SỬ DỤNG LIPASE TRONG SẢN XUẤT ESTER CÔNG NGHIỆP

Cũng vậy, các cơ chất có trọng lượng phân tử thấp được hoà tan trong nước nhiều hơn và có nhiều phản ứng khác so với các cơ chất có trọng lượng phân tử cao ít tan trong nước trong môi tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME

ĐỀ TÀI:

SỬ DỤNG LIPASE TRONG SẢN XUẤT

ESTER CÔNG NGHIỆP

GVHD:

SVTH:

1 Giới thiệu:

Hiện nay ước lượng khoảng 25000 enzyme nhưng chỉ có khoảng 2800 enzyme được phân loại, trong số này khoảng 400 enzyme chủ yếu là hydrolases, transferases and oxidoreductases được xác định có giá trị tiềm năng về thương mại Tuy nhiên, chỉ có 50 loại enzyme khác nhau được sử dụng ở quy mô công nghiệp (Berger, 1995) Lipases (triacyl glycerol hydrolases E.C.3.1.1.3) xúc tác thủy phân triglycerides tại bề mặt của dầu/nước, nhưng khả năng tạo thành liên kết ester dưới những điều kiện thủy phân theo trình tự ngược lại làm cho chúng có khả năng thủy phân những phản ứng khác nhau như ester hóa, transesterification, phản ứng trùng hợp và phân giải lactose Sự biến đổi cơ chất dưới xúc tác của enzyme lipase với điều kiện ôn hòa và chọn lọc cao tạo nên sự hấp dẫn của chúng cho việc tổng hợp lượng lớn các sản phẩm tự nhiên, dược phẩm, hóa chất, thành phần thực phẩm (Schreier, 1997) và những chất bôi trơn sinh học (Dörmö et al., 2004) Ví dụ, lipases được dùng để thu những acid béo không cholesterol (PUFAs) mà sau đó được sử dụng với monoglyceride và diglyceride để tổng hợp dược phẩm như anticholesterolemics, các thuốc kháng viêm và các thuốc làm tan huyết (Gill và Valivety, 1997; Belarbi et al., 2000) Lý do chính sử dụng lipase là sự gia tăng mối quan tâm và nhu cầu về các sản phẩm được sản xuất dưới những điều kiện tự nhiên Với nhiều ứng dụng quan trọng, lipase được đánh giá là enzyme có tiềm năng thương mại cao Lipase xúc tác quá trình ester hóa các dung môi hữu

cơ sinh ra những hợp chất hữu dụng Cả hai phạm vi các cơ chất trong phản ứng do lipase xúc tác và các phản ứng được xúc tác bởi lipase được nghiên cứu rộng hơn bất kỳ enzyme khác đã nghiên cứu từ lâu

Lipases xúc tác 3 loại phản ứng:

i) Thủy phân: xảy ra trong môi trường ưa nước Khi lượng nước vượt quá giới hạn,

phản ứng thủy phân có ưu thế

ii) Ester hóa: dưới điều kiện lượng nước thấp như các dung môi gần như khan, sự ester hóa xảy ra (điều khiển lượng nước để cải tiến năng suất sản phẩm)

iii) Transesterification: nửa acid của một ester được trao đổi với một ester khác (nếu nhóm acyl là một acid tự do, phản ứng được gọi là thủy phân acid, ngược lại phản ứng được gọi là interesterification nếu nhóm acyl là một ester; trong thủy phân alcohol, nucleophile

1

alcohol hoạt động như một chất nhận acyl) Gần đây lipases được sử dụng để sản xuất nhiều ester quan trọng có giá trị thương mại

Bảng 1 cho thấy danh sách các sản phẩm này bao gồm gia vị, hương liệu, các chất có hoạt tính bề mặt, các chất tạo ngọt và các polyester có thể bị vi khuẩn làm cho thối rữa

2 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình ester hóa do lipase xúc tác:

