Những hiểu biết hiện nay về vi khuẩn lậu và bệnh lậu

i. Những hiểu biết hiện nay về vi khuẩn lậu 1.1. Lịch sử Bệnh lậu là một trong những bệnh đ−ợc loài ng−ời biết đến sớm nhất và là phát hiện thứ hai sau Bacillus anthracis [23]. Có nhiều bài tổng quan về lịch sử bệnh lậu, một trong những bài tổng quan xuất sắc nhất là chuyên khảo R.S. Morton [57]. Bệnh lậu đ−ợc cả các tác giả kinh thánh biết tới và họ đã cảnh báo về sự lây truyền qua tiếp xúc ng−ời nhiễm bệnh. The Book of Leviticus mô tả: ng−ời bị chảy mủ niệu đạo phải tự tránh xa ng−ời khác trong 7 ngày, điều này cho thấy họ đã biết thời gian ủ bệnh trung bình là 7 ngày. Vào thế kỷ thứ IV và V tr−ớc Công nguyên, Hippocrates đã viết rất nhiều về bệnh lậu. Ông gọi bệnh lậu cấp là “chứng đái són đau” và hiểu rằng bệnh là kết quả “khoái lạc của Thần Vệ nữ” [42]. Thầy thuốc La Mã Celsus có những hiểu biết sâu rộng về bệnh lậu, các biến chứng của nó và ông cũng biết cách thông tiểu cho bệnh nhân bị hẹp niệu đạo. Vào thế kỷ thứ II Galen (năm 130 sau công nguyên) đã đặt ra từ gonorrhea, hàm ý là “dòng chảy của tinh dịch”. Các thầy thuốc Hy Lạp-La Mã khác đã mô tả các cách khác nhau để điều trị bệnh lậu, bao gồm kiêng quan hệ tình dục và rửa mắt cho trẻ sơ sinh. ở châu Âu, những hiểu biết về bệnh lậu và các bệnh lây truyền qua đ−ờng tình dục khác còn rất ít cho tới cuối thời kỳ Trung cổ. Thuật ngữ clap lần đầu tiên xuất hiện trên các ấn phẩm vào năm 1378 và thuật ngữ này th−ờng đ−ợc dùng để chỉ bệnh lậu, tuy ch−a biết rõ về nguồn gốc của từ clap nh−ng có thể đây là từ ám chỉ quận Les Clapier thuộc Paris, nơi trú ngụ của gái mại dâm thời Trung cổ. Có thể có những nguồn gốc khác của thuật ngữ clap, nh−ng cho dù có nguồn gốc là gì thì trong các tài liệu của châu Âu vào cuối thời Trung cổ ng−ời ta đã biết rõ bệnh có liên quan tới quan hệ tình dục. Sau khi bệnh giang mai lan tới châu Âu vào cuối thế kỷ XV, có sự nhầm lẫn đáng kể về mối liên quan giữa bệnh lậu và bệnh giang mai. Các nhà phẫu thuật lớn nh− Ambroise Paré (thế kỷ XVI) và John Hunter (thế kỷ XVIII) coi bệnh giang mai và bệnh lậu là những biểu hiện khác nhau của cùng một bệnh. Kết luận của Hunter là kết quả của một thí nghiệm nổi tiếng, ông tiêm cho chính mình chất lấy từ một bệnh nhân bị bệnh lậu. Hậu quả là ông bị bệnh giang mai vì bệnh nhân này mắc cả bệnh lậu và bệnh giang mai [24]. Trong suốt thế kỷ thứ XIX vấn đề này không đ−ợc giải quyết. Cho tới khi nhà hoa liễu học ng−ời Pháp, ông Philippe Ricord (1799 - 1889) đã phân biệt đ−ợc hai bệnh này bằng một loạt các thực nghiệm [17], nh−ng hiểu biết thực sự về bệnh lậu chỉ đạt đ−ợc sau mô tả của Albert- Neisser (1855 - 1916) về Neisseria gonorrhoeae vào năm 1879 và nuôi cấy vi khuẩn lần đầu tiên trên môi tr−ờng nhân tạo của Leistikow và Loeffler vào năm 1882. Năm 1962, môi tr−ờng Thayer-Martin [72] tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán bệnh lậu và làm tăng tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng nuôi cấy. Từ giữa năm 1960, những hiểu biết về cấu trúc phân tử của vi khuẩn lậu, vật chủ và dịch tễ học bệnh lậu đã tăng lên. Thế kỷ 20 đã có đ−ợc liệu pháp mới, an toàn, hiệu quả cao trong điều trị bệnh lậu, thay thế cho những liệu pháp đôi khi rất mạo hiểm đ−ợc dùng trong các thế kỷ tr−ớc, bao gồm dùng chất làm se niệu đạo, thông dò và các dụng cụ cơ học khác. Sulfonamid đ−ợc giới thiệu lần đầu vào năm 1930 penicillin vào năm 1943 đã có một b−ớc đột phá trong điều trị bệnh lậu. B−ớc phát triển lớn thứ 2 trong thế kỷ này có liên quan tới cuộc cách mạng trong hiểu biết cơ chế bệnh sinh của loại vi khuẩn lôi cuốn này, bắt đầu với sự chứng minh của Kellogg và cộng sự vào năm 1963 cho rằng có những khác biệt trong độc tính của vi khuẩn lậu với những hình thái khuẩn lạc khác nhau [41]. Những b−ớc phát triển này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế vi khuẩn lậu gây nhiễm tái đi tái lại trên cùng một ng−ời và có thể giúp triển khai một vắcxin hiệu quả.

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ y tế

Trường đại học y hà nội

Lê văn hưng

Chuyên đề 1

Những hiểu biết hiện nay về vi khuẩn lậu và bệnh lậu

Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y học: "Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen

kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử

tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"

Chuyên ngành Vi sinh vật Mã số: 62.72.68.01

Hà Nội - 2008

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ y tế

Trường đại học y hà nội

Lê văn hưng

Chuyên đề 1

Những hiểu biết hiện nay về vi khuẩn lậu và bệnh lậu

Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y học: "Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen

kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử

tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"

Chuyên ngành Vi sinh vật Mã số: 62.72.68.01

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phương

Hà Nội - 2008

Chữ viết tắt

AAGAP Ala-Ala-Glu-Ala-Pro

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

BAC Bacterium artificial chromosomes

BSA Bovine Serum Abumin

cat chloramphenicol acetyltransferase

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CMRNG Chromosomally mediated resistant N gonorrhoeae: N

gonorhoeae kháng thuốc qua trung gian nhiễm sắc thể

CSWs Commercial sex workers: gái mại dâm

DGI Disseminated gonococcal infection: nhiễm vi khuẩn lậu lan tỏa DMSO Dimethyl sulfoxide

Fbp Ferric binding protein: protein gắn sắt

FDA Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm và

dược phẩm FrpB Fe-regulated protein B: protein điều hòa sắt

Frps Ferric-repressible proteins: Các protein ức chế sắt

GASP Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme: chương

trình giám sát toàn cầu về độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu với kháng sinh

HAM Homosexually active male: đồng tính luyến ái nam

KDO Ketodeoxy deoxy octanoic acid

LCR Ligase chain reaction: phản ứng chuỗi ligase

LF Lactoferrin

LOS lipo-oligosaccharide

LPS Lipopolysacharide

LTQĐTD Lây truyền qua đường tình dục

Met Methionin

MIC Minimum inhibitory concentration: nồng độ ức chế tối thiểu

mM Mili mole

NAG Nonagglutination: Không ngưng kết

PBPs Penicillin-binding proteins: protein gắn Penicillin

PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase

PFGE Pulsed field gel electrophoresis: điện di trường xung

Por Protein porin

PPNG Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu

sản sinh men Penicillinase

QRNG Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu kháng

Quinolone RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: kỹ thuật đa hình

chiều dài đoạn cắt giới hạn Rmp Reduction modifiable protein: protein có thể biến đổi khử

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: điện

di trên gel polyacrylamid STD Sexually Transmitted Disease: bệnh lây truyền qua đường tình

dục TEM Transfer Electronic Microscopy: Kính hiển vi điện tử dẫn truyền

TF Transferin

Tm Melting temperature: nhiệt độ biến tính

TMA Transcription-mediated amplification: khuếch đại qua trung gian

bản sao TRNG Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu

kháng tetracycline WHO World Health Organization: tổ chức Y tế thế giới

1.15 M«i tr−êng b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn vi

2.10 Viªm mµng trong tim vµ viªm mµng n·o do

2.11.1 XÐt nghiÖm trùc tiÕp 29

2.11.2 C¸c kü thuËt chÈn ®o¸n kh«ng nu«i cÊy 30

1

i Những hiểu biết hiện nay về vi khuẩn lậu

1.1 Lịch sử

Bệnh lậu là một trong những bệnh được loài người biết đến sớm nhất và là

phát hiện thứ hai sau Bacillus anthracis [23] Có nhiều bài tổng quan về lịch

sử bệnh lậu, một trong những bài tổng quan xuất sắc nhất là chuyên khảo R.S Morton [57] Bệnh lậu được cả các tác giả kinh thánh biết tới và họ đã cảnh báo về sự lây truyền qua tiếp xúc người nhiễm bệnh The Book of Leviticus mô tả: người bị chảy mủ niệu đạo phải tự tránh xa người khác trong 7 ngày,

điều này cho thấy họ đã biết thời gian ủ bệnh trung bình là 7 ngày Vào thế kỷ thứ IV và V trước Công nguyên, Hippocrates đã viết rất nhiều về bệnh lậu

Ông gọi bệnh lậu cấp là “chứng đái són đau” và hiểu rằng bệnh là kết quả

“khoái lạc của Thần Vệ nữ” [42] Thầy thuốc La Mã Celsus có những hiểu biết sâu rộng về bệnh lậu, các biến chứng của nó và ông cũng biết cách thông tiểu cho bệnh nhân bị hẹp niệu đạo Vào thế kỷ thứ II Galen (năm 130 sau

công nguyên) đã đặt ra từ gonorrhea, hàm ý là “dòng chảy của tinh dịch” Các

thầy thuốc Hy Lạp-La Mã khác đã mô tả các cách khác nhau để điều trị bệnh lậu, bao gồm kiêng quan hệ tình dục và rửa mắt cho trẻ sơ sinh

ở châu Âu, những hiểu biết về bệnh lậu và các bệnh lây truyền qua đường tình dục khác còn rất ít cho tới cuối thời kỳ Trung cổ Thuật ngữ clap lần đầu tiên xuất hiện trên các ấn phẩm vào năm 1378 và thuật ngữ này thường được dùng để chỉ bệnh lậu, tuy chưa biết rõ về nguồn gốc của từ clap nhưng có thể

đây là từ ám chỉ quận Les Clapier thuộc Paris, nơi trú ngụ của gái mại dâm thời Trung cổ Có thể có những nguồn gốc khác của thuật ngữ clap, nhưng cho

dù có nguồn gốc là gì thì trong các tài liệu của châu Âu vào cuối thời Trung

cổ người ta đã biết rõ bệnh có liên quan tới quan hệ tình dục

2

Sau khi bệnh giang mai lan tới châu Âu vào cuối thế kỷ XV, có sự nhầm lẫn

đáng kể về mối liên quan giữa bệnh lậu và bệnh giang mai Các nhà phẫu thuật lớn như Ambroise Paré (thế kỷ XVI) và John Hunter (thế kỷ XVIII) coi bệnh giang mai và bệnh lậu là những biểu hiện khác nhau của cùng một bệnh Kết luận của Hunter là kết quả của một thí nghiệm nổi tiếng, ông tiêm cho chính mình chất lấy từ một bệnh nhân bị bệnh lậu Hậu quả là ông bị bệnh giang mai vì bệnh nhân này mắc cả bệnh lậu và bệnh giang mai [24] Trong suốt thế kỷ thứ XIX vấn đề này không được giải quyết Cho tới khi nhà hoa liễu học người Pháp, ông Philippe Ricord (1799 - 1889) đã phân biệt được hai bệnh này bằng một loạt các thực nghiệm [17], nhưng hiểu biết thực sự về bệnh

lậu chỉ đạt được sau mô tả của Albert- Neisser (1855 - 1916) về Neisseria gonorrhoeae vào năm 1879 và nuôi cấy vi khuẩn lần đầu tiên trên môi trường

nhân tạo của Leistikow và Loeffler vào năm 1882 Năm 1962, môi trường Thayer-Martin [72] tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán bệnh lậu và làm tăng tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng nuôi cấy Từ giữa năm 1960, những hiểu biết về cấu trúc phân tử của vi khuẩn lậu, vật chủ và dịch tễ học bệnh lậu

đã tăng lên

Thế kỷ 20 đã có được liệu pháp mới, an toàn, hiệu quả cao trong điều trị bệnh lậu, thay thế cho những liệu pháp đôi khi rất mạo hiểm được dùng trong các thế kỷ trước, bao gồm dùng chất làm se niệu đạo, thông dò và các dụng cụ cơ học khác Sulfonamid được giới thiệu lần đầu vào năm 1930 [9] và penicillin vào năm 1943 đã có một bước đột phá trong điều trị bệnh lậu Bước phát triển lớn thứ 2 trong thế kỷ này có liên quan tới cuộc cách mạng trong hiểu biết cơ chế bệnh sinh của loại vi khuẩn lôi cuốn này, bắt đầu với sự chứng minh của Kellogg và cộng sự vào năm 1963 cho rằng có những khác biệt trong độc tính của vi khuẩn lậu với những hình thái khuẩn lạc khác nhau [41] Những bước phát triển này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế vi khuẩn lậu gây

3

nhiễm tái đi tái lại trên cùng một người và có thể giúp triển khai một vắcxin hiệu quả

1.2 Hình thể của vi khuẩn lậu

Vi khuẩn lậu Neisseria gonorrhoeae thuộc họ Neisseriaceae Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh; chúng khác biệt nhau về một số

tính chất sinh vật hoá học (lên men đường glucose và không sinh hơi khi sử dụng một số loại đường) Dựa vào tính chất này, người ta phân biệt vi khuẩn

lậu với một số Neisseria hoại sinh khác

Trên tiêu bản lấy mủ từ bệnh nhân bị bệnh lậu và nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn hình hạt cà phê đứng thành đôi, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram-âm, có kích thước 0,6àm x 0,8àm, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng Khi ở trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu là loại vi khuẩn độc chiếm tế bào bạch cầu đa nhân trung tính (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống trong tế bào) Người ta có thể gặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều cặp, có khi xếp lèn chặt trong lòng

tế bào bạch cầu đa nhân trung tính Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không

có lông, không có fibria (tiêm mao), một số chủng vi khuẩn lậu có pili Tính chất bắt mầu, vị trí nằm trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính của vi khuẩn lậu có giá trị lớn trong chẩn đoán xác định khi kết hợp với tiền sử bệnh và triệu chứng lâm sàng

Năm 1963, Kellogg thấy vi khuẩn lậu xuất hiện theo kiểu đa nhóm khi phát triển trên môi trường agar và có sự lây truyền chéo [41] Khuẩn lạc týp 1 và týp 2 sáng, lồi dễ phân biệt với khuẩn lạc týp 3 và týp 4 lớn và dẹt hơn Hiện tại khuẩn lạc nhỏ được biết pilin hóa và được xác định là P+; khuẩn lạc lớn không pilin hóa (P-) Các týp của khuẩn lạc hay thay đổi, mặc dù khi mới cách

ly khỏi bệnh nhân thường là P+, chuyển không chọn lọc in vitro thường đảo ngược thành P- [41]

4

Kiểu thay đổi hình thái học thứ 2 có liên quan tới vết mờ đục ở vùng khuẩn lạc khi nhìn qua kính hiển vi có độ phóng đại thấp với ánh sáng thích hợp Khuẩn lạc không rõ (Op) sẫm hơn và nhiều hạt hơn khuẩn lạc rõ rệt (Tr) Các kiểu týp khuẩn lạc Op và Tr biến đổi ngược nhau trong in vitro [76]

Hình 1.1: Vi khuẩn lậu nhuộm Gram từ khuẩn lạc Hình 1.2: Vi khuẩn lậu nhuộm Gram từ dịch

1.3 Sự lây truyền

Người là vật chủ tự nhiên duy nhất của vi khuẩn lậu Chúng chỉ sống được một thời gian ngắn bên ngoài cơ thể người Mặc dù vi khuẩn lậu có thể tồn tại trong môi trường khô như bệt vệ sinh tới 24 giờ sau khi được phun nhân tạo với số lượng lớn vi khuẩn lên bề mặt nhưng hầu như không có bằng chứng nào cho thấy lây truyền tự nhiên xảy ra từ bệt vệ sinh hoặc các vật thể tương tự Vi khuẩn lậu là một ví dụ kinh điển của bệnh nhiễm trùng lây qua tiếp xúc: tiếp xúc vật lý với bề mặt niêm mạc của người bị nhiễm bệnh

Màng não cầu có thể lan truyền qua dịch tiết trong không khí với khoảng cách ngắn Nhưng vi khuẩn lậu thì chưa có thông báo nào đề cập đến sự lan truyền giống như những bệnh do màng não cầu gây nên

1.4 Định týp vi khuẩn

Để nghiên cứu dịch tễ học, cần phải định týp vi khuẩn Có nhiều kỹ thuật đã

được triển khai và áp dụng thành công cho mục đích này

và một chủng không thể mọc nếu trong môi trường dinh dưỡng không có arginin được gọi là Arg- Vi khuẩn lậu phân lập phân lập từ người bệnh biểu hiện tính đa dạng rõ rệt về khả năng sinh tổng hợp, có thể phản ánh môi trường giầu dinh dưỡng của vật chủ, cung cấp cho vi khuẩn phần lớn các hợp chất cần thiết cho sự phát triển của chúng Các nghiên cứu di truyền cho thấy các chủng có kiểu hình dinh dưỡng như nhau (thí dụ Arg-) có thể có nhiều đột biến theo một chu trình hóa sinh nhất định [72] Hệ thống định týp dinh dưỡng

được sử dụng thành công trong các nghiên cứu dịch tễ khác nhau [38] Một số týp dinh dưỡng rất quan trọng về sinh học và dịch tễ học, thí dụ, Arg- Hyx- (hypoxanthin-) Ura- (uracil-) Týp dinh dưỡng thường liên quan tới nhiều đặc tính khác nhau như xu hướng gây nhiễm trùng niệu đạo nam không triệu chứng, tăng khả năng gây nhiễm khuẩn huyết và các đặc tính khác [20] Do sự phức tạp của một hệ thống môi trường với từng hóa chất riêng biệt và thời gian bảo quản ngắn, kỹ thuật định týp dinh dưỡng thường không được áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng

1.4.2 Týp huyết thanh

Các nhà nghiên cứu đã cố gắng phát triển một hệ thống định týp huyết thanh trong nhiều thập kỷ Hiện tại kỹ thuật đang được dùng phổ biến nhất cho mục đích này là dựa vào kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitope khác nhau trên protein P.I hoặc Por của màng ngoài (outer membrane) [44] Por xuất hiện trong 2 nhóm huyết thanh khác nhau về hóa miễn dịch: PorA và

6

PorB Dùng một bộ kháng thể đơn dòng kháng những chủng PorA và một bộ khác kháng những chủng PorB, có thể phân nhỏ mỗi nhóm huyết thanh thành một loạt các serovar khác nhau (ví dụ P.IA-6, P.IA-1); chúng khác nhau về khả năng phản ứng với những thành viên nhất định của một bộ (panel) kháng thể đơn dòng Hàng loạt serovar đặc hiệu đã được xác định bằng kỹ thuật này

[38], [44]

1.4.3 Độ nhạy với thuốc kháng sinh

Phương pháp định týp vi khuẩn lậu là dựa vào độ nhạy với thuốc kháng sinh

đã được sử dụng rộng rãi để bổ sung cho hệ thống định týp dinh dưỡng và týp huyết thanh, nhưng khả năng vi khuẩn lậu chuyển tính kháng kháng sinh giữa các chủng làm giảm việc sử dụng của phương pháp này trong các nghiên cứu dịch tễ học dài ngày

1.4.4 Xác định kiểu gen

Việc định týp vi khuẩn có thể dựa vào xác định ADN nhằm tìm hiểu có những khác biệt rõ rệt trong cấu trúc ADN giữa các chủng hay không Sẽ không thực tế nếu muốn lập bản đồ toàn bộ bộ gen, hoặc xác định trình tự một hay một vài gen, song có thể dùng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá nhanh sự khác biệt trong trình tự ADN Kỹ thuật đầu tiên là dùng enzyme giới hạn endonuclease, dựa vào phân tích kiểu cách các băng ADN trên gel agarose [21], [61] Một phương pháp khác được gọi là PCR (polymerase chain reaction) được mồi ngẫu nhiên; ở đây dùng các đoạn mồi ADN ngắn gắn với nhiều vị trí để tạo thành sản phẩm ADN trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase Có lẽ được sử dụng nhiều nhất cho mục đích dịch tễ là kỹ thuật

định týp Opa: dùng đoạn mồi PCR cho Opa để tạo ADN từ mỗi gen của khoảng 11 gen Opa Những đoạn ADN này sau đó được cắt bởi enzyme giới hạn và kết quả của kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để so sánh các chủng Phối hợp với những hệ thông định týp khác, xác định kiểu gen đã góp phần giải quyết hiệu quả việc định týp vi khuẩn [62]

thấy các mụn nước nhỏ ở màng ngoài qua TEM Không giống Escherichia coli và nhiều vi khuẩn đường ruột khác, vi khuẩn lậu thường giải phóng các

mảnh vỡ của màng vào môi trường xung quanh thành phần độc và các mảnh kháng nguyên gắn vào kháng thể vật chủ [8], [25]

1.5.2 Pili

Những phần quan trọng nhất của vi khuẩn lậu trong bệnh nguyên có liên quan tới các phân tử bề mặt bao gồm đính kèm, xâm lấn hay tổn thương vật chủ hoặc phù hợp với các mục đích của việc phòng ngừa miễn dịch cho vật chủ Một trong số các phân tử bề mặt được nghiên cứu kỹ nhất là pili Nhìn dưới kính hiển vi điện tử, pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợp sợi và hầu như che phủ toàn bộ bề mặt tế bào bên ngoài vi khuẩn Thực tế pili là các polymer

có lẽ tạo nên hàng nghìn cấu trúc dưới phân tử khoảng 18 kDa [8] Hiện nay, người ta biết nhiều về cấu trúc dưới phân tử pili, khi đánh giá bằng tinh thể học X-quang [25] Pili được biết làm tăng sự bám dính vào các mô của vật chủ

1.5.3 Protein porin (por)

Các protein màng ngoài của vi khuẩn lậu được hòa tan và kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel dodecyl sulfat natri-polyacrylamid (SDS-PAGE), đã nhìn thấy nhiều protein Thông thường, protein dễ thấy nhất trên SDS-PAGE này là protein 34kDa - 36kDa trước kia được gọi là P.I nhưng nay được gọi là Por

8

Por bộc lộ trên bề mặt màng ngoài và ở trạng thái tự nhiên trong màng tồn tại

rõ rệt như chất tam phân [5] Màng ngoài, về tự nhiên nó gần như oligosaccharid (LOS) và cũng giảm protein có thể biến đổi (Rmp) [36] Rõ ràng Por thực hiện nhiều chức năng đối với vi khuẩn lậu, bao gồm hình thành kênh đặc trưng anion qua màng ngoài giầu lipid Por tồn tại trong 2 lớp hóa học và miễn dịch quan trọng riêng được gọi là PorA và PorB Một chủng quy

lipo-định có PorA hoặc PorB nhưng không bao giờ có cả hai Chúng biểu hiện nhiều kháng nguyên của 2 loại protein porin quan trọng này [44] Cấu trúc ban

đầu của nhiều protein porin được xác định bằng chuỗi ADN [27] Cấu trúc này giống với các protein porin trong vi khuẩn gram-âm khác So với chuỗi của PorA và PorB biểu hiện ở các vùng nào đó, hay gặp ở vùng có cả 2 loại protein

và các vị trí khác có biến đổi lớn [27] Những vùng có khả năng thay đổi này

có thể biểu hiện các vùng đa kháng nguyên Gen porA và porB là các allen

của một vị trí

1.5.4 Protein H8

Kháng thể đơn dòng (MAb) được gọi là H8 phản ứng với kháng nguyên bảo tồn thấy trên tất cả vi khuẩn lậu và màng não cầu và trên N lactamica và N cinerea, nhưng không phản ứng với Neisseria không gây bệnh khác Trong vi khuẩn lậu và màng não cầu, có ít nhất 2 protein chứa epitope gắn kháng thể

đơn dòng H8 Một là lipo-protein chứa 5 phần chưa hoàn chỉnh của peptid Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (AAGAP) tại vùng N giới hạn và chuỗi giống azurin tại vùng C giới hạn Azurin là những protein chứa đồng có thể chuyên chở điện

tử Vẫn chưa biết chức năng của protein giống azurin vi khuẩn lậu Protein gắn kháng thể đơn dòng H.8 thứ 2 không có các chuỗi liên quan tới azurin và trước tiên hình thành 13 phần lặp lại của peptid AAGAP Trong thời gian hồi phục bệnh lậu, người bệnh sản sinh kháng thể chống lại protein H.8, nhưng vẫn chưa biết vai trò bệnh sinh [4]

9

1.5.5 Protein ức chế sắt hoặc ôxy

Mặc dù tất cả các protein đã bàn luận từ trước có thể loại trừ pili (được biểu hiện dưới tất cả các bệnh tăng trưởng), tính đa dạng của các protein khác chỉ biểu hiện dưới một vài bệnh nào đó, bao gồm thiếu sắt, phát triển kỵ khí, hoặc các tình huống ức chế tăng trưởng khác Các protein ức chế sắt (Frps) bao gồm protein 37kDa và một vài protein gần phạm vi 65 tới hơn 100kDa [55] Protein 37kDa được gọi là protein gắn sắt (Fbp) vì nó chứa sắt và liên quan tới việc vận chuyển sắt Gần như tất cả vi khuẩn lậu và màng não cầu biểu hiện một Fbp bảo tồn kháng nguyên Protein 70kDa được gọi là FrpB trên màng ngoài cũng hay gặp gần như ở tất cả vi khuẩn lậu và màng não cầu [3] Vẫn chưa biết chức năng của nó, mặc dù cấu trúc dự báo này rõ ràng gợi ý bằng cách này hay cách khác nó liên quan tới vận chuyển sắt vì nó là một thành viên của

họ TonB-box, gần như tất cả đều là thụ thể Nhiều protein ức chế sắt khác hiện vẫn chưa được biết là thụ thể, hoặc với transferin (TF), lactoferrin (LF), hay hemoglobin (Hb) Mỗi thụ thể gắn với phần tương ứng của nó (TF, LF, hoặc Hb) rất đặc trưng và cần phải gắn trước khi sắt rời khỏi phần tương ứng và chuyển vào tế bào Mỗi thụ thể gồm lipoprotein ức chế bề mặt một cách lỏng lẻo và một protein màng trong hoạt động cùng với nhau Chức năng của chúng trong việc tiếp nhận sắt phụ thuộc vào việc truyền năng lượng tới thụ thể màng ngoài qua protein màng trong TonB Gần như tất cả vi khuẩn lậu sản sinh một thụ thể TF và Hb chức năng, mặc dù khoảng một nửa số vi khuẩn lậu không sản sinh thụ thể LF chức năng [2]

1.5.6 Lipo Oligo Saccharid (LOS)

Tất cả vi khuẩn lậu đều có LOS trên bề mặt tế bào, tương tự lipopolysacharid (LPS) của các vi khuẩn Gram-âm khác LOS của vi khuẩn lậu chứa một nửa là lipid A và một nửa là polysacharid lõi gồm KDO (ketodeoxy deoxy octanoic acid), heptose, glucose, galactose và glucosamin

hoặc galactosamin Như vậy LOS của vi khuẩn lậu rõ ràng nhỏ hơn LPS điểm hình của các vi khuẩn Gram-âm khác Những đường cốt lõi của LOS tạo nên kháng nguyên của vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch diệt khuẩn; những kiểu hình khác nhau của kháng nguyên lại có thể

là quan trọng trong sinh bệnh học Quả thực, nhiều chứng cứ cho rằng vi khuẩn lậu với LOS "ngắn" thì nhạy cảm huyết thanh nhưng lại có thể xâm nhập tế bào chủ; còn những vi khuẩn lậu với những LOS "dài" thì đề kháng huyết thanh và không xâm nhập được [28], [30]

1.5.7 Protein Opa

Protein Opa (trước đây gọi là protein II hoặc P.II) tham gia vào việc bám dính tế bào niêm mạc và khả năng biến đổi theo độ nóng Những protein này thay đổi độ lớn từ khoảng 24 đến khoảng 28kDa và nếu đem đun nóng tới

100oC sẽ có cấu trúc phân tử khác, biểu hiện là trọng lượng phân tử cao hơn trên SDS-PAGE Một chủng nhất định có thể tạo ra ít nhất là 10 dạng khác nhau cũng là những kháng nguyên của họ protein Opa, ví dụ OpaA, OpaB, OpaC Họ Opa tồn tại cả 2 pha Opa+ và Opa- Hầu hết nếu Opa+ thì làm tăng

độ đục khuẩn lạc còn Opa- thì khuẩn lạc trong

1.5.8 Các cấu trúc bề mặt khác

Peptidoglycan của vi khuẩn lậu giống với peptidoglycan của vi khuẩn

gram-âm khác, chứa thành phần chính của acid muramic và N-acetylglucosamin, nhưng hiếm ở mức O-acetyl hóa [65] Điều này có thể phù hợp với khả năng nhạy cảm của các mảnh peptidoglycan với vi khuẩn thối rữa và các đặc tính sinh học khác Vi khuẩn lậu không có một vỏ polysaccharid thực sự mặc dù một vài báo cáo trước đây cho kết quả trái ngược Tuy nhiên, vi khuẩn lậu sản sinh polyphosphat bề mặt (vỏ giả), có thể phù hợp với một số chức năng của

vỏ polysaccharid, bao gồm dự phòng bề mặt tế bào hút nước và không tấn công Hiện vẫn chưa biết vai trò polyphosphat "vỏ giả" trong sinh học và bệnh

sinh của vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu cũng gắn polyanion tấn công với protein Opa, làm thay đổi sự tấn công bề mặt tế bào và cũng có khả năng bị giết bởi huyết thanh người bình thường [11]

Một số cấu trúc vi khuẩn lậu liên quan tới bệnh sinh

Cấu trúc (viết tắt) Chức năng trong viêm nhiễm

Por Vào màng tế bào vật chủ Mục tiêu đối với các kháng

thể diệt khuẩn, có tác dụng của opsonin

Rmp Mục tiêu đối với các kháng thể chặn

Pili Bám dính Chống lại bạch cầu trung tính

Lipo-oligosaccharid Gây độc cho mô

Mục tiêu của các kháng thể diệt khuẩn, hóa chất Peptidoglycan Gây độc cho mô

Protein ức chế sắt Hấp thu sắt từ transferrin, lactoferin, hemoglobin Protease IgA1 Thoát khỏi IgA1 niêm mạc

1.6 Hệ thống di truyền

Có hai hệ thống chủ yếu để tiến hành phân tích chất liệu di truyền của vi khuẩn lậu là biến nạp và tiếp hợp (transformation and conjugation) Người ta chưa tìm thấy phage và vai trò lớn của transposon đối với sự đề kháng ở vi khuẩn lậu Đến nay phát hiện thấy transposon gây những biến đổi nhiễm sắc thể của vi khuẩn lậu Vì vậy, Seifertso và cộng sự đã triển khai một hệ thống

đột biến gen "con thoi" rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền, trong đó gen chloramphenicol acetyltransferase (cat) (hoặc một gen kháng kháng sinh khác) thế chỗ β-lactamase (penicilinase) trên transposon Tn3 [70] Các hệ thống đột biến gen "con thoi" tạo ra những đột biến ở một đoạn trên ADN của

vi khuẩn lậu được nhân bản ở E coli và dùng hệ thống này chuyển ADN đã

được nhân bản có chứa đột biến quay trở lại nhiễm sắc thể vi khuẩn lậu bằng biến nạp, nhưng những thử nghiệm này đòi hỏi phải nhân bản đoạn gen quan

tâm ở vật chủ E.coli trước

Trong những nghiên cứu về di truyền của vi khuẩn lậu, đáng chú ý nhất là Plasmid Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp được), có trọng lượng phân tử 36kb Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36kb đã được

phân lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin Nhiều plasmid βlactamase (kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã được phân lập và xác định đặc điểm 2 plasmid hay gặp nhất là khoảng 5,3 hoặc 7,2kb Phần lớn lậu cầu cũng chứa một plasmid 4,2kb nhưng chưa rõ chức năng (cryptic plasmid) Chuỗi ADN của plasmid này đã được xác định Đôi khi có thể phân lập được vi khuẩn lậu không chứa plasmid 4,2kb sao chép tự do này nhưng chúng vẫn có vẻ bình thường về các đặc tính sinh học

-1.7 Chuyển hóa

Vi khuẩn lậu có những đòi hỏi tăng trưởng phức tạp [9] Chúng sử dụng glucose, lactat, hoặc pyruvat là những nguồn carbon cần thiết duy nhất nhưng không thể sử dụng các carbonhydrat khác [9] Điều này tạo thành cơ sở cho các xét nghiệm sử dụng carbonhydrat đã được dùng trong nhiều thập kỷ để

xác định các Neisseria Khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung huyết thanh,

chúng biểu hiện các protein màng ngoài khác nhau và thay đổi sự bám dính vào bạch cầu trung tính người Yếu tố có vẻ kích thích những biến dị kiểu hình này là lactat [7] Bạch cầu trung tính người giải phóng lactat như sản phẩm cuối cùng của chuyển hóa, với kết quả là vi khuẩn lậu nuôi cấy in vivo

có thể chiếm lấy lactat như một nguồn carbon chủ yếu [7] Vi khuẩn lậu (cũng

như các Neisseria khác) nhanh chóng ôxy hóa dimethyl-phenylenediamin

hoặc tetramythyl-phenyllenediamin và điều này biến khuẩn lạc thành mầu hồng và sau đó là mầu đen, tạo thành cơ cở của test ôxy hóa

Vi khuẩn lậu có thể mọc trong điều kiện yếm khí nếu dùng nitrit làm chất nhận điện tử [45] Có thể kích thích vi khuẩn mọc bằng khí CO2 5% hoặc thêm bicarbonat vào môi trường nuôi cấy lỏng hoặc rắn Chúng sinh ra rất

nhiều catalase, giúp thúc đẩy vi khuẩn mọc khi có mặt các peroxid độc khác, nhưng không giống như phần lớn các vi khuẩn hiếu khí chúng không sinh ra lượng superoxid dismutase đáng kể Người ta đã mặc nhiên công nhận rằng chúng phát triển in vivo trong điều kiện yếm khí tương đối, mặc dù về cơ bản

vi khuẩn này mọc in vitro trong điều kiện hiếu khí [13]

Vi khuẩn lậu có nhu cầu tuyệt đối về sắt để phát triển ở người nguồn sắt chủ yếu cho vi khuẩn lậu được giả định là glycoprotein transferrin huyết thanh

và glycoprotein lactoferrin niêm mạc Vi khuẩn lậu có một hệ thống kiềm chế sắt đòi hỏi năng lượng để hấp thu sắt từ transferrin, lactoferrin và hemoglobin [15] Hấp thu sắt từ transferrin, lactoferrin và hemoglobin diễn ra qua trung gian gắn protein vật chủ với một thụ thể đặc hiệu của vi khuẩn lậu [15]

1.8 Tăng sinh

Vi khuẩn lậu không chịu được nhiệt độ khô, phải đặt ngay mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân vào môi trường thích hợp Cũng có thể đặt mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn lậu vào môi trường vận chuyển, trong đó chúng có thể sống tới 24h trước khi chuyển vào môi trường nuôi cấy đã định Sự phát triển tốt nhất ở 35-37oC, nồng độ khí CO2 5%, pH khoảng 7-7,5 Khi nuôi cấy ở môi trường

pH khá thấp (6,0 - 6,5), cấu tạo màng ngoài bị biến đổi, pH < 6,0 thì vi khuẩn lậu không sống được (dịch tiết âm đạo khá acid 4 - 4,5 nhưng vi khuẩn lậu

phát triển ở trong cổ tử cung (pH trung tính) Mặc dù một số Neisseria không

gây bệnh mọc ở nhiệt độ phòng nhưng vi khuẩn lậu mọc không tốt dưới 30oC

và không sống được ở trên 40oC

Môi trường nuôi cấy đặc hiệu cho vi khuẩn lậu là Thayer-Martin hoặc phối hợp tương tự có chứa sắt vô cơ có bổ sung glucose, vitamin và các yếu tố phụ Cũng tìm thấy nhiều vi khuẩn ít khó tính hơn ở cùng vị trí (hầu họng, cổ tử cung và đại tràng) như vi khuẩn lậu Môi trường chọn lọc Thayer-Martin có sử dụng: vancomycin, colistin và nystatin Nhưng một số chủng vi khuẩn lậu khá

được máu Tái nhiễm nhiều lần trên cùng một bệnh nhân bởi một chủng vi khuẩn lậu có thể thường xuyên thay đổi kháng nguyên bề mặt hoặc có thể thoát khỏi các cơ chế miễn dịch tại chỗ [22]

1.10 Cơ chế bám dính

Hai phối thể bám dính đã được chứng minh quan trọng là: pili và Opa Pili của vi khuẩn lậu gắn tốt hơn vào tế bào biểu mô hình trụ của người so với tế bào sừng và gắn tốt hơn vào tế bào của người so với tế bào không phải của người Pili biểu hiện khả năng gắn chọn lọc với những tế bào đặc biệt trong những điều kiện nhất định [47] Các kháng thể kháng pili làm giảm sự bám dính của vi khuẩn lậu vào tế bào biểu mô Sự thay đổi kháng nguyên của cả pili và Opa có thể là ưu điểm sinh học không chỉ đối với việc thoát khỏi các

bổ sung sắt [71] Một số phòng thí nghiệm khác đã xác nhận quan sát này [35] Nghiên cứu trên ống dẫn trứng của người trong nuôi cấy nội tạng đã góp phần đáng kể vào việc tìm hiểu cơ chế của cả sự bám dính và xâm nhập Vi khuẩn lậu bám dính chọn lọc vào tế bào tiết nhày không có nhung mao của ống dẫn trứng và dần dần được bao bởi các chân giả và bị nhấn chìm bởi tế bào biểu mô vật chủ [53] Vi khuẩn lậu được nhân lên và phân chia trong tế bào, mặc dù chúng không xâm nhập giữa các tế bào [53] Cuối cùng một số vi khuẩn lậu đi ra từ bề mặt đáy của tế bào nhờ một quá trình gọi là nhiễm ngoại bào (exocytosis) [52] Khi đã ở trong tế bào biểu mô, vi khuẩn lậu không bị tấn công của kháng thể, bổ thể, bạch cầu trung tính; khả năng sống sót ở một mức độ nhất định trong tế bào biểu mô cho thấy có thể xem chúng như những

ký sinh trùng nội bào tùy ý

1.12 Tổn thương mô

Vi khuẩn lậu sinh ra nhiều sản phẩm ngoại bào khác nhau có thể gây tổn thương tế bào vật chủ gồm các enzym (phospholipase, peptidase và nhiều enzym khác) nhưng chưa xác định được độc tố protein ngoại bào thực sự nào

độc mô trong nhiễm vi khuẩn lậu Cũng có những bằng chứng rất đáng tin cậy

là các mảnh của màng tế bào hoặc peptidoglycan có thể gây tổn thương trên mô hình ống dẫn trứng người nuôi cấy [54]

1.13 Chẩn đoán

Phương pháp nhuộm Gram dùng để chẩn đoán bệnh lậu ở bệnh nhân có triệu chứng viêm niệu đạo cấp cho kết quả tương đối cao Tuy nhiên, ở nam giới không có triệu chứng hoặc ở nữ giới được chẩn đoán là có hội chứng tiết dịch âm đạo thì nhuộm Gram cho kết quả dương tính thấp Nuôi cấy sẽ giúp phát hiện tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao hơn và xác định được những chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh Nhiều xét nghiệm khác nhau đã được triển khai

để phát hiện kháng nguyên vi khuẩn lậu trong dịch tiết đường sinh dục, bao gồm xét nghiệm miễn dịch enzym với kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên

vi khuẩn lậu, kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên vi khuẩn lậu Xét nghiệm miễn dịch enzym đã được sử dụng rộng rãi, nhưng tiêu chuẩn vàng vẫn là nuôi cấy Xét nghiệm PCR và LCR đã được triển khai có độ nhạy và độ

đặc hiệu rất cao, đem lại sự thuận tiện lớn cho bệnh nhân vì có thể dùng trên mẫu nước tiểu (bệnh nhân có thể không cần tới phòng xét nghiệm mà chỉ cần gửi mẫu bệnh phẩm đến) Xét nghiệm huyết thanh để chẩn đoán vi khuẩn lậu vẫn là một vấn đề cần nghiên cứu vì vai trò bảo vệ của các khác thể IgA, IgG, IgM không rõ ràng Đáng chú ý là IgM được dùng để chẩn đoán vi khuẩn lậu

ngoài đường sinh dục Một xét nghiệm có triển vọng trên lâm sàng là hệ thống xét nghiệm phát hiện tải nạp ADN của vi khuẩn lậu trong dịch tiết của bệnh nhân [39] Nguyên tắc của xét nghiệm này là vi khuẩn lậu chỉ có thể tải nạp ADN của chính chúng và thực ra tất cả các trường hợp nhiễm vi khuẩn lậu đều

để lại những lượng ADN tải nạp có hoạt tính sinh học tồn dư trong môi trường Tuy nhiên, xét nghiệm này ít được sử dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm

Tóm lại, chẩn đoán vi khuẩn lậu ngoài kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy, ELISA phát hiện các kháng thể IgA, IgG, IgM kháng vi khuẩn lậu người ta còn áp dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử khác như:

- Kỹ thuật điện di enzyme đa locus xác định sự biến đổi của các allen đối với các housekeeping enzyme trên nhiễm sắc thể

- Phân tích plasmid

- Giải trình tự theo phương pháp của Sanger đối với các đoạn đa hình của

gen porB

- Xác định tính biến đổi về mặt di truyền bằng công nghệ pyrosequencing

đối với các đoạn đa hình của gen porB

- Kỹ thuật lai sử dụng các mẫu dò gắn biotin đối với các vùng hay biến đổi

của gen porB

- Xác định tính đa hình của độ dài các đoạn cắt của gen ARN ribosom cùng với việc xác định các đoạn bằng kỹ thuật lai các mẫu dò đặc hiệu của ARN ribosom

- Kỹ thuật phân tích trình tự đa kháng nguyên của Neisseria gonorrhoeae phân tích các đoạn của gen porB và gen qui định cho protein B gắn chuyển

sắt

- Kỹ thuật PCR và cắt bằng enzyme giới hạn đối với gen Opa

- Xác định trình tự đa locus xác định tính đa hình của các allen ở một vài các housekeeping gene trên nhiễm sắc thể

- Kỹ thuật định týp bằng phân tích các trình tự của các đoạn lặp lại của gen mã hoá cho lipoprotein màng ngoài

- Phân tích đoạn cắt của ADN được khuếch đại của ribosom

- Phân tích tính đa hình của đoạn nucleotide được khuếch đại

- Định týp đoạn ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên

- Phân tích toàn bộ gen của N gonorrhoeae sau khi cắt liên tục bằng các

enzyme hạn chế và điện di trên gel polyacrylamide

- Phân tích toàn bộ gen của N gonorrhoeae sau khi cắt bằng 100 enzyme

giới hạn ít gặp sau đó phân tách các đoạn ADN bằng kỹ thuật điện di điện trường xung [14]

1.14 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lậu

Môi trường đặc hiệu để nuôi cấy vi khuẩn lậu là môi trường Thayer-Martin

Thành phần gồm: thạch GC Agar và Hemoglobin của hãng BBL (Baltimore Bacteriological Laboratory) (Mỹ) và những chất tăng sinh-chất ức chế

Cách pha chế môi trường