Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV

Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kĩ thuật Elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chuẩn đoán bằng kĩ thuật RT-PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TĨM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đốn bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ mơn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngồi đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đốn bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa ii Cảm tạ iii Tóm tắt iv Danh sách các chữ viết tắt vi Mục lục vii Danh sách các bảng xi Danh sách các đồ thị . xi Danh sách các hình xii Danh sách các sơ đồ xii Phần I. Mở Đầu 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu . 1 1.2.2 Yêu cầu 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu . 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt . 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt . 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt . 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2 2.1.3.1 Thân . 2 2.1.3.2 Rễ . 2 2.1.3.3 Lá . 2 2.1.3.4 Hoa . 3 2.1.3.5 Quả . 3 2.1.3.6 Hạt 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt . 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ 9 2.3.2 Ánh sáng 9 2.3.3 Ẩm độ 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng . 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) . 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV . 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV . 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV . 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt . 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học . 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển . 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV . 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV . 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống . 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19 2.12 ELISA 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA . 19 2.12.2 Phân loại ELISA 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp . 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA . 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA . 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết . 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn . 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau . 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR . 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR . 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới . 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV . 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA . 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA . 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR . 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad . 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR . 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận . 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA . 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra . 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt . 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi . 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR . 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA . 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer . 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR . 54 Phần V. Kết luận và đề nghị . 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Đề nghị 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC . 64 [...]... chuyên canh lại là điều kiện cho nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt VirusTSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hƣởng đến kinh tế rất lớn Chính vì lý do đó mà đề tài Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu... đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” đƣợc thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu Thực tập, ứng dụng và bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh TSWV trên đối tƣợng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá đƣợc hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều... loại genome TSWV 13 Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng 49 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.45 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng 49 Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên... nhiễm bệnh có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng Bệnh virus đốm gân lá ớt a Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng nhất của bệnh là lốm đốm trên lá và gân lá có màu xanh lục đậm Ở một số giống ớt lá bị nhỏ lại và méo mó, trên một vài giống khác có thể thấy các đốm vòng chết hoại Sự nhiễm bệnh sớm làm cây lùn lại Trái trên cây nhiễm. .. với TSWV (Ray Cerkauskas, 2004), (Ken Pernezny và ctv, 2003) 18 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng Chẩn đoán bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh. .. phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh 19 Yêu cầu chung đối với mẫu Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất (Theo Lê Lƣơng... ngọn Trên cây bị bệnh có ít trái và trái nhỏ, đôi khi trái biểu hiện khảm và/hoặc bị biến dạng Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá a Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b Triệu chứng Lá thƣờng thể hiện triệu chứng khảm và những vệt xanh đậm rộng dọc theo gân lá Lá biến dạng, trái biến dạng và cây bị lùn cũng là triệu chứng thƣờng gặp ở những cây bị nhiễm bệnh virus này Ở... ép Cây bị nhiễm bệnh sớm trong vụ trồng thƣờng không sống đƣợc Bệnh virus đốm lá ớt ngọt a Mầm bệnh Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học b Triệu chứng Triệu chứng trên lá gồm có: trong gân lá, khảm, lốm đốm và hoá vàng Cây bị nhiễm bệnh trong thời kỳ đầu có thể bị lùn lại Khó phân biệt đƣợc triệu chứng do virus này gây ra với triệu chứng do các tobamovirus Bệnh virus... đến các vùng thịt lá giữa các gân Bệnh Tigre’ a Mầm bệnh Phức hợp Geminivirus gây ra và đƣợc truyền bởi bọ phấn b Triệu chứng Đặc điểm của bệnh Tigre’ là lá bị cong và hoá vàng rõ rệt mép lá và vùng thịt lá giữa các gân Lá bệnh nhỏ hẳn, nhăn nheo, mép lá cuốn ngƣợc lên trên Cây nhiễm bệnh trong những thời kỳ đầu bị lùn hẳn lại Bệnh virus gây khảm vàng Serrano a Mầm bệnh Do Geminivirus, đƣợc lan truyền... Trang Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV 11 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV 12 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV 14 Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV 15 Hình 2.5: Các loài bọ trĩ 16 Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR 24 Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc 33 Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc . ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT. CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT