VAI TRÒ TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

PHỤ LỤCGiới thiệu chung về vi sinh vậtKhái niệmĐặc điểm chungCác vai trò tích cực của vi sinh vật trong thực phẩmỨng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm.Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.Sơ lượcQui trình sản xuất nước mắmGiới thiệu về nấm mốc aspergillus oryzaeĐặc điểm nấm mốc aspergillus oryzaeĐiều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzaePhân lập nấm mốc aspergillus oryzaePhương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc aspergillus oryzaePhương pháp nuôi cấy bề mặtPhương pháp nuôi cấy chìmQui trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc asp.oryzaeGiới thiệu chung về vi sinh vật.Khái niệm:VSV là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể nhỏ bé, muốn quan sát chúng ta phải dung kính hiển vi.Đặc điểm chung.Kích thước nhỏ bé.Kích thước của vi sinh vật thường được đo bằng micromet, virut thường được đo bằng nanomet. 1µm= 11000 mm.Chính vì VSV có kích thước nhỏ bé nên diện tích bề mặt của 1 tập đoàn VSV là rất lớn.Hấp thụ nhiều, chuyển hóa nhanh.Vì kích thước nhỏ bé nên vận tốc hấp thụ và chuyển hóa của VSV vượt xa các sinh vật khác.Năng lượng chuyển hóa sinh chất mạnh mẽ của VSV dẫn đến những tác dụng hết sức to lớn của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người.Sinh trưởng nhanh.E.coli cứ 1220 phút lại phân cắt 1 lần.Nấm men Saccharomysec cerevisiae thời gian thế hệ là 120 phút.Tảo Chlorella là 7h.Vi khuẩn lam Nostoc là 23h.Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị.VSV đa số là đơn bào, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống…. do đó rất dễ phát sinh biến dị.Tần số biến dị thường ở mức 〖10〗(5), 〖10〗(10).Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất.VSV sống được ở môi trường nóng đến 130 độ C, lạnh 05 độ C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong.Phân bố rộng, chủng loại nhiều.Có mặt ở khắp nơi trên trái đất.VSV có rất nhiều kiểu dinh dưỡng khác nhau.Trong đường ruột của người thường không dưới 100400 loài VSV khác nhau.Tùy vào môi trường khác nhau thì số lượng VSV sẽ khác nhau.Về chủng loại: VSV có trên 100.000 loài bao gồm 30.000 động vật nguyên sinh, 69000 loài nấm, 23.000 vi tảo, 2500 vi khuẩn lam…….Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đât.VSV hóa thạch cổ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay.Chúng có dạng đơn bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 12mm và có thành tế bào khá dày.Vai trò tích cực của VSV trong thực phẩm.Trong CNTP, VSV có vai trò quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm lên men. Hiện nay, VSV được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều sản phẩm lên men như bia, rượu, tương, chao, thủy sản lên men, rau quả lên men…….Trong công nghệ lên men:+ Có nhiều qua trình lên men khác nhau và thường được gọi bằng tên sản phẩm thu được. Ví dụ: lên men rượu, bia, rượu vang, nước mắm, sữa, nem chua………Sản xuất rượu, bia: nấm men thuộc giống Saccharomyces cerevisine….Rượu vang: S. vini, S.ovifomisBánh mỳ: Họ Saccharomycetace giống Sacchromyces, loài cerevisiae.Sữa: S.thermophilus, S.lactic, S.cremonis, Leus. Cremoris, L.casei, L.lactic…Nem chua: Vi khuẩn lactic thộc giống Streptococcus, Lactobaccillus….Nuớc mắm: aspergillus oryzae ,Microccus có M.alvatus, M.flavus, M.citrecus, M.luteus….. Vi khuẩn lactic: S.facclis, L.plantarum… Trực khuẩn Gr(): Achomolbacter: A.venosum, A.reticulare…..Vsv được ứng dụng tạo màng sinh học(màng chitosan) giúp bảo quản thực phẩm: aspergilus niger Ex 20061, Rhizopus sp.BG,…VSV ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme. Các chế phẩm enzyme này có ứng dụng lớn trong CNTP, y học…….ứng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm. Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.Sơ lược Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá. Chứa hàm lượng đạm lớn.Nước mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam. Do đó chúng ta nên hiểu biết về chúng và giữ gìn truyền thống lâu đời của quê hương của dân tộc. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và công nghệ sản xuất nước mắm được các nhà khoa học đưa ra các kết luận sau: Nước mắm là hỗn hợp acide amin. Các acide amin này được tạo thành do sự thủy phân của protease. Các protease này là do vi sinh vật tổng hợp nên.Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm có nguồn gốc:+ Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí..)+ Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae,asp.nigerMuối có tác dụng ức chế vi sinh vật gây thối, tỷ lệ muối thích hợp là 20 – 25%. Tác dụng làm ngấu và tạo hương ngoài protease của vi sinh vật còn có các enzyme tiêu hóa cơ trong nội tạng cá. Nhiệt độ có tác dụng rất lớn đến hoạt động của các enzyme trong quá trình sản xuất nước mắm. Nhiệt độ thích hợp là 36 – 440C. Trong quá trình thủy phân, độ acide tăng. Ban đầu của quá trình làm nước mắm, môi trường kiềm yếu có tác dụng rất tốt.Qui trình sản xuất nước mắm. Giới thiệu về nấm mốc aspagillus oryzaeĐặc điểm của Aspergillus oryzaeNấm Aspergillus oryzaecó cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, thuộc họ Plectascales, lớp Ascomycetes, cơ thể sinh trưởng là một hệ bao sợi bao gồm những sợi mảnh, chiều ngang khoảng 7µmcác khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng. Nấm Aspergillus oryzaecó hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia. Nấm mốc Aspergillus oryzaesinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase, protease và catalasecó khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.Nấm mốc Aspergillus oryzaelà tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất theo phương pháp vi sinh vật. Một trong số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae là ProteaseĐiều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergilus oryzaeMôi trường thạch PDA (Potato Dextro Agar). Độ ẩm của môi trường: Độ ẩm tốt nhất 55– 60%. Độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45% .Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm từ 85 95% là thích hợp cho nấm mốc.Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi khô. Ảnh hưởng của không khí: Aspergillus oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí.Nồng độ CO2 trong khí quyển 8%. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp khoảng 28 – 320C. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn. Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 270C và không cao quá 360C. Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng Aspgillus oryzae có hoạt động cực đại sinh enzyme amylase ở khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của enzyme protease ở giờ thứ 36 – 42. pH: Môi trường acid yếu 5,5 – 6,0. Phân lập nấm mốc aspergilus oryzaeQuy trình lấy mẫu: có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai ra, rửa sạch

