ASPARTIC PROTEASES DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHOMAT

Enzyme chiết suất từ dạ túi khế của bò mẹ men dịch vị được sử dụng làm chất gây đông tụ trong sản xuất phomat.. Thêm vào đó là hàm lượng chymosin có trong men dịch vị làm giảm mức pepsin

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN:

ASPARTIC PROTEASES DÙNG TRONG

SẢN XUẤT PHOMAT

MỤC LỤC

1 Giới thiệu: -3

2 Cấu trúc của Aspartic Proteases: - 3

3 Chymosin: -5

3.1 Chymosin từ bê: - 5

3.2 Một số loại chymosin khác: -6

4 Aspartic proteases (APs) thực vật: -7

4.1 Cardosins: - 8

4.2 Cyprosins: -9

5 Aspartic proteases (APs) của nấm: -9

5.1 Mucorpepsin: -10

5.2 Endothiapepsin: -11

5.3 Irpex Lacteus Protease: -12

Tài liệu tham khảo -13

CÁC TỪ VIẾT TẮT

APs Aspartic Proteases

SP Signal Peptide

P Prosegment

M Mature enzyme

PSI Plant – specific Insert

SALIPS Saposins – like protein

MPAP M pusillus Aspartic protease

ILAP Irpex lacteus Aspartic protease

1.Giới thiệu:

Aspartic proteases là một trong những enzyme được ứng dụng sớm nhất trong việc chế biến thực phẩm Được sử dụng trong sản xuất phomat (Khoảng 6000 năm trước Công Nguyên) Enzyme này xúc tác cho quá trình đông tụ sữa thực hiện qua 2 giai đọan :

• Ở giai đoạn 1: APs thủy phân liên kết Phe105-Met106 trong κ-casein từ bê, phân cắt phân tử protein thành 2 phần: para-κ-casein kị nước linh động và một phần ưa nước được biết như là một macropeptide

• Ở đoạn 2: các michelle sẽ mất khả năng hòa tan và liên kết với nhau tạo thành sữa đông

Enzyme làm đông tụ sữa được tách chiết từ động vật hữu nhũ, thực vật và nấm Cũng có thể sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp DNA Enzyme chiết suất từ dạ túi khế của bò mẹ (men dịch vị) được sử dụng làm chất gây đông tụ trong sản xuất phomat Thêm vào đó là hàm lượng chymosin có trong men dịch vị làm giảm mức pepsin A, đại diện của hệ peptidase A1, đặc điểm của enzyme này là độ họat động phân giải protein không có phù hợp về mặt đông tụ sữa Enzyme từ thực vật và nấm làm đông tụ sữa có tính đặc hiệu không cao, protease ổn định hoạt động lâu, tạo vị đắng cho phomat sau một thời gian ủ Do men dịch vị dùng cho sản xuất phomat có giới hạn, từ đó đòi hỏi phải tìm những chất làm đông khác Kết quả tìm kiếm trên nấm cho những enzyme có hoạt tính trung bình khi tiệt trùng Pasteur và mức độ không đặc hiệu thấp

Năm 1988, chymosin sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp DNA lần đầu được đưa vào sản xuất bơ sữa công nghiệp Vài năm sau, những nhà nghiên cứu ở Genencor đã

phát triển sản xuất chymosin trên Aspergillus niger, giúp sản xuất đạt lợi nhuận Ngay

sau đó, 1 tái tổ hợp chymosin khác là Maxiren được sản xuất bởi DSM và Chymogen sản xuất bởi Christian Hansen trở nên phổ biến Các chymosin tái tổ hợp rất tinh khiết và mức độ đông tụ cao

Chymosin từ những động vật hữu nhũ khác như cừu, dê, lạc đà, trâu… cũng được chú ý vì tạo những dạng đông tụ sữa khác, cho những loại phomat khác nhau

2 Cấu trúc của aspartic proteases:

Aspartic proteases (E.C 3.4.23) là những peptidase có phổ hoạt động rộng và đặc trưng Chúng có mặt trong động vật, thực vật, nấm và vi sinh vật APs có liên quan tới chức năng sinh lý đa dạng: tiêu hóa dinh dưỡng ở động vật hữu nhũ (chymosin, pepsin A), hệ miễn dịch, nấm độc (tiền pepsin), di căn ung thư vú (cathepsin D), sự tương tác phấn-nhụy hoa (cardosin A), điều hòa áp suất máu (renin), thoái hóa haemoglobin bởi vật

ký sinh (plasmepsin) và biều hiện của protein HIV (retropepsin)

Cấu trúc của APs tương tự như hệ pepsin A1 Giống như những enzyme-pepsin khác, Aps được tổng hợp như preproenzymes Sau đó phân tách những peptide tín hiệu

và hình thành hoạt tính xúc tác Những enzyme hoạt động phổ biến gồm một chuỗi đơn peptide khoảng 320-360 amino acid, có phân tử lượng khoảng 32-36 kDa Phân tích bằng tia X những APs khác nhau ta thấy, phần lớn là những gấp β bậc 2 sắp xếp trong 2 thùy Hai thùy này tương đồng và

được tiến hóa bởi sự nhân đôi

gen (gen trùng lắp) Trung tâm

xúc tác nằm giữa 2 thùy và

chứa những nhóm Aspartic

Mỗi thùy đều có vai trò thiết

yếu với hoạt động xúc tác

Trong hệ pepsin, những cấu

tử Asp xúc tác chứa trong

dạng liên kết Asp-Thr-X , X

là Ser hoặc Thr Những cấu

tử Asp này họat hóa phân tử

nước gián tiếp thông qua

phản ứng thế ái nhân trên

liên kết cơ chất peptide

Andreeva và Rumsh (2001)

tìm thấy những phân tử nước

khác với vai trò thiết yếu

flap

trong việc hình thành chuỗi liên kết hydro trong xác định liên kết cơ chất Trung tâm xúc tác đủ lớn để chứa đựng ít nhất 7 cấu tử của cơ chất polypeptide Cấu trúc linh hoạt (flap) đặt tại lối vào của vùng xúc tác đặt trưng APs hoạt động ở pH acid pH tối ưu cho sự hoạt động của aspartic proteases được xác định bởi điện thế tại vùng hoạt động, được xác định bởi vị trí và sự định hướng của các cấu tử gần vùng hoạt động

Hệ peptidases A thì bị ức chế mạnh bởi pepstatin, là một pentapeptide sản xuất

bởi Streptomyces, có chứa hai nhóm cấu tử của một amino acid không thường dùng,

statine Pepstatin liên kết với flap trong vùng xúc tác Nhóm hydroxyl oxygen của cấu tử statine đầu tiên liên kết hidro với cả những cấu tử aspartic Pepstatin thường chống lại APs một cách hiệu quả nhưng nhìn chung mối quan hệ ảnh hưởng ấy khác nhau giữa các enzyme Pepsin A bi ức chế hoàn toàn khi có sự hiện diện một lượng lớn các đồng phân của pepstatin, riêng chymosin và gastricsin thì ít bị ảnh hưởng, cần 1 lượng phân tử gấp

10 và 100 lần mới ức chế hoàn toàn 2 enzym này Một sự ức chế pepsin A khác từ

Ascaris, một loại giun tròn sống ký sinh, chất ức chế cathesin D khoai tây, và chọn lọc

cao chất ức chế saccaropepsin

3 Chymosin.

3.1 Chymosin từ bê.

Chymosin (EC3.4.23.4) là một peptidase aspartic có trong dạ dày múi khế của con

bê còn đang bú, có tác dụng làm đông tụ sữa Ở động vật có vú, chymosin có nhiều nhất trong giai đoạn trong bào thai và lúc mới sinh sau đó giảm dần trong quá trình phát triển, không còn khi trưởng thành Chymosin thủy phân κ-casein, làm tiêu hóa sữa dễ dàng

Quá trình tổng hợp chymosin: đầu tiên sẽ tổng hợp preprochymosin từ tế bào mucosa trong dạ dày Preprochymosin là tiền chất không hoạt động Prochymosin: có 365 amino acid, khối lượng 40.8 kDa được tạo thành từ sự phân cắt peptide đoạn SP N-terminal Trong môi trường acid của dạ dày, prochymosin được hoạt hóa bằng cách di chuyển prosegment gồm một đoạn 42 amino acid Chymosin có hai dạng A và B, cả hai dạng này đều hoạt động và khác nhau bởi chuỗi đơn thay thế Asp/ Gly tại vị trí 243 Cấu trúc 3 chiều của chymosin đã được xác định Ngạc nhiên hơn, cấu trúc tinh thể flap tại trung tâm hoạt động khác với pesin và renin Cấu trúc này có thể ngăn chặn sự gắng kết

của cơ chất – chất ức chế, giải thích cho sự giảm độ nhạy của chymosin với pepstatin Hơn nữa, nó có thể xác định tính đặc hiệu của chymosin đối với κ-casein (Gustchina et al., 1996) Tuy nhiên, phân tích bằng tia X phức hợp chymosin với 1 chất ức chế có sự tương đồng với phức hợp AP-chất ức chế khác (Groves et al., 1998)

