệ t gần yêu cầu ngày cao nghệ th u ậ t cản h sơ" lồi chi C am ellia đ ang đôi tượng bị khai thác Do đó, tr n h ữ n g nguồn tài nguyên cần bảo vệ, ph ân loại đê đưa biện p h p thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, tín h đa d n g sinh học, cách nuôi tro ng nhà n h â n giống chi C am ellia 82 83 Thiel kẽ cặp mối dê nhím đoạn gcn N g u y ên liệu phương pháp n g h iên cứu 2.1 N g u ye n liệu T rong nghiên cứu sử dụng hai m ẫu tr là: - C am ellia criassiphyllia N inh et H akida - C am ellia tarndaensis Các m ẫu lấy từ vườn Quốc gia Tam Đảo TS T rầ n N inh cu ng cấp 2.2 P h n g p h p n g h iê n cứu T h n h tê bào thực v ậ t bị phá võ biện ph áp học k ế t hợp với sủ dụn g chất tầy rửa m ạn h , ADN giải phóng làm tạ p c h ất nhờ p ro te in a se K, dun g dịch C H C Ịr isoA (24:1) ADN kết tủ a cồn tu y ệt đối °c th u k ế t tủ a tu y ệ t đôi ()' 20°c th u nhờ ly tâ m cao tốc AND tách chiết theo phương p h p Roger J cộng [8 ] - N guyên tắc p h ả n ứng PCR sử dụng enzym ADN polym erase chịu n h iệ t đế tổng hợp tro ng ống nghiệm đoạn ADN từ mạch khuôn tro ng môi trư n g dư th a dN TP cặp mồi đặc hiệu [7] P h ả n ứng PCR thực nh sau: 25j.ll đệm 10X; Sf.ll MgSOị lOmM; 2,5j.il dNTP nồng độ 2,5 mM mồi loại; 2f.ll p rim er loại 2\i\ Taq ADN polym erase C h u trìn h nhiệt hao gồm 90°C: 30", (95° C: \ 52° C: r3 "; 72° C: 1’30"), lặp lại 35 chu kỳ; 72°C:10; giữ ỏ 4°c Sản p h ẩ m PCR kiếm tra điện di trê n gel agarose % K ế t q u ả v t h ả o l u ậ n 3.1 T c h c h iế t tin h c h ế a d n tô n g sô 'từ trà Việc tách chiết tin h ch ế ADN thực trê n h a i loài tr C am ellia crassiphylla N inh et H akoda C am ellia tam daonensis Mọi nghiên cứu trê n toàn gen b ắ t đầu từ việc tách chiết ADN tổng sô d n g tin h không bị đứt hay p h â n huỷ tác n h â n học h a y hố học Hiện nav, có r ấ t nhiều phương p h p tách chiết ADN thực vật, phương p h p có nh ữ ng ưu điểm p h ù hợp cho từ n g đơi tượng Vì vậy, việc lựa chọn phương p h p th íc h hợp cho đối tượng n g h iê n cứu m ình r ấ t q u a n trọng Do mơ tr có n hiêu p ro tein sắc tổ’, nên sử d ụ n g pro te in a se K, SDS PVP để tiến h n h tách chiết ADN tổng sô" S a u tiến h n h loại ARN, kiểm tr a độ sản p h ẩ m ADN trê n gel agarose % Kết qu ả điện di th ể h ìn h Tạp chí Khoa học DHQGHN K IỈT N & CN T.xx S ố4, 2004 : X4 Nguyen Vãn M ùi Neuyẻn Trọng Bình - — — Kp - -— M ' - Kp 21 21.1 H ìn h 1: AON tổ n g sô trướ c sa u loại ARN M: M a rk e r - T h a n g G iến g 1: A D N tổ n g G iến g 2: ADN tố n g G iến g 3: A D N tố n g chuẩn số củ a sô' củ a số c ủ a (ADN c ắ t b ằ n g Eco RI) loài C a m ellia c ss ip h y lla ch a loại bỏ ARN loài C a m ellia c s sip h y lla ch a loại bỏ ARN loài C a m ellia c s sip h y lla loại ARN Giếng 4: ADN tổng số loài Camellia tamdaonensis loại ARN Kết trê n h ìn h cho th ấ y giếng 1, 2, 3, x u ấ t b ăn g ADN tương ứng với bảng có kích thước 21,1Kb b ă n g ADN chuẩn N hư vậy, ch ú ng nh ận ADN tổng số m ẫu tr tro ng chi C am ellia Ớ giếng giếng 4, ADN tổng số tách chiết không bị đứt gãy ARN bị loại bỏ hồn tồn, có th ê đảm bảo u cầu c h ấ t lượng cho ph ản ứng PCR Cịn giếng giếng 2, ngồi ADN tổng số v ẫn ARN chưa bị loại bỏ ARN tạo v ệt sá n g cuối ỏ b ản gen 3.2 N h ả n đ o n tr ìn h tự c ủ a g e n 18S A R N r b ằ n g k ỹ th u ậ t P C R Ớ lồi thực v ậ t nói chung, đoạn gen 18S ARNr n hà khoa học đ n h giá vùng có ý nghía ổn định m ặ t tiến hóa Do vậy, trìn h tự nucleotide trê n vùng thường sử d ụn g để xác định môi q u a n hệ tiế n hóa p h t sinh ch ủ n g loại lồi Vì vậy, nghiên cứu này, ch ún g lựa chọn trìn h tự nucleotide trê n đoạn gen 18 A RNr đê nghiên cứu n h ằ m hướng tới n h ữ n g p h â n loại trà chi C am ellia 3.2.1 T hiết k ế tồng hợp cặp m ồi đặc hiệu cho gen 18S A R N r trà Đê thực p h ả n ứng PCR cần ph ải có đầy đủ yếu t ó đoạn ADN khuôn (tem plate DNA), cặp mồi (primer), ADN polymerase, loại đN T P dung dịch đệm thích hợp Vì vậy, vối việc tá ch chiết ADN tống sô"chúng tiến h n h th iế t kế cặp mồi đê n h ậ n đoạn ADN gen 18S ARNr Dựa trê n số trìn h tự đầu đoạn gen 18S ARNr sơ lồi thực v ậ t bậc cao công bố, chúncĩ th iế t kê cặp mồi có kích thước bp Đây vùng bảo th ủ cao tiến hóa Vì vậy, ch ún g tơi dự đốn vùng bảo th ủ có m ậ t trìn h tự gen 18S ARNr loài tro ng chi C am ellia Theo lý th uy ết, sử d ụn g cặp mồi n h ậ n đoạn gen 18S A R N r có kích thước k h o ả n g 1,7 Kb Tạp chi Khoa lìỌ C ĐHQGHN K Ỉ Í Ì N & CN 'I XX Sơ'4, 2004 Thiel kê cặp mồi tic nhàn đoạn í»cn 85 Cặp mồi c h ú n g th iế t kê có kích thước trìn h tự n h sau: Mồi xuôi (ký hiệu BVB): 3' - GCGATCCGAACACTTCACCGG-5' MỒI ngược (ký hiệu BVF): 5' - GCTTGTTCTCAAGTTAAGCC-3' P rim e r BVB T C 18S ^ NNNNGGTTG ATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCAAAGATTAAGCC ATGCA MC18S GTCATATGCTTGTCAAAGATTA AGCCATGCA 55 33 T C 18S TGTGT A AGT ATG A ACTA ATTC AG ACTGTGAA ACTGCG A ATGGCTC ATT A A ATC AG 110 M C18S TGTGTA AGTATG AACTAATTCAG ACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTA AATCAG 88 T C 18S TTATAGTTTGTTTG ATGGTATCTGCTACTGG ATA ACCGTAGTA ATTCTAG AGCT 165 M C18S TT ATAGTTTGTTTG ATGGTATCTGCTACTCGG ATA ACCGTAGTA ATTCT AG AGCT TC1xs AAGCGCG AGTCATCC AGCTCGCNNTG ACTACGTCCCTGCCCTTTGTAC AC ACCGCC 1648 M C1xs A AGCGCG AGTCATCAGCTCNNNTTGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC ACCFCC 1627 T C 18S CGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCNGCGACGTGG 1703 M C 1xs CGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCGGCGACGTGG 1682 M 143 P rim e r BVF MC: M e n isp erm u m canadense TC: Tinospora c a ff H ìn h 2: So s n h tr ìn h tự n u c le o tit đoạn đ ầ u v đoạn cuổì củ a đ o ạn gen 18S A R N r củ a loài th u ộ c chi tro n g họ Menispermacea đê th iế t kê đoạn mồi 18S A R N r 3.2.2 N h n đoạn A D N kỹ th u ậ t PCR C h úng tiến h n h p h ả n ứng PCR đê n h â n đoạn gen 18S A R N r từ ADN tổng sơ lồi chi C am ellia C am ellia crasiphyla C am illa ta m d a o n en sis nhò sử dụng cặp mồi th iế t k ế tổng hợp BVF BVB P h ả n ứ ng n h â n đoạn gen 18S ARNr gồm 35 chu kỳ, chu kỳ gồm giai đoạn sau: - Giai đoạn : giai đoạn làm biến tính ADN - Giai đoạn : giai đoạn gắn mồi N hiệt độ g ắ n mồi p h ả i th ấ p nh iệt độ nóng chảy mồi đê cho đoạn mồi gắn với n h a u theo trìn h tự tương hợp p h â n tử ADN làm khuôn Đồng thời nhiệt độ gắn mồi củng không q u th ấ p k h iế n cho kh uô n bị tiến tính, phụ thuộc vào loại mồi, cụ thê có th ể tín h tốn dựa trê n nhiệt độ nóng cháy (Tm) đoạn mồi Tuy nhiên, để dễ d n g tron g việc tín h tốn nh iệ t độ nóng cháy đoạn mồi, chúng tồi sử dụn g cơng th ứ c tín h đơn giản Chaw s M: Tm = 2°c X (A+T) + 4°c X (G+C) + 3,3°c Tap chi Khoa học ĐHỌCi/ỈN K H TN CN, T.xx Sổ4, 2004 Nguyen Văn Mùi Nmiyển Trọnsi Bình Trong đó: - A: Adenin - T: Timin - G: G u a n in - C: Cytosin - Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài chuỗi S a u k h i th ụ c phan ưng PCR, kiểm tra sản p h ẩ m ADN gel agarose "«» th u dược kết tron hình Kp M M: (M ark er): th a n g A D N c h u ẩ n G iếng 1: sả n p h ẩ m P C R cú a loài Camellia crasiphylla G iếng 2: sả n p h a m P C R m ẫu Ca me 11ia ta mdaoneĩisis 1.7 H ì n h Két q u ả đ iện di sả n p h ẩm PCR Két phô diện di cho thấy ỏ hai loại trà đểu th u sản phâm PCR vào khống 1,7 kb Đây la kích thước đặc trư n g cho gen mã hóa 18S A RNr có tính bảo thủ cao q trình tiến hóa p h t sinh chúng loại nên phương pháp p h â n loại phân tử có thê đánh giá khác n h a u giừa loài dựa trìn h tự xếp nucleotide gen IBS ARNr Tuy nhiên, đê đ n h giá khác biệt đoạn trìn h tự 18S ARNr loài chi C am illa n h â n lên, cần nghiên cứu sâu thơng qua phương pháp phản tích chọn dịng giải trìn h tự nucleotide đoạn gen K ế t l u ậ n Tách chiết tinh ADN tống sô" từ hai loại trà chi C am ellia C am ellia crassiphylla N inh et H akoda C am ellia ta m daonensis T hiết kê cặp mồi BVF BVB đặc hiệu đê nh ản đoạn gen m ã hóa 18S ARNr chi C am ellia N hân đoạn gen mã hóa 18S rARN có kích thước 1.7kb hai lồi thuộc chi C am ellia kỹ th u ậ t PCR Tạp i hi Khoa lun DUQCHN, KHTN