CHỦ ĐỀ:VAI TRÒ TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM PHỤ LỤC

I. Giới thiệu chung về vi sinh vật

1. Khái niệm

2. Đặc điểm chung

3. Các vai trò tích cực của vi sinh vật trong thực phẩm

II. Ứng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm.

1. Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.

a. Sơ lược

b. Qui trình sản xuất nước mắm

2. Giới thiệu về nấm mốc aspergillus oryzae

a. Đặc điểm nấm mốc aspergillus oryzae

b. Điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae

c. Phân lập nấm mốc aspergillus oryzae

III. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc aspergillus oryzae

1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt

2. Phương pháp nuôi cấy chìm

3. Qui trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc asp.oryzae

I. Giới thiệu chung về vi sinh vật.

1. Khái niệm:

- VSV là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể nhỏ bé, muốn quan sát chúng ta phải dung kính hiển vi

2. Đặc điểm chung

a Kích thước nhỏ bé

- Kích thước của vi sinh vật thường được đo bằng micromet, virut thường được đo bằng nanomet 1µm= 1/1000 mm

Chính vì VSV có kích thước nhỏ bé nên diện tích bề mặt của 1 tập đoàn VSV là rất lớn

b Hấp thụ nhiều, chuyển hóa nhanh

- Vì kích thước nhỏ bé nên vận tốc hấp thụ và chuyển hóa của VSV vượt xa các sinh vật khác

- Năng lượng chuyển hóa sinh chất mạnh mẽ của VSV dẫn đến những tác dụng hết sức

to lớn của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người

c Sinh trưởng nhanh

- E.coli cứ 12-20 phút lại phân cắt 1 lần.

- Nấm men Saccharomysec cerevisiae thời gian thế hệ là 120 phút.

- Tảo Chlorella là 7h.