Chymosin từ bò được sử dụng trong sản xuất phomat như tác nhân gây đông tụ sữa vì nó tách κ-casein tại vi trí liên kết Phe105-Met106, và hoạt động thủy phân thấp (Fox and McSweeney, 1999; Mohanty et al., 1999) Chymosin từ bê tái tổ hợp thành công trong nấm men Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis, and nấm mốc

Aspergillus niger var awamori and Trichoderma reesei (Mohanty et al., 1999).

Chymosin tái tổ hợp còn được sản xuất từ Escherichia coli nhưng sử dụng phương pháp sản xuất này trong công nghiệp sản xuất phomat thì không được chấp nhận Một vài nơi công nghệ sinh học được áp dụng để sản xuất enzyme tái tổ hợp sử dụng cho thương mại,

và những nhóm khác sản xuất phomat truyền thống được sản xuất trên thực nghiệm dựa trên cơ sở từ những con bê Không có sự khác biệt lớn giữa làm phomat từ chymosin tái

tổ hợp với sử dụng enzym tự nhiên về sản lượng, kết cấu, mùi, vị và độ chín mùi Sự thiếu pepsin bò trong enzyme tái tổ hợp làm tăng sản lượng phomat và cải thiện hương vị phomat

3.2 Một số loại chymosin khác:

Chymosin cũng được sản xuất bởi các loài động vật có vú khác như cừu, dê, trâu, lợn, lạc đà, con người, khỉ và chuột Các đặc tính của chymosins

từ các loài này đã là chủ đề của nhiều báo cáo Gần đây, nhóm của (Vega-Hernández et

al., 2004) đã nhân bản cho các cDNA prochymosin dê và được biểu hiện trong nấm men

Các cDNA mã hóa một protein của chuỗi gồm 381 acid amin với đầu N-terminal và vùng proenzyme chứa 16 và 42 axit amin Tương ứng cho thấy mức độ giống nhau về trình tự acid amin của các preprochymosins đến 99, 94, và 94% ở cừu non, bê và trâu Ở dê, hai cấu tử xúc tác của Aspartate nằm trong chuỗi với sự có mặt của 6 cysteine hình thành 3 cầu nối disulfide giống như ở bò (Theo Foltmann (1979); Vega-Hernández (2004))

Ở prochymosin dê, acid amin glutamate vị trí 36 trong chuỗi tiền peptide Nó được thay thế bằng aspartic ở bê, cừu Các chymosin tái tổ hợp từ dê đặc hiệu cao đối với

casein và được sử dụng dùng để sản xuất pho mát từ sữa dê (Vega-Hernández và Claverie-Martín, xuất bản) Protein này theo quan sát của Francky (2001) rằng tại vị trí

36 của prochymosin không phải là yếu tố cần thiết để kích hoạt xúc tác của nó

Sữa trâu là nguồn sữa lớn ở Ấn Độ, và nó có một số thành phần khác với sữa bò

Mohanty (2003) đã tinh sạch chymosin từ dạ dày trâu con Có sự khác biệt trong việc ổn

định protein so với bò Điều này cho thấy rằng chymosin trâu có thể là lựa chọn tốt nhất

để sản xuất pho mát từ sữa trâu

Theo kết quả nghiên cứu của (Elagamy, 2000) cho kết quả là chymosin từ lạc đà đặc hiệu với κ-casein mạnh hơn chymosin từ bò Vì vậy, khi làm pho mát với chymosin

từ lạc đà sự thoái biến của protein giảm, men hoạt động mạnh hơn và cho ra sản phẩm có

vị đắng giảm Trong tương lai, việc sản xuất phomat từ sữa bò dùng chymosin lạc đà sẽ cho hiệu quả cao hơn

Preprochymosin của cừu đã được tạo dòng và biểu hiện ở E.coli và được thử nghiệm là có khả năng trong việc sản xuất phomat Đặc tính đông tụ sữa của chymosin tái

tổ hợp từ cừu cũng tương đương với chymosin tái tổ hợp từ bò Ở 45oC nó vẫn hoạt động tốt nên rất thích hợp cho việc sản xuất loại pho mát cứng cần nhiệt độ ủ cao Và việc sản xuất pho mat từ sữa bò thể hiện khả năng của chymosin tổ hợp từ cừu

4 Proteases Aspartic (APs) thực vật:

Như những AP khác, APs thực vật có cấu tạo chuỗi đơn Cấu trúc bậc 1 của AP bao gồm: peptide tín hiệu chịu trách nhiệm sự di chuyển đến lưới nội chất, prosegment chứa 46-50 amino acid quyết định gấp nếp chính xác, tính ổn định và loại enzyme Khác với APs khác, hai nhóm xúc tác của APs chứa Asp – Thr – Gly và Asp – Ser – Gly APs chứa thêm một đoạn khoảng 100 amino acid gọi là đoạn xen đặc trưng (PSI) không có tính tương đồng với bất kỳ AP nào PSI thường được loại bỏ trong suốt quá trình trưởng thành và giống với SALIPS) Chức năng của PSI vẫn chưa rõ ràng nhưng có vai trò trong không bào

Hầu hết APs thực vật có trong hạt, trong lá (có vai trò trong cơ chế chống lại các mầm bệnh), hay trong hoa (vai trò trong tái sinh sản) APs cũng liên quan tới cơ chế bảo

vệ và sự chết tế bào, sự già đi của thực vật, đáp trả với stress

Dịch chiết được dùng làm đặc phomat trong nhiều thế kỷ Chymosin làm đông tụ

κ – casein, APs trong dịch chiết từ thực vật đông tụ α –, β và κ – casein Chính những tác nhân này làm phomat có vị chua, vị đắng và kết cấu bên ngoài bị hư hỏng Tuy nhiên, chúng lại làm nên mùi hương đặc trưng, độ đặc khác nhau cho phomat Nam Âu và những nước thuộc miền Tây Châu Phi đã sử dụng dịch chiết thực vật này để làm phomat

Dịch chiết hoa Cynara sp và Centaurea calcitrapa được Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha sử

dụng để sản xuất phomat truyền thống Yếu tố làm đông tụ sữa chính trong dịch chiết là

cardosins, cyproson và cenprosins Những APs được tách chiết từ Cynara sp còn có

cynarases nhưng nó không tốt Ở Nigeria, dịch chiết từ táo Sodom sử dụng sản xuất phomat truyền thống.AP tái tổ hợp bao gồm cardosins và cyprosins từ nấm men nhưng những enzyme này chưa có ứng dụng trong sản xuất công nghiệp

4.1 Cardosins.

Cardosin A chiếm hầu hết trong cardosin, tích lũy trong không bào dự trữ protein,

ở khí khổng và trong không bào của lớp tế bào biểu bì vòi nhụy Tiền cardosin A được

mã hóa bởi gen CARDA và chứa 504 amino acid Ezyme trưởng thành gồm 2 đoạn

peptide dài 31 và 15 kDa và trung tâm họat động Sự biến đổi của trung tậm họat động của enzyme có thể xảy ra trong không bào, trong sụốt quá trình PSI được loại bỏ đầu tiên

từ prosegment Những cấu tử xúc tác nằm ở vị trí 32 và 215 của chuỗi nặng Nét đặc trưng duy nhất của cardosin A là có mặt dạng Arg176 – Gly177 – Asp178 đính kèm trong tế bào viết tắt RGD như một dạng trình tự intergrin-binding Enzyme này tham gia vào cơ chế phân giải protein RGD - dependent trong việc hạt phấn tiếp xúc với nhụy C-terminal của cardosin A chứa những trình tự kỵ nước Val320-Gly321-Phe322-Ala323-Glu324-Ala325 -Ala326 có vai trò bảo vệ và đề ra cơ chế họat động của không bào đích Hai chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng liên kết kỵ nước và liên kết hidro

Ngoài cardosin A còn có cardosin B tích lũy trong thành tế bào và trong chất nền ngoại bào của mô truyền Mặc dù không tích lũy nhiều hơn Cardosin A nhưng Cardosin

B có nhiều trung tâm phân giải protein và tham gia vào quá trình tiêu hóa chung protein Enzyme này giống Cardosin A tới 73% Tiền Cardosin B được mã hóa bởi gen CARDB Enzyme trưởng thành gồm 2 peptide 34kDa và 14kDa Cardosin B thiếu dạng RGD và có thêm vị trí N-glycosyl do sự thay thế Asp thành Asn

4.2 Cyprosins.

Là một dạng khác của APs thức vật được phân lập từ hoa C cardunculus Tiền

cyprosin (509 amino acid) được mã hóa bởi gen CYPRO1 Cyprosin trưởng thành cũng loại bỏ PSI Những enzyme này giống 52% cathepsin D từ động vật

5 Aspartic Proteases (APs) của nấm.

Hiện nay trên thế giới enzyme chymosin của bê đang bị thiếu hụt vì vậy trong khoảng 30 năm gần đây: Aspartic Proteases (APs) của nấm đang được sử dụng rộng rãi như là enzyme đông tụ sữa trong ngành công nghiệp sản xuất phomat

Trên thị trường thì các enzyme được sản xuất bởi: Mucor miehei, Mucor pusillus

và Cryphonectria (Endothia) parasitica có tên thương mại là: Rennilase ®, Fromase ®, Novoren ®, Marzyme ®, Hannilase ®, Marzyme ® và Suparen ®, chúng được sử dụng rộng rãi để sản xuất các loại phomat khác nhau

Đặc tính phân giải protein làm đông tụ sữa của nấm khác với enzyme chymosin của bê Kết quả là sản xuất ra một số peptides có vị đắng trong quá trình lên men phomat

Một vài APs của nấm có cấu trúc tinh thể ở dạng đơn hay tạo thành phức với chất

ức chế như: R miehei, R pusillus, C parasitica và Irprex lacteus Các cấu trúc bậc ba

của những enzyme này rất giống với những APs khác

5.1 Mucorpepsin

Các enzyme APs ngoại bào được sản xuất bởi hai loài nấm M pusillus và M

miehei, có khả năng phân cắt κ- casein chọn lọc, song song đó họat động phân giải protein tương đối thấp (Harboe và Budtz năm 1999; Awad etal., 1999)

Các enzyme APs từ 2 loại nấm trên là: Mucorpepsins hay rennins ổn định ở nhiệt

độ cao nhất so với những APs khác Chính vì enzyme này có khả năng chịu nhiệt nên họat tính enzyme vẫn còn trong suốt quá trình đông tụ sữa và gia tăng mùi vị trong suốt quá trình lên men (Yamashita et al., 1994)

Các enzyme APs từ M miehei (MAP, EC3.4.23.23) bị glycosyl hóa nhất trong hệ

APs (Rickert và McBride-Warren, 1974) Các phần carbohydrate có thể ổn định cấu tạo của MAP, có thể tạo ra các enzyme có mức ổn định nhiệt cao và bảo vệ nó khỏi sự phân giải protein (Yang et al., 1997) Jia (1995) là người đầu tiên kết tinh được MAP, Yang đã làm sạch được cấu trúc protein nguyên chất(1997) Dựa trên cấu trúc này đã tạo ra được các enzyme cải tiến về mức độ ổn định ở nhiệt cao và hoạt động đông tụ sữa cao

Các chế phẩm MAP được sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất phomat đã

được sản xuất ở cả M.miehei và A oryzae (Budtz và Heldt-Hansen, 1998; Harboe và

Kristensen, 2000) Khi các chế phẩm này được khử glycosyl bằng cách được xử lý với endo-β-N-acetylglucosaminidase H có ý nghĩa mở rộng trong sự đông tụ sữa(Harboe và Kristensen, 2000) Có hai cách để làm giảm sự ổn định nhiệt của MAP, cách thứ nhất là

xử lý trong dung dịch nước với các tác nhân oxy hóa có chứa Clo, hoặc là sự acid hoá với một dẫn xuất có hoạt tính carboxylicacid (Branner-Jorgensen, 1981; Branner-Jorgensen

et al 1982.,)

Theo dự kiến, M.miehei MAP gần giống như của M pusillus AP (MPAP)

(Tonouchi et al., 1986; Yang et al 1997.,) Chúng có chung một cấu trúc kháng nguyên và đồng nhất về đặc tính enzyme nhưng giữa hai loại enzym có một số khác biệt liên quan

đến khả năng phân cắt peptide và glycosyl hóa Gen cấu trúc từ M.pusillus Aspartic