ASPARTIC PROTEASES DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHOMAT

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN: ASPARTIC PROTEASES DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHOMAT MỤC LỤC 1. Giới thiệu: 3 2. Cấu trúc của Aspartic Proteases: 3 3. Chymosin: 5 3.1 Chymosin từ bê: 5 3.2 Một số loại chymosin khác: 6 4. Aspartic proteases (APs) thực vật: 7 4.1 Cardosins: 8 4.2 Cyprosins: 9 5. Aspartic proteases (APs) của nấm: 9 5.1 Mucorpepsin: 10 5.2 Endothiapepsin: 11 5.3 Irpex Lacteus Protease: 12 Tài liệu tham khảo 13 2 CÁC TỪ VIẾT TẮT APs Aspartic Proteases SP Signal Peptide P Prosegment M Mature enzyme PSI Plant – specific Insert SALIPS Saposins – like protein MAP Mucor miehei Aspartic protease MPAP M. pusillus Aspartic protease ILAP Irpex lacteus Aspartic protease 3 1.Giới thiệu: Aspartic proteases là một trong những enzyme được ứng dụng sớm nhất trong việc chế biến thực phẩm. Được sử dụng trong sản xuất phomat (Khoảng 6000 năm trước Công Nguyên). Enzyme này xúc tác cho quá trình đông tụ sữa thực hiện qua 2 giai đọan : • Ở giai đoạn 1: APs thủy phân liên kết Phe 105 -Met 106 trong κ-casein từ bê, phân cắt phân tử protein thành 2 phần: para-κ-casein kị nước linh động và một phần ưa nước được biết như là một macropeptide. • Ở đoạn 2: các michelle sẽ mất khả năng hòa tan và liên kết với nhau tạo thành sữa đông Enzyme làm đông tụ sữa được tách chiết từ động vật hữu nhũ, thực vật và nấm. Cũng có thể sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp DNA. Enzyme chiết suất từ dạ túi khế của bò mẹ (men dịch vị) được sử dụng làm chất gây đông tụ trong sản xuất phomat. Thêm vào đó là hàm lượng chymosin có trong men dịch vị làm giảm mức pepsin A, đại diện của hệ peptidase A1, đặc điểm của enzyme này là độ họat động phân giải protein không có phù hợp về mặt đông tụ sữa. Enzyme từ thực vật và nấm làm đông tụ sữa có tính đặc hiệu không cao, protease ổn định hoạt động lâu, tạo vị đắng cho phomat sau một thời gian ủ. Do men dịch vị dùng cho sản xuất phomat có giới hạn, từ đó đòi hỏi phải tìm những chất làm đông khác. Kết quả tìm kiếm trên nấm cho những enzyme có hoạt tính trung bình khi tiệt trùng Pasteur và mức độ không đặc hiệu thấp. Năm 1988, chymosin sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp DNA lần đầu được đưa vào sản xuất bơ sữa công nghiệp. Vài năm sau, những nhà nghiên cứu ở Genencor đã phát triển sản xuất chymosin trên Aspergillus niger, giúp sản xuất đạt lợi nhuận. Ngay sau đó, 1 tái tổ hợp chymosin khác là Maxiren được sản xuất bởi DSM và Chymogen sản xuất bởi Christian Hansen trở nên phổ biến. Các chymosin tái tổ hợp rất tinh khiết và mức độ đông tụ cao. Chymosin từ những động vật hữu nhũ khác như cừu, dê, lạc đà, trâu… cũng được chú ý vì tạo những dạng đông tụ sữa khác, cho những loại phomat khác nhau. 2. Cấu trúc của aspartic proteases: 4 Aspartic proteases (E.C 3.4.23) là những peptidase có phổ hoạt động rộng và đặc trưng. Chúng có mặt trong động vật, thực vật, nấm và vi sinh vật. APs có liên quan tới chức năng sinh lý đa dạng: tiêu hóa dinh dưỡng ở động vật hữu nhũ (chymosin, pepsin A), hệ miễn dịch, nấm độc (tiền pepsin), di căn ung thư vú (cathepsin D), sự tương