Nghiên cứu thực trạng nhiễm bệnh vi rút gây xoăn ngọn cà chua trên cây ớt tại tỉnh Long An

Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu

• Các phương pháp chẩn đoán TSWV

Đây là phương pháp dễ thực hiện nhưng lại cho hiệu quả rất đáng tin cậy, kháng thể đƣợc sử dụng ở đây là kháng thể đơn dòng đƣợc cung cấp bởi công ty Biorad dùng để chẩn đoán sự hiện diện của virus TSWV gây bệnh trên cây ớt. Dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng). Trờn mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hỳt vào 100àl, chạy trờn 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đú phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loóng 140àl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trước khi dùng.

 Bước 4: mỗi đối chứng âm và dương được hoà tan với 1ml nước cất, hút 100àl mỗi loại đối chứng vào cỏc giếng đối chứng, tiếp theo hỳt 100àl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Hỳt 100àl dung dịch khỏng thể cú gắn enzyme đó được pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Cách pha: nghiền nát thành bột mịn 7 viên pNPP (mỗi viên 5mg), cho vào 35ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm.

Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nước cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng.  Bước 3: Cho 700àl dung dịch đó được trộn ở bước trờn vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần.  Bước 1: Cỏc mẫu sau khi ly trớch xong, hỳt 2àl để chạy điện di, thấy xuất hiện các vệt băng.

 Primers (mồi): Dưới đây là một số cặp primer được sử dụng trong PCR để khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV.  Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer không đƣợc kiểm tra trước về độ đặc hiệu (tức là ngoài sản phẩm chính theo mong đợi thì nó còn có thể khuếch đại với các loài khác gây ức chế phản ứng PCR), ngoài ra còn phải kiểm tra có bao nhiêu vị trí trên genome mà primer có thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR.

 Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn).  Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ 5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cô và bạn bè).  Chú thích: có chạy kèm đối chứng dương của công ty Promega để kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.

Kết quả Thảo luận

Kết quả tiến trình RT – PCR .1 Kết quả kiểm tra RNA

+ Ở giếng 1 và giếng 2 chúng tôi tiến hành chạy sản phẩm cDNA, nhƣng không cho bất kỳ kết quả nào. Điều này có thể giải thích: bước reverse transcription để chuyển RNA thành cDNA với tổng thể tớch là 20àl nhƣng chỉ chứa 2àl RNA tổng số, rồi từ 20àl cDNA đú ta chỉ hỳt 4àl để chạy điện di. Nhƣ vậy cú thể hàm lƣợng cDNA quá thấp chƣa tới ngƣỡng phát hiện, do đó không thể phát hiện khi nhuộm với ethidium bromide và chụp dưới tia UV.

Điều này có thể kết luận là quá trình ly trích không thành công hoặc lƣợng RNA quá ít không thể phát hiện đƣợc.  Chỉ có một vị trí gắn duy nhất trên gen đích và không hề có vị trí gắn nào khác trên sợi bổ sung.  Genome L (long) của virút TSWV không có đuôi polyA, nhƣ vậy sẽ rất khó khăn trong việc tổng hợp cDNA.

Việc tổng hợp cDNA chủ yếu dựa vào các primer (mồi) ngẫu nhiên là các đoạn 6 nucleotide.  Việc tổng hợp cDNA bằng các primer nhẫu nhiên đôi khi không cho kết quả là những sản phẩm có chứa đoạn gen cần khuếch đại. Điều này có thể dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đôi khi là rất thấp hoặc không có.

Sau khi chạy RT – PCR một bước có kèm đối chứng dương thì chỉ có đối chứng cho sản phẩm chỉ một băng duy nhất còn mẫu bệnh ly trích thì không cho kết quả dương tính. Tới đây chúng tôi mới đề xuất phương án để khắc phục hiện tượng số lƣợng RNA khuôn mẫu quá ít là làm sao phải thiết kế đƣợc một cặp primer nữa, cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer hiện đang dùng, mục đích là để chạy Nested PCR. Bước chẩn đoán virút TSWV bằng phương pháp ELISA cho kết quả dương tính rất yếu, điều này có thể do lượng virút nhiễm (RNA khuôn mẫu) rất thấp, khó có thể phát hiện bằng PCR với một cặp Primer.

Để đảm bảo sản phẩm PCR sau cùng không thay đổi về kích thước, chúng tôi tiến hành thiết kế một cặp primer mới (ứng dụng phần mềm PCGEN), cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer cũ. Như vậy qua bước PCR thứ nhất với cặp primer mới sẽ tạo ra sản phẩm có kích thước lớn hơn sản phẩm mong đợi. Từ đây ta trích ra một thể tích để chạy tiếp PCR với cặp primer cũ và có thể thu đƣợc sản phẩm PCR với kích thước mong đợi.