2.1 Bản chất của cơ chất:

Lipase thể hiện mức độ khác nhau theo hướng chọn lọc cơ chất tương tác với chúng

Sự cản trở việc bố trí các nguyên tử trong không gian (mạch nhánh, trạng thái không no và chiều dài mạch) và các hiệu ứng điện tử của cơ chất là 2 nhân tố chính quyết định tính chọn lọc Trong các phản ứng ester hóa, nhiều lipase thể hiện tính chọn lọc cao đối với các mạch acid béo trung bình và dài hơn là các acid béo mạch ngắn hoặc có mạch nhánh (Alhir et al.,

1990) Hầu hết lipases thể hiện tính chọn lọc theo hướng carboxylic acid G.candidum lipase chỉ phản ứng với acid béo chứa 1 liên kết cis tại vị trí thứ 9 (Schrag et al., 1996) Alcohol cũng như ethanol và geraniol được báo cáo là chất ức chế các phản ứng ester hóa và transesterification Tỷ lệ phân tử gam cơ chất đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng ester hóa Cuối cùng, có thể cải tiến bằng việc tăng hàm lượng alcohol hoặc acid nhưng trong hầu hết các trường hợp alcohol có thể trở thành chất ức chế và acid có thể gây ra acid hóa vùng tương tác dẫn đến kết quả bất hoạt lipase (Dörmö et al., 2004; Zaidi et al., 2002) Thật là khó để khái quát hóa ảnh hưởng của độ dài mạch đến việc ester hóa vì điều này phụ thuộc vào sự chuẩn bị lipase và đặc trưng của các enzyme Ester hóa tăng tương ứng với sự tăng chiều dài mạch trong các phản ứng xúc tác bởi lipase tách chiết từ Staphylococcus warneri và Staphylococcus xylosus Trong trường hợp ester hóa với Lipolase 100T thì giảm khi tăng chiều dài mạch, và không phụ thuộc vào chiều dài mạch khi xúc tác với Novozyme

435 (Kumar et al., 2005)

Sử dụng acetic acid đóng vai trò như một nhóm acyl trong việc chuẩn bị acetate là một

cố gắng rất ít hoặc không thành công So sánh các mạch carboxylic acid dài hơn (propionate, butyrate), acetic acid là một chất ức chế lipase có hiệu quả (Segel, 1975), phản ứng được ưu tiên khi có cấu tử serine ở trung tâm hoạt động (Huang et al., 1998) Không hợp lý khi tiến hành bất cứ phản ứng nào giữa acetic acid và geraniol sử dụng các lipase từ những vi sinh vật khác nhau Điều đó cũng cho thấy rằng các ester acetic acid khó tổng hợp với năng suất cao vì lipase bị bất hoạt bởi acid Trong khi vài nhà khoa học tập trung vào transesterification để thu acetate với năng suất cao (Chulalaksananukul et al., 1993), các báo cáo về tối đa hóa sản xuất acetate bằng cách ester hóa trực tiếp thì hiếm Cũng vậy, các cơ chất có trọng lượng phân tử thấp được hoà tan trong nước nhiều hơn và có nhiều phản ứng khác so với các cơ chất có trọng lượng phân tử cao (ít tan trong nước) trong môi trường không chứa nước

2.2 Bản chất của dung môi:

Hầu hết các thông tin về xúc tác enzyme như tốc độ phản ứng, động lực học, các cơ chế bắt nguồn từ các nghiên cứu được tiến hành trong môi trường nước (Welsh and William, 1990) Tuy nhiên, khi enzyme trực tiếp phân tán vào dung môi hữu cơ thì chúng làm thay đổi tính chất của dung môi (Klibanov, 1986) Dung môi hữu cơ ảnh hưởng đến tốc độ phản

5

ứng, vận tốc tối đa (Vmax), hoạt tính đặc hiệu (Kcat), ái lực của cơ chất (Km), hằng số đặc trưng (Kcat/Km), tính ổn định của lipase và khả năng chọn lọc các vùng hoạt động (Sakura et al., 1988; Kung và Rhee, 1989; Zaks và Klibanov, 1986) Hoạt tính của enzyme khác nhau trong dung môi khác nhau do sự thay đổi của quá trình hydrat hoá enzyme ảnh hưởng đến dung môi nhiều hơn so với ảnh hưởng trực tiếp đến enzyme hoặc cơ chất

Nghiên cứu lượng dung môi ảnh hưởng đến sự xúc tác của enzyme được thực hiện Sử dụng tham số Hildebrand, S, đo lượng dung môi phân cực bao gồm lượng ban đầu làm tăng tốc độ phản ứng như mong muốn khi dung môi phân cực thấp (Sδ8), và trọng lượng phân tử lớn hơn 150 Tuy nhiên, sau đó S được chứng minh để đo lượng dung môi phân cực thấp Laane et al (1987) xác định tính phân cực của dung môi dựa vào giá trị log P Giá trị log P của dung môi được định nghĩa là logarit hệ số phân chia của dung môi trong môi trường có hai pha n-octanol/ nước Nhìn chung, sự xúc tác sinh học thấp trong các dung môi log P<2, trung bình là khoảng log P 2-4 và cao trong dung môi không phân cực có giá trị log P>4 Lipase Rhizomucor miehei thể hiện theo quy luật này khi phản ứng ester hoá được tiến hành trong các dung môi khác nhau ( Laane et al.,1987) Sự hiện diện của dung môi phân cực (log

P <2) làm cho Lipoenzyme không thực hiện phản ứng ester hoá Do đó, các dung môi phân cực có thể loại bỏ nước chủ yếu từ enzyme và làm gián đoạn hoạt động của enzyme ( Adachi and Kobayashi, 2005) Các dung môi log P>2 hoà tan một lượng nhỏ trong nước, để enzyme hydrat hoá ổn định cấu trúc hoạt động của nó và có thể hỗ trợ tham gia tổng hợp sản phẩm (Soo et al., 2003) Hoạt tính lipase tăng khi thành phần của DMSO tăng -một dung môi phân cực- được tách ra Sự ảnh hưởng của dung môi (log P) được nghiên cứu tương ứng với giá trị Kcat và Km Kcat cho thấy tương quan rõ ràng với log P trong khi đó Km thì không Kcat

không bị ảnh hưởng bởi các thành phần dung môi khác cùng giá trị log P trong khi đó Km lại thay đổi (Hirakawa et al, 2005) Bên cạnh đó, dung môi phân cực khử hoạt tính của lipases hoà tan trong alcohol giống như đường, vì hỗn hợp của các dung môi không phân cực chứa một lượng nhỏ dung môi phân cực cũng tham gia xúc tác lipase Các phản ứng ester hoá do lipase xúc tác sử dụng các dung môi không phân cực tốt hơn so với các dung môi phân cực,

rõ ràng vẫn chưa biết được hết các vấn đề dung môi liên quan đến sự xúc tác của enzyme

2.3 Sự ổn định nhiệt độ:

Nhiều nhân tố điều khiển hoạt tính xúc tác và ổn định hoạt động của lipase ở nhiệt độ cao trong môi trường không chứa nước Hai vấn đề cần quan tâm là tính chất của dung môi hữu cơ và hàm lượng nước trong môi trường thực nghiệm của enzyme Đây là một vài báo cáo về tính chịu nhiệt của lipases trong môi trường chứa nước Lipase được tìm từ Pseudomonas flourescens 33 giữ hoạt tính 10- 20% ở 600C - 900C trong 10 phút khi có mặt casein và Ca2+ (Kumura et al., 1993) Tính chịu nhiệt của một vài esterase serine như chymotrypsin và lipase từ Candida rugosa và Rhizomucor miehei được nghiên cứu có chức năng hydrat hoá enzyme bằng cách dùng máy đo nhiệt lượng (Turner et al., 1995) Nó đã được phát hiện rằng nhiệt độ biến tính là 300C- 500C trong môi trường khô cao hơn so với môi trường nước Lipase được tách chiết từ tụy tạng lợn có thể ngăn sự ester hoá ở dung môi hữu cơ khô tại 1000C khi nồng độ nước thấp được duy trì trong hệ phản ứng Thời gian bán hủy của enzyme cao hơn 12 giờ tại 1000 C Tuy nhiên, khi nồng độ nước tăng 3%, ngay lập tức hoạt tính của enzyme bị mất (half life = 2 min) Lipase từ tụy tạng trong môi trường không chứa nước có thời gian ủ dài (khoảng 10 ngày) ở 80% không ảnh hưởng đến cấu tạo của PPL (Kiran et al., 2001a) Sự cố định và thêm muối hydrat làm tăng tính chịu nhiệt của lipase trong dung môi hữu cơ Tính chịu nhiệt có thể được cải thiện bằng cách tạo phức hợp

cơ chất có hoạt tính bề mặt lipase ( Goto et al., 2005) Đó là cách dùng phổ biến hiện giờ để lipase tham gia xúc tác phản ứng ester hoá ở 800C- 900C Noel và Combes ( 2003) tiến hành một loạt các thử nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến lipase Rhizomucor miehei và kết luận rằng nhiệt độ làm mất hoạt tính của enzyme khi các phân tử protein rời

ra

2.4 Vai trò trung gian của nước trong xúc tác lipase:

Nước đóng vai trò quan trọng trong phản ứng thuận nghịch xúc tác bởi lipase (Gayot et

al , 2003) Khi lượng nước nằm trong khoảng giới hạn thì nước rất cần thiết để duy trì hình dạng và hoạt động của enzyme, nhưng khi vượt qua giới hạn đó nước tạo điều kiện thuỷ phân (Cameron et al , 2002) Nước liên kết rất quan trọng trong việc ổn định hình dáng của lipase trong môi trường không chứa nước Trong trường hợp của lipase Rhizomucor meihei, nước liên kết chặt chẽ để tích điện và các phân tử phân cực trên bề mặt của enzyme như là một lớp đơn (Tramper et al , 1992) Theo quan điểm của động lực học và nhiệt động học sự

có mặt của nước quá nhiều làm giảm hoạt tính xúc tác Nồng độ của nước trong dung môi

7

hữu cơ tỉ lệ nghịch với sự chịu nhiệt của lipase Nó thể hiện cho PPL, dung môi không phân cực tham gia xúc tác tốt hơn dung môi phân cực

Nồng độ cơ chất và hoạt độ nước có thể quyết định sự phân bố sản phẩm, vì vậy monoester của ethylene glycol có thể được chuẩn bị bằng cách sử dụng hoạt độ nước thấp hoặc bằng cách sử dụng nồng độ alcohol cao hơn, và vice versa dùng cho việc tổng hợp diester (Chand và cộng sự, 1997) Osorio và cộng sự (2001) báo cáo rằng vượt qua một nồng

độ nước tới hạn, quá trình ester hóa qua trung gian lipase giảm vì phạm vi của lớp nước bao quanh enzyme làm chậm lại sự di chuyển của chất cho acyl đến trung tâm hoạt động của enzyme Yadav và Devi (2004) đưa ra những thí nghiệm tại những tốc độ khuấy khác nhau nhận thấy rằng không có ảnh hưởng nào của tốc độ khuấy tới quá trình ester hóa Lớp nước bao quanh enzyme làm nó linh động hơn sau khi ester hóa, hoạt động như một chất bôi trơn cho các phân tử bằng cách tạo nhiều liên kết hydrogen với nó Tuy nhiên, vượt qua khỏi mức

độ tới hạn nào đó, tăng lượng nước có thể dẫn tới kết quả sự linh động quá mức dẫn tới sự tương tác giữa enzyme và dung môi hữu cơ với sự biến tính và mất hoạt tính Thêm vào đó, những cơ chất và sản phẩm ít hòa tan trong nước khuếch tán trung bình khó qua được lớp nước bên trong phân tử đến trung tâm hoạt động của enzyme Vì vậy hoạt tính của enzyme

sẽ bị ảnh hưởng bởi cả sự bất hoạt của nước lẫn sự phân chia của những thành phần giữa dung môi chính và tiểu môi trường của lipase (Yadav và Devi, 2004) Hầu hết các lipase hoạt động ở hoạt độ nước thấp nhưng chúng có sự khác nhau lớn ở hoạt độ nước tối ưu (Ma

và cộng sự, 2002)

Vài phương pháp có giá trị để kiểm tra hoạt độ nước như phương pháp chuẩn độ Karl-Fischer và những đầu dò chuyên dụng Trong phản ứng ester hóa, nước tạo ra có thể được lấy đi bằng cách cho qua phản ứng pha trộn qua một miếng chất làm khô để tạo năng suất sản phẩm cao hơn Trong dung môi không phân cực, hàm lượng nước dư tạo vỏ hydrat hóa với enzyme tạo thành bề mặt nước bao quanh enzyme Sự phân chia của acid, alcohol và sản phẩm giữa lớp nước bề mặt enzyme và pha dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng ester hóa Tính hòa tan của acid và sự phân ly của nó dẫn tới sự tích tụ các proton trên bề mặt Trong phản ứng ester hóa nhờ lipase thủy phân, trạng thái cân bằng khác nhau liên quan tới vùng nước bao quanh enzyme được hiển thị ở Scheme 1 (Aires-Barros và cộng sự, 1989) HA = acid, ROH = alcohol, Est = ester, KdHA, KdEst =hệ số phân chia của

acid, alcohol và ester tương ứng; KA = hằng số phân ly của acid, KEst = hằng số cân bằng của phản ứng ester hóa

Vì nước hiện diện với số lượng ít và không thể nắm được, phương pháp đo pH tại vùng nước bao quanh enzyme không thể thực hiện được (Valivety và cộng sự, 1990) Cambou và Klibanov (1984) đã có những cố gắng để đo pH trong hệ thống không có nước sử dụng chất chỉ thị thay đổi màu với pH

Scheme 1 Phản ứng tại pha trung gian ở vùng nước quanh enzym trong phản ứng ester hóa

nhờ lipase trong dung môi hữu cơ

Một phương pháp đáng tin cậy được phát triển bởi Valivety và cộng sự (1990) sử dụng một chất chỉ thị kỵ nước (fluorescein ester với 3,7,11-trimethyldodecanol) duy trì pha hữu cơ nhưng phản ứng với sự thay đổi pH trong pha nước liền kề Những nhân tố nhiệt động lực hoạt động tại bề mặt dung môi– nước– enzyme trong những dung môi không phân cực cũng được kiểm tra ở những giới hạn của nước của phản ứng, sự phân chia của acid giữa pha nước bao quanh enzyme và dung môi hữu cơ, sự hòa tan và phân ly của acid dẫn đến kết quả là số

H+ có mặt trong pha nước bao quanh enzyme và vùng ester hóa (Kiran và cộng sự, 2002)

3 Nghiên cứu động lực học của phản ứng ester hóa nhờ lipase thủy phân:

Động lực học của những phản ứng ester hóa nhờ lipase thủy phân không chỉ giúp xác định số lượng một phản ứng mà còn giúp phát hiện những chi tiết sự ức chế enzyme và cơ chế mà có liên quan tới sự thích hợp trong những ứng dụng công nghiệp Lipase sử dụng trong dung môi hữu cơ theo một cơ chế Ping-Pong Bi-Bi gồm hỗn hợp hai cơ chất Cơ chế Ping-Pong Bi-Bi viết tắt cho phản ứng hai cơ chất hai sản phẩm là một phản ứng liên tục tức

là cả hai cơ chất không liên kết với enzyme cùng lúc trước khi sản phẩm được tạo thành (Segel, 1975) Số lượng lipase có giá trị và tốc độ bẻ gãy phức hợp enzyme– cơ chất chi phối toàn bộ tốc độ phản ứng Nếu chất hữu cơ đã dùng là chất ức chế trong tự nhiên thì khi đó nó duy trì liên kết với enzyme một cách mạnh mẽ và không xảy ra việc chuyển nhóm acyl

9