- Vi khuẩn lam Nostoc là 23h.

d Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị

- VSV đa số là đơn bào, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống… do đó rất dễ phát sinh biến dị

- Tần số biến dị thường ở mức ,

- Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất

- VSV sống được ở môi trường nóng đến 130 độ C, lạnh 0-5 độ C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong

e Phân bố rộng, chủng loại nhiều

- Có mặt ở khắp nơi trên trái đất

- VSV có rất nhiều kiểu dinh dưỡng khác nhau

- Trong đường ruột của người thường không dưới 100-400 loài VSV khác nhau

- Tùy vào môi trường khác nhau thì số lượng VSV sẽ khác nhau

- Về chủng loại: VSV có trên 100.000 loài bao gồm 30.000 động vật nguyên sinh,

69000 loài nấm, 23.000 vi tảo, 2500 vi khuẩn lam……

f Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đât

- VSV hóa thạch cổ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay

- Chúng có dạng đơn bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2mm và có thành tế bào khá dày

3. Vai trò tích cực của VSV trong thực phẩm.

Trong CNTP, VSV có vai trò quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm lên men Hiện nay, VSV được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều sản phẩm lên men như bia, rượu, tương, chao, thủy sản lên men, rau quả lên men……

 Trong công nghệ lên men:

+ Có nhiều qua trình lên men khác nhau và thường được gọi bằng tên sản phẩm thu được

Ví dụ: lên men rượu, bia, rượu vang, nước mắm, sữa, nem chua………

 Sản xuất rượu, bia: nấm men thuộc giống Saccharomyces cerevisine….

 Rượu vang: S vini, S.ovifomis

 Bánh mỳ: Họ Saccharomycetace giống Sacchromyces, loài cerevisiae.

 Sữa: S.thermophilus, S.lactic, S.cremonis, Leus Cremoris, L.casei, L.lactic…

 Nem chua: Vi khuẩn lactic thộc giống Streptococcus, Lactobaccillus….

 Nuớc mắm: aspergillus oryzae ,Microccus có M.alvatus, M.flavus, M.citrecus,

M.luteus…

o Vi khuẩn lactic: S.facclis, L.plantarum…

o Trực khuẩn Gr(-): Achomolbacter: A.venosum, A.reticulare…

- Vsv được ứng dụng tạo màng sinh học(màng chitosan) giúp bảo quản thực

phẩm: aspergilus niger Ex 2006-1, Rhizopus sp.BG,…

- VSV ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme Các chế phẩm enzyme này có ứng dụng lớn trong CNTP, y học……

II. ứng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm.

1. Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.

a. Sơ lược

Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá Chứa hàm lượng đạm lớn.Nước mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam Do đó chúng ta nên hiểu biết về chúng và giữ gìn truyền thống lâu đời của quê hương của dân tộc

Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và công nghệ sản xuất nước mắm được các nhà khoa học đưa ra các kết luận sau:

- Nước mắm là hỗn hợp acide amin Các acide amin này được tạo thành do sự thủy phân của protease Các protease này là do vi sinh vật tổng hợp nên

- Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm có nguồn gốc:

+ Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí )

+ Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae, asp.niger

-Muối có tác dụng ức chế vi sinh vật gây thối, tỷ lệ muối thích hợp

là 20 – 25% Tác dụng làm ngấu và tạo hương ngoài protease của

vi sinh vật còn có các enzyme tiêu hóa cơ trong nội tạng cá

Nhiệt độ có tác dụng rất lớn đến hoạt động của các enzyme trong quá trình sản xuất nước mắm Nhiệt độ thích hợp là 36 – 440C

-Trong quá trình thủy phân, độ acide tăng

- Ban đầu của quá trình làm nước mắm, môi trường kiềm yếu có tác dụng rất tốt

b. Qui trình sản xuất nước mắm.

Muối cá

Trộn (ướp) Ủ

(2 ngày) Lên men (6-12 tháng) Chiết rút

Bã

Nước mắm cốt

Lên men

Chiết rút

Dịch nước mắm Phối trộn

Nước mắm thành phẩm Nước muối

2. Giới thiệu về nấm mốc aspagillus oryzae

a. Đặc điểm của Aspergillus oryzae

-Nấm Aspergillus oryzaecó cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, thuộc họ

Plectascales, lớp Ascomycetes, cơ thể sinh trưởng là một hệ bao sợi

bao gồm những sợi mảnh, chiều ngang khoảng 7µmcác khuẩn ty có

nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng

- Nấm Aspergillus oryzaecó hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia

-Nấm mốc Aspergillus oryzaesinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,

protease và catalasecó khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin

-Nấm mốc Aspergillus oryzaelà tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất theo

phương pháp vi sinh vật

-Một trong số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae là

Protease

b. Điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergilus oryzae

 Môi trường thạch PDA (Potato Dextro Agar)

 Độ ẩm của môi trường:

• Độ ẩm tốt nhất 55– 60%

• Độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45%

 Độ ẩm tương đối của không khí:

• Độ ẩm từ 85- 95% là thích hợp cho nấm mốc

• Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi khô

 Ảnh hưởng của không khí:

• Aspergillus oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí.

