Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV

Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kĩ thuật Elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chuẩn đoán bằng kĩ thuật RT-PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƯỜNG

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 8/2005

iii

Chân thành cảm tạ

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập

PGS TS Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này

TS Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này

KS Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này

Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện

Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu

Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi

Thành kính ghi ơn

Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích

Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đình Trường

iv

TÓM TẮT

NGUYỄN ĐÌNH TRƯỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG

 Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện

 Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Nội dung thực hiện:

 Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái

 Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt

 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng

- Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5%

- Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57%

- Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53%

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus

dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction

Genome L: Genome long

Genome M: Genome medium

Genome S: Genome short

N: Nucleocapside

cRNA: Complementary RNA

vRNA: Virion RNA

Tm: Melting temperature

Ta: Annealing temperature

GSP: Gen Special Primer

cDNA: Complementary DNA

p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate

RNAbc: RNA binding column

PVP: Polyvinylpyrolydol

vii

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa ii

Cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Mục lục vii

Danh sách các bảng xi

Danh sách các đồ thị xi

Danh sách các hình xii

Danh sách các sơ đồ xii

Phần I Mở Đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1

1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1

1.2.2 Yêu cầu 1

Phần II Tổng Quan Tài Liệu 2

2.1 Giới thiệu về cây ớt 2

2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt 2

2.1.2 Nguồn gốc cây ớt 2

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2

2.1.3.1 Thân 2

2.1.3.2 Rễ 2

2.1.3.3 Lá 2

2.1.3.4 Hoa 3

2.1.3.5 Quả 3

2.1.3.6 Hạt 3

2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt 3

2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt 4

2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác 4

2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 9

viii

2.3.1 Nhiệt độ 9

2.3.2 Ánh sáng 9

2.3.3 Ẩm độ 9

2.3.4 Đất và dinh dưỡng 9

2.4 Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 10

2.4.1 Sơ lược nguồn gốc TSWV 10

2.4.2 Cấu trúc TSWV 10

2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh 13

2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV 14

2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt 14

2.8 Con đường lây bệnh và dịch tễ học 15

2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển 16

2.10 Khống chế bệnh TSWV 16

2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 18

2.11.1 Phương pháp cây chỉ thị 18

2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận 18

2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống 18

2.11.2 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19

2.12 ELISA 19

2.12.1 Khái niệm về ELISA 19

2.12.2 Phân loại ELISA 20

2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 20

2.12.2.2 ELISA gián tiếp 21

2.12.2.3 Sandwich ELISA 21

2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 22

2.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA 23

2.12.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 23

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 23

2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 23

2.13.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 25

2.13.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 30

2.13.4 Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 31

ix

2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn 31

2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thước ngắn hơn 32

2.13.4.3 Không thu được bất kỳ sản phẩm nào 32

2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu 33

2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau 33

2.14 Phương pháp RT-PCR 33

2.14.1 Phân loại RT – PCR 33

2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bước 33

2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bước 34

2.14.2 Các phương pháp được thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34

2.15 Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 35

2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 35

2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới 35

Phần III Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu 36

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu 36

3.3 Phương pháp lấy mẫu 36

3.4 Các phương pháp chẩn đoán TSWV 37

3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA 37

3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA 37

3.4.1.2 Các bước thực hiện 37

3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR 39

3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad 39

3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di 40

3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR 40

3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR 41

3.4.2.5 Phướng pháp đổ gel agarose điện di 43

Phần IV Kết quả Thảo luận 45

4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA 45

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra 45

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt 46

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng 47

x

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi 50

4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 51

4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA 51

4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer 52

4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR 53

4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR 54

Phần V Kết luận và đề nghị 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Đề nghị 60

Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHẦN VII PHỤ LỤC 64

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh 4 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV 13 Bảng 3.1: Các địa bàn được lấy mẫu ớt 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phước Thạnh, Lộc Hưng 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng 49

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV 11

Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV 12

Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV 14

Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV 15

Hình 2.5: Các loài bọ trĩ 16

Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR 24

Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bước 33

Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bước 34

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 39

Hình 4.1: Ớt Ba tri bị nhiễm TSWV 46

Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV 46

Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong 47

Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn 47

Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ 48

Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 48

Hình 4.7: Kết quả điện di RNA 51

Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dương 53

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp 20

Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 21

Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp 21

Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 22

Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA 34

Phần I

Mở Đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan

trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây

vừa như một loại rau, vừa như một loại gia vị

Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin như: A,

B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác

Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần

so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nước ta

cây ớt được trồng với diện tích và sản lượng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị (Trích dẫn luận văn tốt nghiệp Nguyễn Hữu Trúc)

Ngoại thành TP.Hồ Chí Minh có điều kiện tự nhiên và xã hội thuận lợi cho việc phát triển nhiều chủng loại rau, trong đó cây ớt luôn được chú trọng và được trồng với diện tích ngày càng tăng Tuy nhiên, việc phát triển ớt chuyên canh lại là điều kiện cho nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus-TSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hưởng đến

kinh tế rất lớn Chính vì lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh

TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” được thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó

có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra

1.2 Mục Đích - Yêu cầu

1.2.1 Mục đích nghiên cứu

Thực tập, ứng dụng và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh TSWV

trên đối tượng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá được hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều tra

1.2.2 Yêu cầu

+ Phải đi thực tế tại các địa bàn để điều tra, lấy mẫu ớt

+ Nắm vững lý thuyết về hai phương pháp dDAS-ELISA cũng như RT – PCR, rồi

từ đó mới tiến hành các phương pháp chẩn đoán

Phần II Tổng Quan Tài Liệu

2.1 Giới thiệu về cây ớt

2.1.1 Sơ lược về cây ớt

Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), có khoảng 30 loài nhưng chỉ có 5 loài được trồng là: C.pendulum, C pubescens, C annum, C frutescens, và C chinensis, trong đó hai loài C pendulum và C pubescens được trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài C chinensis được trồng ở khu vực Amazon và Châu Phi, hai loài C annum và C frutescens được trồng khắp nơi trên thế giới

2.1.2 Nguồn gốc cây ớt

Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật học thì cây ớt có nguồn gốc từ Mehico

và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở Guatemala mà ở Evraz

Hiện nay ớt được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt

2.1.3.1 Thân

Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thường mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng có thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc lâu năm nhưng thường được gieo trồng như cây hàng năm

2.1.3.4 Hoa

Các hoa hoàn thiện và quả thường được sinh đơn độc trên từng nách lá Hoa có thể mọc thẳng đứng hoặc buông thòng Trên cuống hoa thường không có li tầng, hoa thường có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam, màu tím Hoa có 5-7 cánh hoa, cuống dài khoảng 1,5cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím, đầu nhụy có dạng hình đầu, hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh da trời hoặc tía

2.1.3.5 Quả

Thuộc loại quả mọng có nhiều hạt và chia làm nhiều ngăn Các giống khác nhau có kích thước quả, hình dạng, màu sắc, độ cay và độ mềm của thịt quả rất khác nhau Quả chưa chín có thể có màu xanh hoặc tím, quả chín có màu đỏ, da cam, vàng, màu kem hoặc hơi tím

2.1.3.6 Hạt

Hạt ớt nhỏ dẹp có dạng thận, màu vàng rơm, hạt có chiều dài khoảng 3-5mm, 1gram

ớt cay khoảng 220 hạt (Lương Nguyễn Thu Tâm, 1996-2001)

2.1.4 Giá trị dược liệu của cây ớt

Ớt được trồng khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc, ớt có loại ngọt và loại cay Ở Việt Nam, phổ biến nhất là loại ớt cay Quả ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng tiêu đờm, ổn trung, tán hàn, giải biểu, kiện vị, tiêu thực gây sung huyết, kích thích chung, thông kinh lạc, giảm đau, sát trùng Rễ ớt có tác dụng làm hoạt huyết, tán thũng Lá ớt

có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu

Công dụng: ớt ngọt được dùng làm rau ăn, ớt cay làm gia vị và là vị thuốc Quả ớt trị

tỳ vị hư lạnh, tiêu chảy, hắc loạn, nôn mửa, dạ dày ruột đầy trướng, mất trương lực, tích trệ, ăn không tiêu, đau nhức nửa đầu, đau lưng, đau khớp, thống phong, đau dây thần kinh, viêm thanh quản, viêm họng (Theo SK&ĐS, 2005)

2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt

Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh (trong 100g phần ăn đƣợc)

Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là Capsaicin (C18H27NO3), hàm lƣợng của nó phụ thuộc vào giống Quả còn chứa một loại dầu có màu đỏ, không cay, năng suất chiết xuất 20-25% dịch chiết alkaloid Quả

ớt xanh chứa nhiều rutin là một chất đƣợc dùng rộng rãi trong chế biến thuốc- y học (Nguyễn Hữu Trúc, 1995-2000)

2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác

Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng (Alfalfa)

Thông thường, lá không bị biến dạng Cây nhiễm bệnh có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng

Bệnh virus gây khảm dưa leo

có thể bao gồm: lá thu hẹp lại, khảm, hóa vàng, có đốm vòng vàng nhạt hoặc chết hoại, biến dạng lá sồi Trong một số trường hợp, chồi ngọn bị chết hoại Trên trái có thể xuất hiện những vòng vàng nhạt hoặc chết hoại

Bệnh virus đốm trên ớt

a Mầm bệnh

Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này được lan truyền bởi rệp

b Triệu chứng

Các giống mẫn cảm phát triển triệu chứng lốm đốm trầm trọng trên lá và thường

đi kèm theo triệu chứng gân xanh và biến dạng lá Nhiều chủng virus gây biến dạng mạnh trên trái

Bệnh virus gây khảm nặng trên ớt

a Mầm bệnh

Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này được lan truyền bởi rệp

Bệnh virus Y khoai tây

Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá

a Mầm bệnh

Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này được lan truyền bởi rệp

b Triệu chứng

Lá thường thể hiện triệu chứng khảm và những vệt xanh đậm rộng dọc theo gân

lá Lá biến dạng, trái biến dạng và cây bị lùn cũng là triệu chứng thường gặp ở những cây bị nhiễm bệnh virus này Ở hầu hết các giống, năng suất và chất lượng trái bị suy giảm nghiêm trọng Trong một số thời vụ giống ớt này bị thất thu hoàn toàn

Bệnh virus gây cong ngọn củ cải

a Mầm bệnh

Bệnh do Geminivirus gây ra, virus này được lan truyền bởi rầy lá

b Triệu chứng

Triệu chứng điển hình gồm có sự cong mép các lá già lên trên và mép lá non hơn cong lên rất mạnh Cuống lá cong nhiều về phía dưới Cây bị nhiễm bệnh vào những giai đoạn đầu bị vàng và lùn rõ rệt Sau khi nhiễm bệnh cây cho rất ít trái, những trái

có sẵn nhỏ lại, méo mó và chín ép Cây bị nhiễm bệnh sớm trong vụ trồng thường không sống được

Bệnh virus gây đốm nhẹ trên cây ớt (Bệnh khảm ớt hay bệnh khảm ẩn thuốc lá Samsun)

Bệnh virus khảm thuốc lá - Bệnh virus khảm cà chua

Bệnh virus gây héo đốm lá cà chua

a Mầm bệnh

Do Tospovirus gây ra và được lan truyền bởi bọ trĩ

Bệnh virus gây khảm vàng Serrano

a Mầm bệnh

Do Geminivirus, đƣợc lan truyền bởi bọ phấn

b Triệu chứng

Sự xâm nhiễm của virus gây ra khảm vàng tàn lá ớt

Bệnh geminivirus trên ớt Texas

a Mầm bệnh

Geminivirus, virus này đƣợc lan truyền bởi bọ phấn

b Triệu chứng

Cây bệnh biểu hiện triệu chứng cong lá và biến dạng Mép lá có xu hướng cuốn lên trên và xuất hiện các đốm vàng sáng, đôi khi các viền vàng lan vào trong các vùng

mô giữa gân lá (Bùi Cách Tuyến)

2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt

2.3.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng, số hoa, tỷ lệ đậu quả Nhiệt độ ngày/đêm khoảng 25/18 là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng, phát triển của ớt nói chung, tăng năng suất, tăng số quả thương phẩm Nhiệt độ ban đêm thấp (8-15oC) thường làm giảm

tỷ lệ đậu quả và sinh quả không hạt, nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20o

C trong giai đoạn nở hoa Ngoài ra nhiệt độ thấp còn làm giảm kích thước dạng quả Nói chung ớt thích hợp nhiệt độ cao hơn và dao động trong khoảng 20-30oC

2.3.2 Ánh sáng

Ớt là cây không mẫn cảm lắm với ánh sáng nhưng là cây ưa ánh sáng ngày ngắn Nếu chiếu sáng 9-10 giờ sẽ kích thích sinh trưởng, tăng sản phẩm khoảng 21-24% và tăng chất lượng quả Trời âm u sẽ làm hạn chế khả năng đậu quả, làm giảm năng suất của cây ớt

2.3.3 Ẩm độ

Ớt rất thích với điều kiện đất ẩm, đất ẩm nhưng trong điều kiện không khí khô hạn sẽ kích thích quá trình chín của quả Ớt là cây chịu hạn, nếu ẩm độ đất khoảng 10% tỷ lệ rụng quả tăng đến trên 71%, trong khi ẩm độ từ 55-58% tỷ lệ rụng quả chỉ còn 20-30% Nếu ẩm độ thấp hơn 70% trong giai đoạn ra hoa, hình thành quả thì quả

sẽ bị sần sùi, giảm giá trị thương phẩm Tốt nhất duy trì độ ẩm đồng ruộng khoảng 80% Nếu ẩm độ quá cao rễ sinh trưởng kém, cây còi cọc

70-2.3.4 Đất và dinh dưỡng

Ớt là cây trồng tương đối dễ tính Đất phù hợp nhất là đất thịt nhẹ, giàu vôi, ớt có thể sinh trưởng, cho năng suất trên đất cát nhưng phải bảo đảm được chế độ nước và dinh dưỡng đầy đủ Đất chua và kiềm đều không thích hợp cho ớt sinh trưởng và phát triển Ớt có thể sinh trưởng ở đất chua và màu mỡ nhưng tỷ lệ nảy mầm và tính chín sớm bị ảnh hưởng Ớt là cây chịu mặn, người ta đã nghiên cứu và thấy rằng ớt có thể nảy mầm ngay cả ở nồng độ muối 4000ppm và pH=7,6

2.4 Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV)

2.4.1 Sơ lược nguồn gốc TSWV

TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới TSWV được báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nó gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó được mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus Bên cạnh ớt, cà chua

và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì còn có họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác Tỉ lệ nhiễm khoảng 59-90% điều này đưa đến hậu quả là nó ảnh hưởng lên các loại hoa màu có giá trị thương mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hưởng đến các loại hoa màu nhiều nhất (Lindsey Irons and Emily Sims)

2.4.2 Cấu trúc TSWV

TSWV là thành viên của giống Tospovirus, thuộc họ Bunya viridae là một nhóm

lớn virus chứa vật liệu di truyền là các sợi đơn RNA TSWV là những tiểu phần nhỏ, đường kính 80-120nm Genome của TSWV gồm một sợi RNA âm tính và hai sợi RNA ambisense Mỗi RNA của genome thì được bao bọc bởi nhiều bản copy của Nucleocapside (N) để hình thành nên ribonucleoprotein cũng được biết như là nucleocapside Các nucleocapside được bao bọc bên trong lớp màng đôi được tạo ra từ

ký chủ và đi kèm với protein L phụ thuộc vào chuỗi RNA Chúng để lộ các glycoprotein ra ngoài bề mặt 5-10nm mà sau khi đã gắn vào lớp màng đôi lipid dày khoảng 5nm Tính trên thành phần tổng số thì RNA chiếm 2%; protein chiếm 58%; lipid chiếm 33% và carbohydrate chiếm 7% Chúng chỉ xuất hiện trong tế bào chất mà không ở bất kỳ tổ chức nào Theo một nhà khoa học thì có ba thuyết chính giải thích

về hình thể tròn của virus Thứ nhất là nồng độ của khối khuếch tán bình thường là rất cao và đôi khi vỏ nucleoprotein của virus lại xoắn lại Thứ hai là sự bao bọc các nucleoprotein trần này bằng các màng để tạo nên virus trưởng thành Thuyết thứ ba là

sự cách ly với các phần của virus trong các buồng bên trong các lỗ trong màng hoặc trong hệ thống lưới nội chất là một phản ứng của cây ký chủ (cô lập chúng bằng cách bao chúng lại)

Tất cả các virus thuộc họ này đều có ba đoạn genome RNA, được đặt tên là L (long), M (medium), và S (short) Có thể số lượng thì không tương đồng trong mỗi loại virion bởi vì sự giống hay khác nhau về số lượng của các đoạn này là không có ý nghĩa

Đoạn genome L tạo ra một loại protein, đây là một polymerase Các đoạn M tạo ra các glycoprotein được đặt tên là G1 và G2 Đoạn genome S tạo ra các nucleoprotein Tiến trình tái bản của genome L nền tảng cho TSWV (genome L tạo ra polymerase, đây là một enzyme cần thiết cho sự tái bản để nhân lên của virus trong cơ thể ký chủ) Chính các bản sao của RNA của virus thành cRNA, cRNA sau đó sẽ tạo ra nhiều vRNA, hai tiến trình này thường xuyên tạo ra lẫn nhau vRNA sau đó thực hiện sao mã

và dịch mã thành chuỗi protein Đây là cách để tái bản genome tốt nhất Tiến trình này khác với cả các đoạn genome S và M Đồng thời chính các sao của vRNA cũng chuyển thành cRNA Tuy nhiên, cRNA sau đó cũng trải qua quá trình sao mã và dịch

mã một cách trực tiếp mà không cần sự có mặt của vRNA, song song với cRNA thì vRNA cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã Khả năng này xảy ra thì được gọi là

“ambisense” Điều này có nghĩa là các đoạn S và M có cả các chiến lược tái bản mang

ý nghĩa “positive” và “negative” Kết quả là tạo ra protein phi cấu trúc được gọi là NSs hoặc NSm và nó phụ thuộc vào genome mà ta đang quan sát Đoạn S cũng tạo ra protein N và đoạn M tạo ra cả hai loại G1 và G2 bằng việc phân cắt protein trong quá trình dịch mã Cho đến nay thì chức năng của protein NS vẫn chưa được biết rõ Bên cạnh đó một điều đáng quan tâm là giữa các đoạn S, L, M có trình tự kết thúc như nhau khi ta quan sát trình tự nucleotide của chúng Vùng đầu tiên của các sợi đều như nhau, còn vùng cuối cùng thì có sự phân biệt Có lẽ chính điều này mà không thể tìm thấy sự tương đồng trong các virion (Lindsey Irons and Emily Sims)

Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV

Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV

(Peter Schreier, Prof Dr Martin Hülskamp, 2002)

Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV

(Biowave vol.6 No.23, 2004)

2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh

Con đường xâm nhập và tái bản virus được thể hiện như hình vẽ, các đoạn RNA tái bản từ đầu đến cuối Đầu tiên là tấn công của hạt virion Thứ hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo virus bằng sự ẩm thực bào của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus

và màng nhân Thứ ba là sự sao mã sơ cấp xảy ra Thứ tư là sự dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng và xảy ra sự glycozyl hoá đầu tiên các protein vỏ mới được tạo ra Giai đoạn thứ năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp như là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trường hợp là những mRNA Tiếp đến là sự tái bản genome theo sau là sự sao mã thứ cấp, tức là tổng hợp các loại mRNA và xuất hiện sự sao mã ambisense Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa khối

tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trưởng thành

Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV

(Lindsey Irons and Emily Sims)

2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV

Triệu chứng là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, héo tạo đốm trên cây, thay đổi màu của thân cành, cây cằn cỗi, đốm lấm chấm như màu rám nắng Điều này làm cho cây bị biến đổi rất mạnh mẽ cả về hình thái và sức sống Sự gây hại này phụ thuộc vào việc trồng trọt, cách ly với virus, giai đoạn phát triển của cây khi bị tấn công và điều kiện môi trường Nếu cây trồng bị nhiễm lúc giai đoạn đang phát triển thì nó sẽ gây hại nghiêm trọng và đôi khi không cho ra quả, nếu cây trồng bị nhiễm sau khi cây đã ra quả thì sẽ làm giảm khả năng quang hợp, xuất hiện các đốm hoại tử hoặc các vòng hoại tử trên cành, thân, lá Hiện tượng rụng hoa và lá cũng xuất hiện trong một số trường hợp Sự tăng màu diệp lục tố, xuất hiện các đốm hoại tử, các vòng nhẫn hoặc thể khảm có thể tăng trên quả khi cây bị nhiễm Những triệu chứng này làm mất giá trị cảm quan khi cây trưởng thành.( Theo Ken Pernezny và ctv, 2003)

2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt

Triệu chứng bệnh TSWV trên cây ớt rất thay đổi Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng ở một số giống, xảy ra chết hoại toàn bộ chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo

mó Cây bị nhiễm ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trưởng bình thường

từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loại bọ trĩ khác nhau (Thysanoptera, thuộc

họ Thripidae) Các loài bọ trĩ trên hoa Western (Frankliniella occidentalis), bọ trĩ trên thuốc lá (F fusca) là các vectơ chính truyền bệnh Ngoài ra F schultzei, F intonsa, F bispinosa, Thrips tabaci và Thrips setosus cũng có thể mang virus này Thông thường

thì bọ trĩ ở giai đoạn ấu trùng thường mang TSWV như một nhu cầu cần thiết, còn bọ trĩ ở giai đoạn trưởng thành thì lại mang TSWV không thường xuyên lắm TSWV sinh sản trong bọ trĩ càng tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó Virus và các

vectơ của nó thì càng lan rộng nhanh hơn khi lưu chuyển cây cảnh và rau quả đi từ vùng này sang vùng khác, các cánh đồng thuốc lá, đậu phụng và cỏ dại là những nguồn thường xuyên và phổ biến nhất cho các loại virus và vectơ truyền bệnh này

Hình 2.5: Các loài bọ trĩ

(Lindsey Irons and Emily Sims)

2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển

Các loài bọ trĩ được xem là trung gian truyền virút TSWV chính trên cây ớt Chúng thì nhỏ, sinh sản nhanh chóng, sống ký sinh trên một phổ rộng các loại thực vật và vào các cánh đồng một cách thường xuyên Các loài bọ trĩ chỉ ăn phần thịt của lá, thân, quả

và các bộ phận của hoa Khi chúng ăn các phần trên sẽ làm phá hủy về hình dạng Bọ trĩ chưa trưởng thành, chưa có cánh thì đòi hỏi phải có virus ký sinh và chúng di chuyển nhiều hơn các con trưởng thành và từ đó truyền mầm bệnh giữa các cây với nhau, từ đó dẫn đến mức độ lây lan rất nhanh Vòng đời của bọ trĩ thường từ 7-10 ngày

ở nhiệt độ dao động từ 20 – 37oC Thông thường có khoảng ba thế hệ trong suốt mùa phát triển TSWV cứ nhiễm dai dẳng từ năm này sang năm khác trong các cây bị nhiễm từ những loài bọ trĩ ký sinh trong các mùa vụ kế cận nhau (Ray Cerkauskas, 2004)

2.10 Khống chế bệnh TSWV

TSWV ngày càng mở rộng mạnh mẽ phổ ký chủ và vectơ truyền bệnh, điều này làm cho việc khống chế chúng trở rất nên khó khăn Thêm vào đó là sự khan hiếm các gen kháng ở cây ký chủ, đồng thời cỏ dại và cây cảnh là những kho dự trữ để lưu lại virus và truyền bệnh cho vụ mùa sau Do đó khi bệnh xuất hiện trong một mùa vụ, các cây trồng nên được loại và tiêu huỷ nhanh chóng cả những cây đang mang mầm bệnh tiềm ẩn và những cây có triệu chứng bệnh biểu hiện ở mức độ nghiêm trọng Các bột

sáp bên ngoài những cây có triệu chứng bệnh thì không phải luôn luôn gây ảnh hưởng,

mà nó là các đối chứng cho việc nhiễm sau này vì TSWV thường mở rộng mức độ lây lan trước khi phát triển triệu chứng bệnh Sau đây là một số biện pháp phòng bệnh TSWV:

 Loại bỏ các loài cỏ dại và những cây mọc tự nhiên, duy trì các khoảng đệm cách

ly không chứa cây cối khoảng 10 mét

 Giảm mật độ trồng để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những nguồn bị nhiễm bệnh

 Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3-4 tuần, nhằm cho phép các loại

bọ trĩ có thể nổi lên lại từ những phần của hoa màu và từ đó có thể loại bỏ chúng khỏi cánh đồng hoa màu Nếu tiết kiệm, đất có thể được xông với methamsodium (Vapam) hoặc 1,3-dichloropropene (Telone) để loại trừ bọ trĩ đang tồn tại trong các phần của hoa màu trong đất

 Nên lựa chọn trồng những cây không dễ dàng mắc bệnh, vì tỉ lệ quần thể TSWV

và bọ trĩ ở khắp mọi nơi là rất cao

 Loại bỏ tất cả những nguồn bọ trĩ vào cuối mỗi mùa vụ để tránh chứa chấp một quần thể nhỏ sẵn sàng tấn công vào vụ sau

 Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để trì hoãn sự kháng thuốc

Hứa hẹn trong tương lai là sẽ phân lập các gen kháng để chuyển vào cây ớt cho phép tạo ra tính kháng với TSWV (Ray Cerkauskas, 2004), (Ken Pernezny và ctv, 2003)

2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV

2.11.1 Phương pháp cây chỉ thị

Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng Chẩn đoán bằng cây chỉ thị

là phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật

Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống Cây nhiễm bệnh cục bộ thường tạo ra các vết chết trên lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống thường tạo ra triệu chứng toàn thân như: khảm lá, biến vàng, lùn cây, và một số triệu chứng khác

Để thu được cây chỉ thị thì chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

 Các điều kiện chuẩn bị để làm thí nghiệm lây bệnh trên cây chỉ thị: đất thí nghiệm, phân bón

Các cây chỉ thị được sử dụng trước tiên với mục đích để chẩn đoán bệnh hại: người

ta thường dùng những cây có triệu chứng nhiễm bộ phận để thực hiện thí nghiệm này Các cây nhiễm hệ thống thường được dùng để giữ nguồn virus phục vụ các thí nghiệm trong phòng

Cây chỉ thị là cách chẩn đoán quan trọng trong các phòng thí nghiệm virus thực vật

vì chúng là cơ sở ban đầu để chẩn đoán Nhược điểm cơ bản của phương pháp này cần

có thời gian lây bệnh và phải chờ cây phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh

Yêu cầu chung đối với mẫu

Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể được dùng làm mẫu phân tích Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tươi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV Trường hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất

(Theo Lê Lương Tề - Vũ Triệu Mân, 1999)

2.11.2 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử

 Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhưng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân

 Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác Phương pháp này giúp ta xác định được hai virus khác nhau trong cùng một mẫu

 Người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu được cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh (Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001)

(Nguyễn Văn Tuất, 2002)

2.12 ELISA

2.12.1 Khái niệm về ELISA

 Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể

Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid (N); glycoprotein (GP) G1

(Trích từ Chemicon International)

2.12.2 Phân loại ELISA

2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên

Rửa Thêm kháng thể có gắn enzyme

Rửa

Ủ ở 37oC Thêm cơ chất

Ủ ở 37o

C

Đọc kết quả

2.12.2.2 ELISA gián tiếp

Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 2.12.2.3 Sandwich ELISA

Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:

 Sandwich ELISA trực tiếp

Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp

Cho kháng nguyên vào đĩa

Đem ủ, rửa Thêm kháng thể

Ủ, rửa

Bổ sung kháng kháng thể có gắn enzyme

Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả

Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA

Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào

Ủ, rửa

Bổ sung kháng thể có gắn enzyme

Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả

 Sandwich ELISA gián tiếp

Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp

Ủ, rửa Thêm kháng thể thứ II

Ủ, rửa

Bổ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzyme vào

Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả

Cho kháng nguyên vào Cho kháng nguyên vào

Bổ sung kháng nguyên Không bổ sung kháng nguyên

Thêm kháng thể có gắn enzyme Thêm kháng thể có gắn enzyme

Bổ sung cơ chất tạo màu Bổ sung cơ chất tạo màu

Đọc kết quả (không màu): 100% Đọc kết quả (màu): 0%

 Tuỳ theo độ đậm nhạt của màu mà ta có phần trăm mức độ cạnh tranh từ

đó kết luận mức độ nhiễm bệnh

cạnh tranhcạnh tranh

2.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA

 Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng

 Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên

 Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

 Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai

(Chemicon International)

2.12.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA

 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm

 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản

 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu

 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản

 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm (Trích từ Chemicon International)

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :

 Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (denature)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

 Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để có phân tử DNA mới

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70o

C, kéo dài trong khoảng

30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp

 Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m : là số bản sao của chuỗi mã hóa

n : là số chu kỳ

Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR

Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA Trong chu kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Người ta hy vọng có khoảng 105

lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp

Những phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase, và sự

thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và nhiệt độ cho bắt cặp

Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn nào đó của DNA

Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kí hiệu là F Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, kí hiệu là R Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA bổ sung của

nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase

2.13.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR

 DNA mẫu

PCR là một công cụ rất mạnh để khuếch đại DNA, vì thế trong phản ứng PCR chỉ cần một lượng rất nhỏ là đủ Nhưng để giảm bớt lỗi gây ra bởi Taq DNA polymerase thì một nồng độ cao hơn có thể được sử dụng, tuy nhiên nếu nồng độ DNA khuôn mẫu quá cao thì sẽ làm gia tăng mức độ nhiễm đồng thời có thể làm giảm hiệu quả phản ứng

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào

Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch

Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2-5 phút

 Enzyme DNA polymerase

Người ta thường sử dụng Taq polymerase, đây là enzyme chịu nhiệt ly trích từ

vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus (Bùi Trang Việt, 2002) Với enzyme này,

PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide

trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80oC Đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (Newton và Graham, 1997)

Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ

số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn

Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một

nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu

tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation) Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của

Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác

 Lựa chọn Enzyme polymerase cho phản ứng PCR

DNA Polymerase Tự nhiên hoặc tái tổ

Amplitaq (Stoffel fragment)® Tái tổ hợp T aquaticus

 Đặc tính của từng loại DNA polymerase đƣợc sử dụng trong PCR

>95%

đầu bằng

đầu bằng 3' A đầu bằng

Trọng lƣợng

 Primer

Một số chỉ tiêu cơ bản trong thiết kế- lựa chọn Primer:

 Thông thường các primer có chiều dài 20- 30 mer

 Không nên thiết kế các primer có polybase (chuỗi base cùng loại) hay những trình tự lặp lại

 Kiểm tra lại primer để tránh hiện tượng primer- dimer

 Thêm một cặp GC vào đầu tận cùng 5’ nếu thấy có vị trí cắt giới hạn ở

đó

 Các trình tự bổ sung với các primer khác sử dụng trong PCR nên được tránh để ngăn chặn sự lai giữa các primer với nhau

 Khoảng cách giữa các primer nên thấp hơn 10 kb

 Thêm một hoặc hai G / C vào đầu tận cùng 3’ thì tốt nhưng tránh thêm quá nhiều vì điều này có thể cho kết quả là sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu

 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa Thành phần

nucleotide của các primer cân bằng, tránh các cặp G, C lặp lại nhiều lần

 Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại,

không trùng với các trình tự lặp lại trên genome

 Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn Phản

ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb

Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer:

 Cách 1: Cách này chỉ sử dụng khi chiều dài primer không quá 20

 Nhiệt độ bắt cặp

Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào

của phản ứng cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt

Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ Tm, mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide:

Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)

A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide

Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ lai Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại

Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm được nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra Nếu nhiệt độ lai quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm

Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5oC Thông thường, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ lai 50-55oC Nếu chuỗi dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ lai có thể đến 55-

65oC Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và kéo dài có thể được kết hợp và thực hiện ở 68-72oC Khi dùng dư oligonucleotide với khả năng bắt cặp sai, nhiệt độ bắt cặp có thể giảm còn 37-45oC (Hồ Bích Liên,2003)

 Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối ưu giữa primer và DNA mẫu Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như trường hợp DNA mẫu quá loãng Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều

Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5μM (12.5 pmol/25 μl phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tượng primer-dimer