tác phấn-nhụy hoa (cardosin A), điều hòa áp suất máu (renin), thoái hóa haemoglobin bởi vật ký sinh (plasmepsin) và biều hiện của protein HIV (retropepsin). Cấu trúc của APs tương tự như hệ pepsin A1. Giống như những enzyme-pepsin khác, Aps được tổng hợp như preproenzymes. Sau đó phân tách những peptide tín hiệu và hình thành hoạt tính xúc tác. Những enzyme hoạt động phổ biến gồm một chuỗi đơn peptide khoảng 320-360 amino acid, có phân tử lượng khoảng 32-36 kDa. Phân tích bằng tia X những APs khác nhau ta thấy, phần lớn là những gấp β bậc 2 sắp xếp trong 2 thùy. Hai thùy này tương đồng và được tiến hóa bởi sự nhân đôi gen (gen trùng lắp). Trung tâm xúc tác nằm giữa 2 thùy và chứa những nhóm Aspartic. Mỗi thùy đều có vai trò thiết yếu với hoạt động xúc tác. Trong hệ pepsin, những cấu tử Asp xúc tác chứa trong dạng liên kết Asp-Thr-X , X là Ser hoặc Thr. Những cấu tử Asp này họat hóa phân tử nước gián tiếp thông qua phản ứng thế ái nhân trên liên kết cơ chất peptide. Andreeva và Rumsh (2001) tìm thấy những phân tử nước khác với vai trò thiết yếu 5 flap trong việc hình thành chuỗi liên kết hydro trong xác định liên kết cơ chất. Trung tâm xúc tác đủ lớn để chứa đựng ít nhất 7 cấu tử của cơ chất polypeptide. Cấu trúc linh hoạt (flap) đặt tại lối vào của vùng xúc tác đặt trưng. APs hoạt động ở pH acid. pH tối ưu cho sự hoạt động của aspartic proteases được xác định bởi điện thế tại vùng hoạt động, được xác định bởi vị trí và sự định hướng của các cấu tử gần vùng hoạt động Hệ peptidases A thì bị ức chế mạnh bởi pepstatin, là một pentapeptide sản xuất bởi Streptomyces, có chứa hai nhóm cấu tử của một amino acid không thường dùng, statine. Pepstatin liên kết với flap trong vùng xúc tác. Nhóm hydroxyl oxygen của cấu tử statine đầu tiên liên kết hidro với cả những cấu tử aspartic. Pepstatin thường chống lại APs một cách hiệu quả nhưng nhìn chung mối quan hệ ảnh hưởng ấy khác nhau giữa các enzyme. Pepsin A bi ức chế hoàn toàn khi có sự hiện diện một lượng lớn các đồng phân của pepstatin, riêng chymosin và gastricsin thì ít bị ảnh hưởng, cần 1 lượng phân tử gấp 10 và 100 lần mới ức chế hoàn toàn 2 enzym này. Một sự ức chế pepsin A khác từ Ascaris, một loại giun tròn sống ký sinh, chất ức chế cathesin D khoai tây, và chọn lọc cao chất ức chế saccaropepsin. 3. Chymosin. 3.1 Chymosin từ bê. Chymosin (EC3.4.23.4) là một peptidase aspartic có trong dạ dày múi khế của con bê còn đang bú, có tác dụng làm đông tụ sữa. Ở động vật có vú, chymosin có nhiều nhất trong giai đoạn trong bào thai và lúc mới sinh sau đó giảm dần trong quá trình phát triển, không còn khi trưởng thành. Chymosin thủy phân κ-casein, làm tiêu hóa sữa dễ dàng. Quá trình tổng hợp chymosin: đầu tiên sẽ tổng hợp preprochymosin từ tế bào mucosa trong dạ dày. Preprochymosin là tiền chất không hoạt động. Prochymosin: có 365 amino acid, khối lượng 40.8 kDa được tạo thành từ sự phân cắt peptide đoạn SP N- terminal. Trong môi trường acid của dạ dày, prochymosin được hoạt hóa bằng cách di chuyển prosegment gồm một đoạn 42 amino acid. Chymosin có hai dạng A và B, cả hai dạng này đều hoạt động và khác nhau bởi chuỗi đơn thay thế Asp/ Gly tại vị trí 243. Cấu trúc 3 chiều của chymosin đã được xác định. Ngạc nhiên hơn, cấu trúc tinh thể flap tại trung tâm hoạt động khác với pesin và renin. Cấu trúc này có thể ngăn chặn sự gắng kết 6 của cơ chất – chất ức chế, giải thích cho sự giảm độ nhạy của chymosin với pepstatin. Hơn nữa, nó có thể xác định tính đặc hiệu của chymosin đối với κ-casein (Gustchina et al., 1996). Tuy nhiên, phân tích bằng tia X phức hợp chymosin với 1 chất ức chế có sự tương đồng với phức hợp AP-chất ức chế khác (Groves et al., 1998). Chymosin từ bò được sử dụng trong sản xuất phomat như tác nhân gây đông tụ sữa vì nó tách κ-casein tại vi trí liên kết Phe 105 -Met 106 , và hoạt động thủy phân thấp (Fox and McSweeney, 1999; Mohanty et al., 1999). Chymosin từ bê tái tổ hợp thành công trong nấm men Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis, and nấm mốc Aspergillus niger var awamori and Trichoderma reesei (Mohanty et al., 1999). Chymosin tái tổ hợp còn được sản xuất từ Escherichia coli nhưng sử dụng phương pháp sản xuất này trong công nghiệp sản xuất phomat thì không được chấp nhận. Một vài nơi công nghệ sinh học được áp dụng để sản xuất enzyme tái tổ hợp sử dụng cho thương mại, và những nhóm khác sản xuất phomat truyền thống được sản xuất trên thực nghiệm dựa trên cơ sở từ những con bê. Không có sự khác biệt lớn giữa làm phomat từ chymosin tái tổ hợp với sử dụng enzym tự nhiên về sản lượng, kết cấu, mùi, vị và độ chín mùi. Sự thiếu pepsin bò trong enzyme tái tổ hợp làm tăng sản lượng phomat và cải thiện hương vị phomat. 3.2 Một số loại chymosin khác: Chymosin cũng được sản xuất bởi các loài động vật có vú khác như cừu, dê, trâu, lợn, lạc đà, con người, khỉ và chuột. Các đặc tính của chymosins từ các loài này đã là chủ đề của nhiều báo cáo Gần đây, nhóm của (Vega-Hernández et al., 2004) đã nhân bản cho các cDNA prochymosin dê và được biểu hiện trong nấm men. Các cDNA mã hóa một protein của chuỗi gồm 381 acid amin với đầu N-terminal và vùng proenzyme chứa 16 và 42 axit amin. Tương ứng cho thấy mức độ giống nhau về trình tự acid amin của các preprochymosins đến 99, 94, và 94% ở cừu non, bê và trâu. Ở dê, hai cấu tử xúc tác của Aspartate nằm trong chuỗi với sự có mặt của 6 cysteine hình thành 3 cầu nối disulfide giống như ở bò (Theo Foltmann (1979); Vega-Hernández (2004)). Ở prochymosin dê, acid amin glutamate vị trí 36 trong chuỗi tiền peptide. Nó được thay thế bằng aspartic ở bê, cừu. Các chymosin tái tổ hợp từ dê đặc hiệu cao đối với 7 casein và được sử dụng dùng để sản xuất pho mát từ sữa dê (Vega-Hernández và Claverie-Martín, xuất bản). Protein này theo quan sát của Francky (2001) rằng tại vị trí 36 của prochymosin không phải là yếu tố cần thiết để kích hoạt xúc tác của nó. Sữa trâu là nguồn sữa lớn ở Ấn Độ, và nó có một số thành phần khác với sữa bò. Mohanty (2003) đã tinh sạch chymosin từ dạ dày trâu con. Có sự khác biệt trong việc ổn định protein so với bò. Điều này cho thấy rằng chymosin trâu có thể là lựa chọn tốt nhất để sản xuất pho mát từ sữa trâu. Theo kết quả nghiên cứu của (Elagamy, 2000) cho kết quả là chymosin từ lạc đà đặc hiệu với κ-casein mạnh hơn chymosin từ bò. Vì vậy, khi làm pho mát với chymosin từ lạc đà sự thoái biến của protein giảm, men hoạt động