2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị
Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (cĩ thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng cĩ triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chĩng. Chẩn đốn bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật.
Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhĩm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống. Cây nhiễm bệnh cục bộ thƣờng tạo ra các vết chết trên lá, thân,…cịn cây nhiễm hệ thống thƣờng tạo ra triệu chứng tồn thân nhƣ: khảm lá, biến vàng, lùn cây, và một số triệu chứng khác.
Để thu đƣợc cây chỉ thị thì chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:
Các điều kiện chuẩn bị để làm thí nghiệm lây bệnh trên cây chỉ thị: đất thí nghiệm, phân bĩn.
Phƣơng pháp trồng trọt cây chỉ thị
Phƣơng pháp tiến hành lây bệnh nhân tạo (Vũ Triệu Mân, 2003)
2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận
Nhƣ cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) virus X gây vết chết hình nhẫn vịng viền đỏ.
Cây rau muối (Chenopodium quinoa) virus S gây các đốm vàng trên lá.
2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống
Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum var xanthi virus Y gây khảm lá và gân sáng. Cây tầm bĩp Mỹ: Physalis floridana gây hiện tƣợng vàng lùn cây sau khi truyền bằng rệp.
Các cây chỉ thị đƣợc sử dụng trƣớc tiên với mục đích để chẩn đốn bệnh hại: ngƣời ta thƣờng dùng những cây cĩ triệu chứng nhiễm bộ phận để thực hiện thí nghiệm này. Các cây nhiễm hệ thống thƣờng đƣợc dùng để giữ nguồn virus phục vụ các thí nghiệm trong phịng.
Cây chỉ thị là cách chẩn đốn quan trọng trong các phịng thí nghiệm virus thực vật vì chúng là cơ sở ban đầu để chẩn đốn. Nhƣợc điểm cơ bản của phƣơng pháp này cần cĩ thời gian lây bệnh và phải chờ cây phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh.
Yêu cầu chung đối với mẫu
Tồn bộ hoặc một phần của lá đều cĩ thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên liệu địi hỏi phải cịn tƣơi, lá lớn và cịn non, khơng sử dụng lá già. Chọn những lá cĩ biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đốn bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây cĩ sự phân bố khơng đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà cĩ biểu hiện bệnh mạnh nhất.
(Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999).
2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng kính hiển vi điện tử
Virus thực vật cĩ những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhƣng cũng cĩ thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân tử protein
Chúng ta khơng thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta cĩ thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phĩng đại 500.000 lần.
Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thơng qua làm tinh khiết cố định bằng hố chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.
Cĩ thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu.
Ngƣời ta cịn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. (Phạm Đức Tồn, 1996 – 2001)
(Nguyễn Văn Tuất, 2002)
2.12 ELISA
2.12.1 Khái niệm về ELISA
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid (N); glycoprotein (GP) G1.
(Trích từ Chemicon International)
2.12.2 Phân loại ELISA
2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên
Rửa Thêm kháng thể cĩ gắn enzyme Rửa Ủ ở 37oC Thêm cơ chất Ủ ở 37o C Đọc kết quả
2.12.2.2 ELISA gián tiếp
Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 2.12.2.3 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA cĩ thể đƣợc chia làm hai hệ thống: Sandwich ELISA trực tiếp
Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
Cho kháng nguyên vào đĩa Đem ủ, rửa
Thêm kháng thể Ủ, rửa
Bổ sung kháng kháng thể cĩ gắn enzyme Ủ, rửa
Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả
Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa
Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa
Bổ sung kháng thể cĩ gắn enzyme Ủ, rửa
Thêm cơ chất tạo màu
Sandwich ELISA gián tiếp
Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh
C-ELISA (competition ELISA)
(John R. Crowther, 2001).
Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA Ủ, rửa
Thêm kháng nguyên Ủ, rửa
Thêm kháng thể thứ II Ủ, rửa
Bổ sung kháng kháng thể thứ II cĩ gắn enzyme vào Ủ, rửa
Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả
Trƣờng hợp I Trƣờng hợp II
Cho kháng nguyên vào Cho kháng nguyên vào
Ủ, rửa Ủ, rửa
Bổ sung kháng nguyên Khơng bổ sung kháng nguyên Thêm kháng thể cĩ gắn enzyme Thêm kháng thể cĩ gắn enzyme
Ủ, rửa Ủ, rửa
Bổ sung cơ chất tạo màu Bổ sung cơ chất tạo màu
Ủ Ủ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đọc kết quả (khơng màu): 100% Đọc kết quả (màu): 0%
Tuỳ theo độ đậm nhạt của màu mà ta cĩ phần trăm mức độ cạnh tranh từ đĩ kết luận mức độ nhiễm bệnh.
cạnh tranh cạnh tranh
2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
Số lƣợng kháng thể thứ nhất đƣợc gắn vào đáy giếng Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai
(Chemicon International)
2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA
Nếu các đối chứng âm cho kết quả dƣơng tính thì cĩ thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.
Nếu màu khơng xuất hiện đối với đối chứng dƣơng hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hố chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dƣơng và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể đƣợc gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu
Nếu cĩ tạo màu đối với mẫu nhƣng khơng tạo màu với đối chứng dƣơng thì cĩ thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm. (Trích từ Chemicon International).
2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :
Bƣớc 1: Biến tính sợi đơi thành sợi đơn (denature)
Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vịng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đĩng vai trị là mạch khuơn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bƣớc 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để cĩ phân tử DNA mới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuơn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70o
C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nĩng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp.
Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hĩa di truyền đặc biệt nào đĩ đƣợc khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này cĩ thể đƣợc tính nhƣ sau:
Tổng lƣợng DNA khuếch đại = m x 2n m : là số bản sao của chuỗi mã hĩa. n : là số chu kỳ.
Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR
Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ cĩ sản phẩm chuỗi dài đƣợc hình thành, cịn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài đƣợc tích tụ theo hƣớng tuyến tính, cịn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Ngƣời ta hy vọng cĩ khoảng 105
lƣợng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR đƣợc áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA cĩ chiều dài 200-2000bp.
Những phản ứng trên đƣợc thực hiện nhờ polymerase nhƣ Taq polymerase, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và nhiệt độ cho bắt cặp.
Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) đƣợc dùng để khuếch đại một đoạn nào đĩ của DNA.
Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ cịn đƣợc gọi là forward primer, kí hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ cịn đƣợc gọi là reverse primer, kí hiệu là R. Sự sắp xếp nhƣ vậy đảm bảo vùng bị can thiệp đƣợc tăng cƣờng hoạt động, theo 3 trình tự đã nĩi ở trên. Tĩm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA bổ sung của
nĩ trong điều kiện một khoảng cách đã đƣợc kích hoạt, các đoạn DNA này cĩ thể sẽ đƣợc khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.13.2.Tối ƣu hĩa các điều kiện cho phản ứng PCR
DNA mẫu
PCR là một cơng cụ rất mạnh để khuếch đại DNA, vì thế trong phản ứng PCR chỉ cần một lƣợng rất nhỏ là đủ. Nhƣng để giảm bớt lỗi gây ra bởi Taq DNA polymerase thì một nồng độ cao hơn cĩ thể đƣợc sử dụng, tuy nhiên nếu nồng độ DNA khuơn mẫu quá cao thì sẽ làm gia tăng mức độ nhiễm đồng thời cĩ thể làm giảm hiệu quả phản ứng.
Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đốn bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Thơng thƣờng, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ khơng ảnh hƣởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch.
Đối với những DNA cĩ kích thƣớc quá lớn (>50kb), sự biến tính cĩ thể khơng hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trƣờng hợp này, cần phải cắt DNA trƣớc bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đĩ khơng cắt trong chuỗi đích; hoặc cĩ thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2-5 phút.
Enzyme DNA polymerase
Ngƣời ta thƣờng sử dụng Taq polymerase, đây là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nƣớc nĩng Thermus aquaticus (Bùi Trang Việt, 2002). Với enzyme này, PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq cĩ thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80oC. Đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (Newton và Graham, 1997).
Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thơng thƣờng là 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm khơng chuyên tính cĩ thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ khơng cĩ đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase cĩ khuynh hƣớng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dịng (TA- cloning) và nĩ sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu
tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngồi ra cĩ thể làm gia tăng hoạt tính của
Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use
Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.
Lựa chọn Enzyme polymerase cho phản ứng PCR
DNA Polymerase Tự nhiên hoặc tái tổ
hợp Nguồn gốc
Taq Tự nhiên Thermus aquaticus
Amplitaq® Tái tổ hợp T. aquaticus
Amplitaq (Stoffel fragment)® Tái tổ hợp T. aquaticus
Hot Tub™ Tự nhiên Thermus flavis
Pyrostase™ Tự nhiên T. flavis
Vent™ Tái tổ hợp Thermococcus litoralis
Deep Vent™ Tái tổ hợp Pyrococcus GB-D
Tth Tái tổ hợp Thermus thermophilus
Pfu Tự nhiên Pyrococcus furiosus
ULTma™ Tái tổ hợp Thermotoga maritima
Đặc tính của từng loại DNA polymerase đƣợc sử dụng trong PCR
(Michael Blaber, 1998)
Taq/Amplitaq® Stoffel
fragment Vent™ Vent™ Deep Pfu Tth ULTma™ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
95 °C half-life 40 phút 80 phút phút 400 1380 phút >120 phút phút 20 >50 phút 5'3' exo + + 3'5' exo + + + + Tỉ lệ kéo dài (nucleotide/giây) 75 >50 >80 ? 60 >33 ? Hoạt tính Reverse transcription Yếu Yếu ? ? ? Tốt ? Tạo ra đầu tận cùng 3' A 3' A >95% đầu bằng >95% đầu bằng đầu bằng 3' A đầu bằng Sự đổi chỗ sợi + + Trọng lƣợng phân tử (kDa) 94 61 ? ? 92 94 70
Primer
Một số chỉ tiêu cơ bản trong thiết kế- lựa chọn Primer: Thơng thƣờng các primer cĩ chiều dài 20- 30 mer
Khơng nên thiết kế các primer cĩ polybase (chuỗi base cùng loại) hay những trình tự lặp lại
Kiểm tra lại primer để tránh hiện tƣợng primer- dimer
Thêm một cặp GC vào đầu tận cùng 5’ nếu thấy cĩ vị trí cắt giới hạn ở đĩ
Các trình tự bổ sung với các primer khác sử dụng trong PCR nên đƣợc tránh để ngăn chặn sự lai giữa các primer với nhau
Khoảng cách giữa các primer nên thấp hơn 10 kb
Thêm một hoặc hai G / C vào đầu tận cùng 3’ thì tốt nhƣng tránh thêm quá nhiều vì điều này cĩ thể cho kết quả là sẽ tạo ra các sản phẩm PCR khơng đặc hiệu Tm của mồi xuơi và mồi ngƣợc khơng cách biệt nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các primer cân bằng, tránh các cặp G, C lặp lại nhiều lần.
Các primer đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên genome.
Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuơi” và “ngƣợc” khơng quá lớn. Phản ứng sẽ tối ƣu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb.
Tính tốn nhiệt độ nĩng chảy (Tm) của primer:
Cách 1: Cách này chỉ sử dụng khi chiều dài primer khơng quá 20 nucleotide
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C]
Cách 2: Hiệu quả đối với primer cĩ chiều dài từ 14 – 70 nucleotide Tms = 81.5 + 16.6(log10[J+]) + 0.41(%G+C) - (600/l)
+ [J+] : nồng độ mol các cation hố trị I + (%G+C) : % nucleotide loại G và C
Cách 3: Hiệu quả nhất đối với các primer cĩ chiều dài từ 20 – 35 base Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))
Nhiệt độ bắt cặp
Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào của phản ứng cũng cĩ thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt.
Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một cơng thức để ƣớc đốn nhiệt độ Tm, mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Cơng thức đƣợc sử dụng trong điều kiện primer cĩ khoảng 20 oligonucleotide:
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)
A, T, C, G là số lƣợng các base cĩ trong oligonucleotide.
Tuy nhiên, việc tính tốn này chỉ cĩ tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để cĩ sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới cĩ thể cĩ số liệu đúng về nhiệt độ lai. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại.
Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm đƣợc nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer khơng chuyên biệt cĩ thể xảy ra. Nếu nhiệt độ lai quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm.
Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5oC. Thơng thƣờng, với một oligonucleotide cĩ 20 nucleotide cĩ thể dùng nhiệt độ lai 50-55oC. Nếu chuỗi dài hơn