BÁO CÁO KHOA HỌC: "NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO" ppsx

NHÂN GEN MÃ HỐ RARN 5,8S Ở LỒI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc Phong Khoa Sinh học, ĐHKHTN Hà Nội MỞ ĐẦU Chi Trà - Camellia thuộc họ Chè - Theaceae thực vật quý Việt Nam Các lồi Camellia khơng có vai trò quan trọng tham gia vào cấu trúc hệ thực vật nhiệt đới vùng núi mà cịn có ý nghĩa mặt kinh tế Nhiều loài Trà dùng làm đồ uống, dầu ăn, làm thuốc đặc biệt phải kể đến giá trị mặt cảnh Các lồi chi Camellia có hoa to đẹp, nhiều màu sắc khác nhau, mùa nở hoa chúng lại vào dịp Tết (từ tháng 10 năm trước đến tháng năm sau) Chính tiềm kinh tế mặt làm cảnh loài chi Camellia lớn, số lồi Trà hoa vàng đặc biệt quan tâm Theo thống kê chưa đầy đủ số lượng lồi chi Camellia lớn (khoảng 300 lồi), nhiều lồi có dạng đồng hình [1] Chính việc phân loại chi Camellia dựa phương pháp phân loại cổ điển như: phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so sánh, đơi gặp phải khó khăn định, cần phải có hỗ trợ phương pháp phân loại đại Thực tế với phát triển sinh học phân tử, phương pháp phân loại phân tử ứng dụng rộng rãi hiệu phân loại học nói chung phân loại thực vật nói riêng Các nhà khoa học chứng minh đối tượng thực vật việc giải trình tự gen mã hố rARN 5,8S số vùng gen khác ITS1, ITS2, microsatellite công cụ hữu hiệu phân loại phân tử.[3] Việc phân loại loài Trà hoa vàng Camellia petelotii Vườn Quốc gia Tam Đảo tồn hai ý kiến trái ngược nhau: ý kiến cho loài Trà loài Trà Camellia chrysantha Trung Quốc một, ý kiến khác lại cho loài khác loài Trà Camellia petelotii lồi đặc hữu Việt Nam, có Vườn Quốc gia Tam Đảo Đến ý kiến chưa đến thống nhất, việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trường hợp cần thiết góp phần đưa đến thống việc phân loại loài Trà Camellia petelotii Trong chúng tơi trình bày kết nghiên cứu nhân gen mã hố rARN 5,8S lồi Trà Camellia petelotii nhằm mục đích phục vụ cho nghiên cứu phân loại phân tử NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Mẫu loài Camellia petelotii Vườn Quốc gia Tam Đảo TS Trần Ninh, môn Thực vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp Các hố chất dụng cụ thí nghiệm hãng Sigma, Bio - Rad, cung cấp đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật Samuel S M Sun cộng (1994) [6] có vài thay đổi cho phù hợp với đối tượng - Phương pháp phát kiểm tra độ ADN điện di gel agarose [5] - Phương pháp nhân gen mã hoá rARN 5,8S kĩ thuật PCR [5] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ Camellia petelotii Chúng tiến hành tách chiết ADN theo qui trình sau: Nghiền 0,75g Nitơ lỏng, bổ sung 5ml đệm chiết 600C (CTAB 2%, NaCl 1,4M,  - mercaptoetanol 0,2%, EDTA 20mM, Tris - HCl 100mM) Ủ mẫu 600C 30 phút, bổ sung hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24: 1), trộn Ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút nhiệt độ phòng Thu pha trên, tủa cồn tuyệt đối, rửa tủa cồn 800 Hoà tan tủa đệm TE Kết kiểm tra có mặt AND tổng số thẻ hiẹn hình Hình 1: ADN tổng số chưa loại ARN loài Camellia petelotii Qua hình ta thấy xuất băng ADN đậm có kích thước khoảng 23.1 kb Kích thước phù hợp với kích thước ADN tổng số thực vật chứng tỏ dịch chiết có chứa ADN tổng số Tuy nhiên băng ADN cịn chưa gọn phía cịn có vệt sáng ARN, chúng tơi tiến hành loại ARN RNase Kết thể hình Hình 2: ADN tổng số loại ARN loài Camellia petelotii M: Marker - ADN cắt Hind III Giếng 1, 2: ADN tổng số loại ARN Qua hình ta thấy băng ADN tổng số sau loại ARN đậm gọn hơn, đồng thời vệt sáng ARN phía hồn tồn biến Điều chứng tỏ ARN dịch chiết loại bỏ hoàn toàn 3.2 Nhân gen mã hoá rARN 5,8S kĩ thuật PCR Để nhân đoạn gen mã hố rARN 5,8S lồi Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá rARN 5,8S chi Camellia Cặp mồi thiết kế dựa việc so sánh trình tự gen ADNr 5,8S cuả loài chi Camellia công bố mạng Internet: Camellia fascicularis Camellia nitidissima Cf: Camellia fascicularis Cn: Camellia nitidissima Hình 3: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen mã hố rARN 5,8S loài Trà Camellia fascicularis Camellia nitidissima Các trình tự xử lý nhờ phần mềm PC - GEN qua có cặp mồi có kí hiệu trình tự sau: HP1 (mồi xi) : 5' GCC CGC CGG GAG CGC GCC CG 3' HP2 (mồi ngược) : 5' GGC CTC CCG AGA CGG CGC GG 3' Sử dụng cặp mồi tiến hành phản ứng PCR với thành phần chu trình nhiệt sau: * Thành phần phản ứng PCR: * Chu trình nhiệt: Hình 4: Phổ điện di sản phẩm PCR L: Ladder - Thang ADN chuẩn 100 bp Giếng 1: Sản phẩm PCR Kết phản ứng PCR thể hình Qua hình ta thấy xuất băng ADN nhất, đậm, gọn có kích thước gần 500bp, phù hợp với kích thước David V Jobes, Lconard B Thien (1997), "A Conserved Motif in the 5,8S ribosomal RNA gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences", Plant moleculer biology reporter, (15), pp 326 - 331 Pauline Nicholson (1997), "extraction of DNA from plant system", Life science news, (23), pp 12 - 14 Sambrook J , Fritsch E F., Maniatis T (1989), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press Samuel S M Sun (1994), Methods in plant moleculer biology and agricultural biotechnology, Asian Vegetable Research and Developement Center, Taiwan SUMMARY The 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species Camellia petelotii - in Tam Dao national park Nguyen Thi Nga, Nguyen Van Mui, Truong Quoc Phong Faculty of Biology HaNoi University of Science Up to now, biologists in the world haven't been agreed be of classifying the yellow tea species - Camellia petelotii yet Some scientists think that Camellia petelotii and Camellia chrysantha belong to only one species, others think they are two different species and Camellia petelotii is endemic to Viet Nam Traditional identification methods can't give out the final opion to stop this argument Therefore, it's neccessary to classify by the modern molecular biology techniques Sequencing 5.8S rDNA is one of those techniques In this article, we expound our results in the 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species - Camellia petelotii - in Tam Dao national park in order to serve molecular classification techniques We have extracted total genomic DNA from the leaves of Camellia petelotii by the method of Samuel S M Sun (1994) with some small modifications The total genomic DNA product we have obtained is enough quantity and purification to research in molecular biology Then we used this total genomic DNA as the template to amplify 5.8S rDNA by PCR technique The 5.8S rDNA specific pair of primers in this reaction have designed based on known 5.8S rDNA sequence of two species in Camellia genus which have been published on the Internet Using this pair of primers, we have amplified 5.8S rDNA of Camellia petelotii with the length approximately 500bp Người thẩm định nội dung khoa học: PGS Trịnh Đình Đạt SO SÁNH KIỂU NHÂN CỦA LOÀI ANOPHELES DIRUS Ở ĐẢO HẢI NAM VÀ ANOPHELES DIRUS PEYTON HARRISON 1979 Ở VIỆT NAM Ngô Giang LiênĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Anopheles dirus vectơ truyền sốt rét Việt Nam Đơng Nam Á Phần lớn lồi muỗi truyền sốt rét phức hợp lồi (chứa từ hai đến nhiều lồi đồng hình) Các lồi đồng hình giống hình thái thực chất chúng cách ly sinh sản thường có đặc điểm sinh học, sinh thái học, tập tính khác vai trị truyền sốt rét khơng đáp ứng với biện pháp phịng chống khác [2,8] Xác định xác thành viên phức hợp lồi có ý nghĩa cho nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, tập tính, vai trị dịch tễ việc lựa chọn biện pháp phòng chống thích hợp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Phương pháp thu thập xử lý mẫu Anopheles dirus nghiên cứu PCG.TS Nguyễn Văn Kim khoa nghiên cứu sốt rét chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh đem từ đảo Hải Nam Trung Quốc sau TS Trần Đức Hinh môn côn trùng viện Sốt rét, Ký sinh trùng Cơn trùng đem trứng ni phịng ni viện cho nghiên cứu Các muỗi sau hút máu ép đẻ nuôi theo gia đình Một số bọ gậy tuổi dùng để nghiên cứu kiểu nhân, số khác dùng để chạy điện di Sử dụng phương pháp nhiễm sắc thể nguyên phân Baimai [2,3], tiêu nhiễm sắc thể sau để tủ ấm (370) 24 nhuộm Giêm sa bảo quản hộp đựng tiêu [1,2] Các ảnh nhiễm sắc thể chụp máy ảnh Olympus BH2, dùng film Technical Pal Film có độ nhạy phù hợp [4] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu Theo sơ đồ nghiên cứu lồi đồng hình (sơ đồ 1) cá thể Anopheles dirus thu thập từ Hải Nam Trung Quốc xử lý phân phối cho nghiên cứu hình thái, di truyền tế bào, sinh hố tập tính Sơ đồ nghiên cứu lồi đồng hình Sử dụng phương pháp làm tiêu nhiễm sắc thể nguyên phân cho thấy Anopheles dirus lồi muỗi khác có kiểu nhân (2n = 6) bao gồm cặp nhiễm sắc thể [2,5] Hai cặp thuộc nhiễm sắc thể thường, cặp thuộc nhiễm sắc thể giới tính Cặp nhiễm sắc thể thường lớn cặp có tâm lệch (submetacentric) cặp thứ hai ngắn có đặc trưng tâm (metacentric) Cặp giới tính (X Y tâm nút) chúng đồng hình (XX) dị hình đực (XY) [4] Phân tích gần 1500 phiếu trung kì từ 200 mẫu ni theo gia đình chúng tơi nhận thấy Anopheles dirus Hải Nam Trung Quốc có đa hình nhiễm sắc thể giới tính Có năm biến dị: ba biến dị thuộc nhiễm sắc thể X hai biến dị thuộc nhiễm sắc thể Y tìm thấy sau 20 đợt phân tích (xem bảng tổng kết số mẫu xử lý) Bảng tổng kết số mẫu xử lí Các biến dị tâm mút khác chủ yếu số lượng phân bố đặc điểm băng dị nhiễm sắc [3] Trong ba nhiễm sắc thể X phân tích, nhiễm sắc thể X1 có băng X2 X3 lại có băng Ngoài độ dài nhiễm sắc thể đặc điểm xem tiêu để phân biệt [3,5] (hình 1) Hình 1: Sơ đồ hoá nhiễm sắc thể Anopheles dirus Các nhiễm sắc thể Y tiêu nhuộm màu dễ dàng phân biệt với nhiễm sắc thể X đặc điểm dị nhiễm sắc Tính đa hình nhiễm sắc thể Y thể độ dài nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) : Y1 nhỏ dấu chấm tiêu Y2 có độ dài gấp lần nhiễm sắc thể Y1 đo dễ dàng trắc vi vật kính (hình 2) Hình - 4: Nhiễm sắc thể kỳ nguyên phân tế bào não bọ gậy tuổi Anopheles dirus Hải Nam Trung Quoc) - 2: X1X2 (con cái; 3: X3Y2 (con đực) 4: X2Y1 (con đực) 3.2 Thảo luận Anopheles dirus phức hợp loài bao gồm thành viên khác kiểu nhân [1,4] mức độ khơng hồ hợp di truyền qua phép lai [2,3] khác biệt ADN đặc điểm sinh học khác [1,7] Sự phân bố rộng rãi Anopheles dirus Đông Nam Á khiến cho nhiều nhà nghiên cứu nhiều công sức để xác định thành viên phức hợp loài Những thành viên tìm thấy từ tây Ấn Độ qua lục địa, Đông Nam Á đến đảo Côn Sơn Việt Nam, đảo Hải Nam Trung Quốc Đài Loan [1,3] Lồi A có mặt vùng trung tâm Đơng bắc Thái Lan, lồi D phân bố theo biên giới Thái Burmese phía bắc vùng tây Pennisula Lồi B chiếm ưu phía nam Pennisula Lồi C tìm thấy phần phía đơng Pennisula Lồi E tìm thấy Ấn Độ loài F xuất biên giới Thái Lan - Mã Lai theo Baimai 1988 [3] Phân tích kiểu nhân Anopheles dirus Hải Nam Trung Quốc cho thấy kết có nhiều điểm tương đồng với kiểu nhân dirus A Peyton Harrison 1979 Loài Anopheles dirus A nghiên cứu nhiều Thái Lan [1] gần đề cập Việt Nam theo Ngô Giang Liên 1996 [6] Theo nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố loài A truyền sốt rét mạnh Thái Lan biện pháp phịng chống sử dụng Thái Lan, Trung Quốc áp dụng Việt Nam, Lào, Camphuchia nước có vectơ truyền sốt rét Tuy nhiên để có kết luận xác lồi cần phải tiến hành thêm nghiên cứu AND (thông qua kỹ thuật PCR, RAPD PCR) [7,8,9,10] Vì khn khổ báo, kỹ thuật giới thiệu tiếp số tới tạp chí LỜI CẢM ƠN Chúng xin bày tỏ lời cảm ơn đến tập thể cán Viện sốt rét, Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương tạo điều kiện thuận lợi việc sử dụng mẫu để hoàn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Baimai.V, 1988 Geographical distribution and bitting bihaviour of four species of The Anopheles dirus complex (Diptera culicidae / in Thai Lan J Med Dubl Mlth Vol 19: 157 - 158 Baimai.V., Harbach R.E and Supratman Sukowati, 1988 Cytogenetic evidene for two sibling species within the current concept of the malario vector Anopheles leicophyrus in Socetheast Asia Journal of The American mosquito control asscociation Vol N0 1: 44 - 50 Baimai, V., R Rattanarithikul, U Kijchalao and C A1998 of Thailand and Southeast Asia II The Maculatus Group, Neocellia Series, subgenus Cellia Mosq Syst 25: 116 - 123 Baimai, V., R G Andre, B A Harrison, U Kijchalao and L Panthusiri 1987 Crossing and chromosomal evidence for two additional sibling species within the taxon Anopheles dirus Peyton and Harrison (Diptera: Culicidae) in Thailan Rroc Entomol Soc Wash 89: 157 - 166 Lien, n.G., T.G Hoc nand T.D Dat 1992 Study on mitotic karyotypes of the species complex of anopheles minimus Theobald 9Diptera: Culicidae) in Vietnam, p 511 ln: Proc XIX Int Congr Entomol [Abstract] Ngô Giang Liên / 1996 Nghiên cứu số đặc điểm di truyền số loài muỗi truyền sốt rét số địa điểm Việt Nam Luận án TS Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A and Collins, F.S (1991) Construction of T - Vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products Nucl Acids Res 19: 1154 Wikerson, R.C., Parsons, T.J., Albright, D.G., Kleln, T.A and Braun, M.J (1993) Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers distinguish cryptic mosquito species (Diptera: Cullcidae: Anopheles) Insect Molec Biol 1: 205 - 211 (1993) Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers Meth Enzymol 218: 704 - 740 10 Zheng, L., Collins, F.11., Kumar, V and Kafatos, F.C (1993) A detailed genetic map for the X chromosome of the malaria vector An gambiae Science 261: 605 - 608 SUMMARY Metaphase karyotypes of Anopheles dirus of Hainam island , China and Anopheles Peyton Harrison 1979 of Khanh Phu, Vietnam Ngo Giang Lien Faculty of Biology, Hanoi University of Science The healthy mosquito specimens were reared individually in the laboratory at Institute of Malaria , Hanoi The brain ganglia of fourth-instar larvae were used for metaphase chromosome preparation employing a modified method as described by Baimai The air-dried slides were stained with Giemsa and mounted in Permount for permanent preparations.The best metaphase spreads of mitotic karyotypes were photographed with Kodak Technical Film using an Olympus photomicroscope with a green filter and an oil immersion lens Metaphase karyotypes of Anopheles dirus showed intraspecific differences based on quantitative variation and distribution of constitutive heterochromatin in the sex chromosomes Anopheles dirus exhibited the most extensive variation in the size and shape of heterochromatic sex chromosomes, with five variation including three types of the X and two types of Y chromosomes The chromosomal analysis of Anopheles dirus from Hainam China and Anopheles Peyton Harrisson 1979 in the Cental of Vietnam was compared In order to give final conclusion we need more studies on Anopheles dirus complex by of the use molecular techniques such as PCR and RAPD_PCR Người thẩm định nội dung khoa học: TS Phạm Thị Khoa ... vàng Camellia petelotii Vườn Quốc gia Tam Đảo tồn hai ý kiến trái ngược nhau: ý kiến cho loài Trà loài Trà Camellia chrysantha Trung Quốc một, ý kiến khác lại cho loài khác loài Trà Camellia petelotii. .. loại bỏ hồn tồn 3.2 Nhân gen mã hố rARN 5,8S kĩ thuật PCR Để nhân đoạn gen mã hoá rARN 5,8S lồi Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá rARN 5,8S chi Camellia Cặp mồi thiết kế... đoạn gen mã hố rARN 5,8S loài Trà Camellia petelotii KẾT LUẬN Đã tách chiết ADN tổng số loài Trà Camellia petelotii Sản phẩm ADN thu đủ hàm lượng độ cho nghiên cứu Đã nhân đoạn gen mã hoá rARN 5,8S