• Nồng độ CO2 trong khí quyển 8%

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

• Nhiệt độ thích hợp khoảng 28 – 320C

• Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 270C và không cao quá 360C

 Thời gian nuôi nấm mốc:

• Hầu hết các chủng Aspgillus oryzae có hoạt động cực đại sinh enzyme amylase ở

khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của enzyme protease ở giờ thứ 36 – 42

 pH:

• Môi trường acid yếu 5,5 – 6,0

c. Phân lập nấm mốc aspergilus oryzae

 Quy trình lấy mẫu: có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai ra, rửa sạch đất cát bám trên bề mặt miếng khoai tây, cho vào túi nilon mang về phòng thí nghiệm

 Thí nghiệm phân lập:

-Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây

-Lấy 10g mẫu khoai tây cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo mẫu

-Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang một ống nghiệm khác

có chứa 90ml nước cất vô trùng

-Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3,10-4

-Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA:

-Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày

-Nhận biết bằng cách thêm iodine vào trong môi trường trước khi cấy Có tác dụng là chất chỉ thị cho hồ tinh bột

-Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trrong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phếp mốc phát triển trong 72h

III. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc asp.oryzae:

1. Nuôi cấy bề mặt:

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường

đã được tiệt trùng, làm ẩm người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh,… Có chất phụ gia là trấu Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 , phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu Với phương pháp này nồng độ emzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc

sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó Tuy nhiên, phương pháp bề mặt

có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các

mẻ không đồng đều

2. Nuôi cấy chìm:

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon

là đường glucoza, saccharoza Phương pháp nuôi cấy bề mặt sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm một bước gồm: Chuẩn bị môi trường môi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, để tổ chức ssanr xuất Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme và lựa chon tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết cao, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không đảm bảo vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn

3. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc aspergillus oryzae:

Sơ đồ quy trình:

Môi trường

Nuôi cấy

Sử dụng enzyme thô Chế phẩm thô

Thức ăn chăn nuôi Bã

Trích ly

Kết tủa enzyme

Ly tâm

Thu nhận kết tủa

Thuyết minh quy trình:

• Môi trường:

- Mục đích: chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phếp vi sinh vật phát triển tốt.

- Cách tiến hành: nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10-20%

chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37-59% Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 , (NH4)2CO), phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu cac phụ phẩm thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu, mùn cưa,…

• Nuôi cấy:

- Mục đích: tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme.

- Cách tiến hành: sau khi đã trộn giống, môi trường được rãi đều ra các khay với chiều

dài 2-3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải

có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 28 C-32 C, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự⁰ ⁰ phát triển của sợi nấm

Trong quá trình nuôi cấy ta không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi trường

Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Điều này còn phụ thuộc vào chủng mốc asp.oryzae, điều kiện môi trường cũng như kĩ thuật nuôi cấy

- Thiết bị: khay nuôi cấy bề mặt.

Nghiền và bảo quản

Chế phẩm enzyme Sấy

Khay nuôi cấy

- Thông số kĩ thuật:

+ Dày 4-5cm

+ Cao 1-1,2m

- Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khôi môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành Trong giai đoạn này không được đưa nhiệt độ cao quá 30 C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với⁰ nhiệt độ

- Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-50 C, các chất dinh dưỡng giảm⁰ nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme protease được tổng hợp mạnh, lượng O2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-30 C là tốt nhất.⁰

- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi như sau: quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng

sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất

•Chế phẩm thô:

- Mục đích: thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme

thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước

- Cách tiến hành: để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường

sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (thường dùng là máy sấy chân không) Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-40 C, enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-76 C, độ ẩm sau khi kết⁰ ⁰ thúc sấy nhỏ hơn 10%

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quản lâu hơn

•Trích ly:

- Mục đích: tách enzyme ra khỏi khối môi trường.

- Cách tiến hành: sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme Các

loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như dung môi hòa tan Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc

- Thiết bị: thiết bị trích ly kiểu thùng quay

\

- Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 25 C⁰

+ Thời gian 40-60 phút

•Kết tủa enzyme:

- Mục đích: thu nhận dung dịch enzyme.

- Cách tiến hành: trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc

sufatmon Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme Cứ một phần dung dịch enzyme thô cho 2-2,5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy