Đề tài Phương pháp Microarrays

Đề tài Phương pháp MicroarraysSiminar :Microarrays Thành viên nhóm: Phan Minh TiếnNguyễn Minh ThiệnNguyễn Thị PhưởngPhan Thị Phương Thanh Đặng Thành Sang Võ Đình Trung Trừ một vài ngoạ

Đề tài Phương pháp Microarrays

Siminar :Microarrays

Thành viên nhóm:

Phan Minh TiếnNguyễn Minh ThiệnNguyễn Thị PhưởngPhan Thị Phương Thanh Đặng Thành Sang

Võ Đình Trung

Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sư biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp

microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người

NỘI DUNG:

I GIỚI THIỆU LỊCH SỬ CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROARRAYS

II KHÁI NIỆM VỀ MICROARRAYS

III CẤU TẠO ,PHÂN LOẠI MICROARRAY

IV KỸ THUẬT CHẾ TẠO MICROARRAY

V NGUYÊN LÝ

VI CÁCH TIẾN HÀNH

VII ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT MICROARRAYS

VIII TRIỂN VỌNG CỦA KỸ THUẬT MICROARRAYS

I GIỚI THIỆU LỊCH SỬ CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROARRAYS :

Hình 1: lịch sử phát triển mỉcoarray

Kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và

lai phân tử Điều này gợi ra cách phân tích mối liên hệ trình tự của axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng

Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai

in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979

Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa

ra Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu) Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991) Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu

Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu

Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với

kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay

II/.KHÁI NIỆM VỀ MICROARRAYS:

Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một

thí nghiệm giản đơn và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu

rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người

Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này

đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A Fodor phát minh Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở

Mỹ và thế giới Protein microarray mới chỉ bắt đầu được để ý trong khoảng vài năm trở lại đây

và chưa phổ biến như DNA microarray

III.CẤU TẠO,PHÂN LOẠI MICROARRAY:

1.Cấu tạo:

DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicon, trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất bằng kĩ thuật tự độâng tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự

Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng, có thể là

oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp)

các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy)

để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 µm

Hình 2: cấu tạo microarray

2.Phân loại

1 Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao ,vừa vừa.)

2 Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array….)

IV KỸ THUẬT CHẾ TẠO MICROARRAY:

1 Chế tạo mảng:

Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu

dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng

dữ liệu cao Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine,

amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò

Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở

dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể

là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120

nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp)

Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide) Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ

- In kim (Contact-tip deposition printing):

Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA Đầu tiên người

ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình

▲Hình 3: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing

Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2

- In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing):

Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim Trong đó, dùng “con dấu”

polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 4) Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao

§

▲Hình 4: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing

- In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network):

µFN là kỹ thuật µCP cải tiến Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 5)

mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4 Trên cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hoá (Hình 6)

▲Hình 6: In mạ

Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các

oligonucleotide đã biotin hoá Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 7) Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền

chạy giữa điện

cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông (C) Vùng điện cực

- In quang hoạt (Photolithography):

Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp

oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn nạ

để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt

những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 8) Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác định trên cơ chất Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm

- In áp điện (Piezoelectric printing);

In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 9) Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2

Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 10)

▲Hình 8: Sơ đồ

phương pháp in quang

hoạt §

▲Hình 9: Sơ đồ ống

phun áp điện Đơn vị sử

dụng trong hình.|U|: giá

trị tuyệt đối của điện áp

- In vi lỏng (µWP - Micro wet printing);

Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách

đi kết thúc một chu kỳ (hình 10) Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và

vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể

pháp phát hiện mẫu lai

Gen được gắn vào lam

kính hiển vi (đĩa microarray)

cho biến tính để được DNA ở

dạng mạch đơn Mỗi đĩa

microarray được gắn từ hàng

ngàn đến hàng chục ngàn

gen Tách mRNA ở các mô,tế

bào đặc thù và được đánh dấu

bằng các chất có khả năng phát

huỳnh quang.Tiến hành lai giữa

hỗn hợp mRNA trên với các gen trên đĩa microarray

Sau phản ứng lai ,tiến hành rửa sạch các mRNA không lai ,quan sát vị trí lai nhờ sự phát hiện huỳnh quang dưới kính hiển vi huỳnh quang

Dựa vào kết quả lai sẽ phát hiện được mRNA của gen đang hoạt động và những gen ở

trạng thái không hoạt động.

Trộn chung các mRNA của các loại mẫu và cho tiến hành lai acid nucleic trên đĩa microarray

Phát hiện phản ứng lai nhờ phản ứng huỳnh quang và ghi lại trên phim ảnh

Sử dụng các chương trình phần mềm chuyên dụng để xác định sự biểu hiện của các gen

ở các mẫu phân tích

Hình 12: các bước tiến hành microarray

Mẫu để lai (đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm

vàng/bạc Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất

Xác định và phân tích tín hiệu lai:

Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 13) Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác

Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng

chứa mẫu dò cDNA:

Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau Mỗi mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 14) Sau khi lai, tỷ

lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu

Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối chứng cho mỗi phiến kính (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây

ra hiện tượng lai chéo (iii) Khôngphân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ) Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu (v) Không có khả năng định lượng (vi) Cần lượng lớn đích

Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự (iii) Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu (iv) Tính đặc hiệu cao

Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có

thể so sánh hiệu quả (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần (iii) Có khả năng định lượng (iv) Cần lượng nhỏ đích (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một array (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot

Các microarray này chứa hàng trăm mẫu dò oligonucleotide, mỗi mẫu dò đại diện cho các chủng/loài/giống

vi sinh vật khác nhau cho phép phát hiện nhanh với hiệu suất cao nhiều vi sinh vật từ hầu như bất cứ loại mẫu nào Khả năng sử dụng các mảng chuẩn đoán vi sinh vật bao phủ hầu như toàn bộ các lĩnh vực khoa học sự sống bao gồm các chuẩn đoán người, thú y, thực vật và động vật, vi sinh môi trường, kiểm tra chất lượng nước…Có thể xác định vi sinh vật gây bệnh cho người từ các mẫu thử nghiệm một cách hoàn hảo với khả năng thiết kế mảng xác định nhanh, không qua nuôi cấy, chỉ trong vài giờ và hầu như bảo trì được thông tin tự nhiên của nó (chẳng hạn:Với một giọt máu của người bệnh, bác sĩ chỉ cần 6 đến 8 tiếng đồng hồ là có thể xác định được 80% của 55 loại vi trùng Hiện nay muốn tìm vi trùng gây bệnh người ta lấy nước tiểu, phân hay máu của bệnh nhân và gởi đến các phòng xác nghiệm Bệnh nhân thường phải đợi nhiều ngày cho đến khi nhận được thuốc hay các biện pháp chữa trị)

Cũng có thể dùng microarray để phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, vi sinh vật gây bệnh cho động, thực vật trên quy mô lớn Ngoài ra còn có thể sử dụng để nghiên cứu mức đa dạng vi sinh vật đất đối với tính chống chịu

và độ màu mỡ của đất cũng như biến thiên độ đa dạng theo hoạt động nông nghiệp

Bảng 1: Các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong xác định vi sinh vật

§

b Đánh giá phân bố gene chức năng trong môi trường tự nhiên

Gene mã hoá các enzyme chức năng trong chu trình sinh địa hoá học (như C, S, N, các kim loại) là dấu hiệu rất hữu ích để giám sát trạng thái sinh lý và hoạt tính chức năng của các quần thể và quần xã vi sinh vật trong môi trường tự nhiên.