mạnh hơn và cho ra sản phẩm có vị đắng giảm. Trong tương lai, việc sản xuất phomat từ sữa bò dùng chymosin lạc đà sẽ cho hiệu quả cao hơn. Preprochymosin của cừu đã được tạo dòng và biểu hiện ở E.coli và được thử nghiệm là có khả năng trong việc sản xuất phomat. Đặc tính đông tụ sữa của chymosin tái tổ hợp từ cừu cũng tương đương với chymosin tái tổ hợp từ bò. Ở 45 o C nó vẫn hoạt động tốt nên rất thích hợp cho việc sản xuất loại pho mát cứng cần nhiệt độ ủ cao. Và việc sản xuất pho mat từ sữa bò thể hiện khả năng của chymosin tổ hợp từ cừu. 4. Proteases Aspartic (APs) thực vật: Như những AP khác, APs thực vật có cấu tạo chuỗi đơn. Cấu trúc bậc 1 của AP bao gồm: peptide tín hiệu chịu trách nhiệm sự di chuyển đến lưới nội chất, prosegment chứa 46-50 amino acid quyết định gấp nếp chính xác, tính ổn định và loại enzyme. Khác với APs khác, hai nhóm xúc tác của APs chứa Asp – Thr – Gly và Asp – Ser – Gly. APs chứa thêm một đoạn khoảng 100 amino acid gọi là đoạn xen đặc trưng (PSI) không có tính tương đồng với bất kỳ AP nào. PSI thường được loại bỏ trong suốt quá trình trưởng thành và giống với SALIPS). Chức năng của PSI vẫn chưa rõ ràng nhưng có vai trò trong không bào. 8 Hầu hết APs thực vật có trong hạt, trong lá (có vai trò trong cơ chế chống lại các mầm bệnh), hay trong hoa (vai trò trong tái sinh sản). APs cũng liên quan tới cơ chế bảo vệ và sự chết tế bào, sự già đi của thực vật, đáp trả với stress. Dịch chiết được dùng làm đặc phomat trong nhiều thế kỷ. Chymosin làm đông tụ κ – casein, APs trong dịch chiết từ thực vật đông tụ α –, β và κ – casein. Chính những tác nhân này làm phomat có vị chua, vị đắng và kết cấu bên ngoài bị hư hỏng. Tuy nhiên, chúng lại làm nên mùi hương đặc trưng, độ đặc khác nhau cho phomat. Nam Âu và những nước thuộc miền Tây Châu Phi đã sử dụng dịch chiết thực vật này để làm phomat. Dịch chiết hoa Cynara sp và Centaurea calcitrapa được Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha sử dụng để sản xuất phomat truyền thống. Yếu tố làm đông tụ sữa chính trong dịch chiết là cardosins, cyproson và cenprosins. Những APs được tách chiết từ Cynara sp còn có cynarases nhưng nó không tốt. Ở Nigeria, dịch chiết từ táo Sodom sử dụng sản xuất phomat truyền thống.AP tái tổ hợp bao gồm cardosins và cyprosins từ nấm men nhưng những enzyme này chưa có ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. 4.1. Cardosins. Cardosin A chiếm hầu hết trong cardosin, tích lũy trong không bào dự trữ protein, ở khí khổng và trong không bào của lớp tế bào biểu bì vòi nhụy. Tiền cardosin A được mã hóa bởi gen CARDA và chứa 504 amino acid. Ezyme trưởng thành gồm 2 đoạn 9 peptide dài 31 và 15 kDa và trung tâm họat động. Sự biến đổi của trung tậm họat động của enzyme có thể xảy ra trong không bào, trong sụốt quá trình PSI được loại bỏ đầu tiên từ prosegment. Những cấu tử xúc tác nằm ở vị trí 32 và 215 của chuỗi nặng. Nét đặc trưng duy nhất của cardosin A là có mặt dạng Arg 176 – Gly 177 – Asp 178 đính kèm trong tế bào viết tắt RGD như một dạng trình tự intergrin-binding. Enzyme này tham gia vào cơ chế phân giải protein RGD - dependent trong việc hạt phấn tiếp xúc với nhụy. C-terminal của cardosin A chứa những trình tự kỵ nước Val 320 -Gly 321 -Phe 322 -Ala 323 -Glu 324 -Ala 325 - Ala 326 có vai trò bảo vệ và đề ra cơ chế họat động của không bào đích. Hai chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng liên kết kỵ nước và liên kết hidro. Ngoài cardosin A còn có cardosin B tích lũy trong thành tế bào và trong chất nền ngoại bào của mô truyền. Mặc dù không tích lũy nhiều hơn Cardosin A nhưng Cardosin B có nhiều trung tâm phân giải protein và tham gia vào quá trình tiêu hóa chung protein. Enzyme này giống Cardosin A tới 73%. Tiền Cardosin B được mã hóa bởi gen CARDB. Enzyme trưởng thành gồm 2 peptide 34kDa và 14kDa. Cardosin B thiếu dạng RGD và có thêm vị trí N-glycosyl do sự thay thế Asp thành Asn. 4.2 Cyprosins. Là một dạng khác của APs thức vật được phân lập từ hoa C. cardunculus. Tiền cyprosin (509 amino acid) được mã hóa bởi gen CYPRO1. Cyprosin trưởng thành cũng loại bỏ PSI. Những enzyme này giống 52% cathepsin D từ động vật. 5. Aspartic Proteases (APs) của nấm. Hiện nay trên thế giới enzyme chymosin của bê đang bị thiếu hụt vì vậy trong khoảng 30 năm gần đây: Aspartic Proteases (APs) của nấm đang được sử dụng rộng rãi như là enzyme đông tụ sữa trong ngành công nghiệp sản xuất phomat. Trên thị trường thì các enzyme được sản xuất bởi: Mucor miehei, Mucor pusillus và Cryphonectria (Endothia) parasitica có tên thương mại là: Rennilase ®, Fromase ®, Novoren ®, Marzyme ®, Hannilase ®, Marzyme ® và Suparen ®, chúng được sử dụng rộng rãi để sản xuất các loại phomat khác nhau. Đặc tính phân giải protein làm đông tụ sữa của nấm khác với enzyme chymosin của bê. Kết quả là sản xuất ra một số peptides có vị đắng trong quá trình lên men phomat. 10 [...]... của bê (Awad et al sản xuất. , 1999) Do enzyme này chịu nhiệt cao thích hợp cho sử dụng để sản xuất phomat Sản xuất phomat từ nấm C parasitica dễ kiểm soát hơn phomat làm từ dịch vị động vật DSM Endothiapepsin thị trường theo tên thương mại Suparen ® C.parasitica protease thuỷ phân protein lớn hơn MAP hoặc chymosin Proteolysis thủy phân αs1-casein và β-casein trong quá trình bảo quản phomat mozzarella... được sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất phomat đã được sản xuất ở cả M.miehei và A oryzae (Budtz và Heldt-Hansen, 1998; Harboe và Kristensen, 2000) Khi các chế phẩm này được khử glycosyl bằng cách được xử lý với endo-β-N-acetylglucosaminidase H có ý nghĩa mở rộng trong sự đông tụ sữa(Harboe và Kristensen, 2000) Có hai cách để làm giảm sự ổn định nhiệt của MAP, cách thứ nhất là xử lý trong dung... gấp đôi tỷ lệ trung bình cho các protein khác Nó không chứa ba cầu nối disulfua, liên kết tồn tại trong hầu hết các loại pepsin loại APs 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tác giả: Julio Polaina, Andrew P MacCabe, sách: Industrial Enzymes Structure, Function and applications, Chương 13: Aspartic Proteases trong sản xuất phomat 207217 14 ... 1990.,) Ngoài ra ta có thể gây đột biến tại một vài vị trí nhằm để nâng cao tính thiết thực của nó trong sản xuất phomat Yamashita et al (1994) đã thu được các hình thái đột biến của protease aspartic có hoạt tính giảm sự ổn định nhiệt Thể đột biến mpr mang Gly 186 Asp hoặc Ala 101 Thr đã được biểu hiện trong S.cerevisiae Cả hai đột biến này đều làm giảm đáng kể sự ổn định nhiệt của enzyme Các đột biến... protease (Yun et al., 1993) Sự thay đổi đặc tính phomat trong quá trình bảo quản có liên quan đến các sự thủy phân của αs1-casein và βcasein Kim et al (2004) đã kết hợp việc sử dụng các chymosin và enzyme C.parasitica 12 để kiểm soát sự thủy phân của αs1-casein và β-casein trong quá trình lão hóa của phomat Cheddar, kiểm soát độc lập sự vững chắc và tan chảy của nó trong khi điều chỉnh mức độ đắng không mong... quan đến khả năng phân cắt peptide và glycosyl hóa Gen cấu trúc từ M.pusillus Aspartic 11 protease, MPR, đã được biểu hiện trong S cerevisiae (Aikawa et al., 1990) Các sản phẩm tiết ra môi trường nuôi cấy là các proenzyme: bao gồm 44 amino acid prosegment được thu bằng quá trình tự xúc tác ở pH acid (Hiramatsu et al., 1989) Trong nghiên cứu khử glycosyl nếu chúng ta loại bỏ các N-liên kết với các nhóm... Glu 13 Ala cho thấy một lần tăng 5 nếp (fold) trong tỷ lệ của chống đông tụ thì hoạt động thủy phân protein sẽ làm giảm sự đông tụ (Aikawa et al Năm 2001) Thêm vào đó đột biến Glu 13 Ala đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mạng liên kết hydro xung quanh trung tâm hoạt động 5.2.Endothiapepsin Nấm C parasitica màu hạt dẻ có thể tạo ra protease aspartic, endothiapepsin Nấm này có đặc tính đông... ngoại bào được sản xuất bởi hai loài nấm M pusillus và M miehei, có khả năng phân cắt κ- casein chọn lọc, song song đó họat động phân giải protein tương đối thấp (Harboe và Budtz năm 1999; Awad etal., 1999) Các enzyme APs từ 2 loại nấm trên là: Mucorpepsins hay rennins ổn định ở nhiệt độ cao nhất so với những APs khác Chính vì enzyme này có khả năng chịu nhiệt nên họat tính enzyme vẫn còn trong suốt quá... vững chắc và tan chảy của nó trong khi điều chỉnh mức độ đắng không mong muốn gắn liền với mức độ cao của C parasitica protease 5.3.Irpex Lacteus Protease Nấm gỗ Irpex lacteus thuộc Basidiomycete đã sản xuất một loại AP (ILAP) có tác dụng đông sữa cao liên quan đến hoạt động thuỷ phân protein Enzyme này có thể thay thế chymosin (Kobayashi et al., 1985) ILAP chứa 340 acid amin có khối lượng phân tử 35... với những APs khác Chính vì enzyme này có khả năng chịu nhiệt nên họat tính enzyme vẫn còn trong suốt quá trình đông tụ sữa và gia tăng mùi vị trong suốt quá trình lên men (Yamashita et al., 1994) Các enzyme APs từ M miehei (MAP, EC3.4.23.23) bị glycosyl hóa nhất trong hệ APs (Rickert và McBride-Warren, 1974) Các phần carbohydrate có thể ổn định cấu tạo của MAP, có thể tạo ra các enzyme có mức ổn định . LUẬN: ASPARTIC PROTEASES DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHOMAT MỤC LỤC 1. Giới thiệu: 3 2. Cấu trúc của Aspartic Proteases: 3 3. Chymosin: 5 3.1 Chymosin từ bê: 5 3.2 Một số loại chymosin khác: 6 4. Aspartic. Irpex lacteus Aspartic protease 3 1.Giới thiệu: Aspartic proteases là một trong những enzyme được ứng dụng sớm nhất trong việc chế biến thực phẩm. Được sử dụng trong sản xuất phomat (Khoảng. Escherichia coli nhưng sử dụng phương pháp sản xuất này trong công nghiệp sản xuất phomat thì không được chấp nhận. Một vài nơi công nghệ sinh học được áp dụng để sản xuất enzyme tái tổ hợp sử dụng cho