Đề tai Phương pháp phổ hồng ngoại và ứng dụng trong thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH -((((( - VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM MÔN: PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đề Tài: PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỤC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh MỤC LỤC A B I II Lời mở đầu NỘI DUNG NGUỒN GỐC CỦA BỨC XẠ HỒNG NGOẠI: ĐẠI CƯƠNG VỀ PHỔ HỒNG NGOẠI: 2.1 Điều kiện hấp thụ xạ hồng ngoại: 4 5 2.2 Sự quay phân tử phổ quay: 2.3 Phổ dao động quay phân tử hai nguyên tử: 2.4 Phổ dao động quay phân tử nhiều nguyên tử: 12 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tần số đặc trưng nhóm: 17 2.5.1 Ảnh hưởng cấu trúc phân tử : 17 2.5.2 Ảnh hưởng tương tác phân tử: 18 2.6 Cường độ hình dạng vân phổ hồng ngoại: 19 2.7 Các vân phổ hồng ngoại không bản: 20 III HẤP THU HỒNG NGOẠI CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÀ VÔ CƠ 21 3.1 Tần số hấp thu hydrocarbon: 21 3.2 Tần số hấp thu Alcohol phenol: 26 3.3 Tần số hấp thu ether, epoxide peroxide: 28 3.4 Tần số hấp thu hợp chất carbonyl: 29 3.5 Tần số hấp thu hợp chất Nitrogen: 33 3.6 Tần số hấp thu hợp chất chứa phosphor: 35 3.7 Tần số hấp thu hợp chất chứa lưu huỳnh: 36 3.8 Tần số hấp thu hợp chất chứa nối đôi liền nhau: 36 3.9 Tần số hấp thu hợp chất chứa halogenur: 37 IV KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI: 38 4.1 Máy quang phổ IR: 38 4.2 Cách chuẩn bị mẫu: 40 4.3 Ứng dụng: 41 4.3.1 Đồng chất: 41 4.3.2 Xác định cấu trúc phân tử: 42 4.3.3 Nghiên cứu động học phản ứng: 42 4.3.4 Nhận biết chất: 42 4.3.5 Xác định độ tinh khiết: 42 4.3.6 Suy đoán tính đối xứng phân tử: 43 4.3.7 Phân tích định lượng: 43 V ỨNG DỤNG PHỔ HỒNG NGOẠI TRONG THỰC PHẨM: 44 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH 45 5.1 Nước: 45 5.2 Protein : 45 5.3 Lipid: 46 5.4 Glucid: 46 5.5 Chất xơ : 47 5.6 số ứng dụng khác: 47 VI NHỮNG LOẠI MÁY QUANG PHỔ TRÊN THỊ TRƯỜNG HIỆN NAY: 48 6.1 Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier: 48 6.2 Máy quang phổ hồng ngoại gần (FT-NIR): C KẾT LUẬN D TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 50 51 A Lời mở đầầu Hóa học phân tích phần khoa học hóa học, phân tích thực phẩm môn thuộc phân tích mẫu, đặc biệt mẫu thực phẩm cho phép ta xác định nhanh chóng mẫu phân tích chứa hàm lượng nhỏ với độ xác cao Để phân tích thực phẩm ngày người ta sử dụng nhiều phương pháp như: phân tích sắc ký, phương pháp điện thế, phương pháp quang…Trong phương pháp quang phương pháp sử dụng phổ biến kỹ thuật coi tốt không sử dụng hoá chất, không ảnh hưởng sức khoẻ an toàn cho người phân tích Một phương pháp quang sử dụng phổ hồng ngoại phương pháp quang phổ hấp thu phân tử Phổ hồng ngoại sử dụng rộng rãi kỹ thuật phân tích hiệu trải qua ba thập kỷ qua Một ưu điểm quan trọng phương pháp phổ hồng ngoại vượt phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử, phương pháp quang vv…) phương pháp cung cấp thông tin cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi phương pháp tính toán phức tạp Kỹ thuật dựa hiệu ứng đơn giản là: hợp chấp hoá học có khả hấp thụ chọn lọc xạ hồng ngoại Sau hấp thụ xạ hồng ngoại, phân tử hơp chất hoá học dao động với nhều vận tốc dao động xuất dải phổ hấp thụ gọi phổ hấp thụ xạ hồng ngoại Được ứng dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác Y học, Hóa Học, Thực phẩm,…nghiên cứu cấu trúc hợp chất vô cơ, hữu cơ, phức chất thực tế sản xuất Đặc biệt lĩnh vực thực phẩm phổ biến người ta sử dụng phổ hồng ngoại để phân tích dư lượng axit amin protein, đánh giá chất lượng chất béo, protein thành phần sản phẩm sữa hạt Phân biệt bột cá, bột thịt, bột đậu nành có mẫu Phân tích thành phần hóa học sản phẩm thực phẩm phomat, ngũ cốc, bánh kẹo, thịt bò… Nhằm có nhìn tổng quát phương pháp phân tích cung cấp cho công cụ hữu hiệu học tập nghiên cứu môn phân tích thực phẩm nên nhóm chọn đề tài: “Phương pháp phổ hồng ngoại ứng dụng thực phẩm” để tìm hiểu nguyên tắc phân tích nhờ phổ hồng ngoại ứng dụng kỹ thuật phân tích hàm lượng chất Để hoàn thành tốt tiểu luận này, nhóm em chân thành cảm ơn nhà trường tạo điều kiện sở vật chất cho nhóm làm việc, thầy Nguyễn Khắc Kiệm dẫn cung cấp tài liệu phương pháp làm cho nhóm Tuy cố gắng tránh khỏi sai sót nội dung hình thức Rất mong nhận ý kiến đóng góp chân thành từ cô bạn! B NỘI DUNG I NGUỒN GỐC CỦA BỨC XẠ HỒNG NGOẠI: Năm 1800, William Hershel phát tồn xạ nhiệt vùng phổ ánh sáng nhìn thấy ông đặt tên cho xạ hồng ngoại (Infrared - IR) Đây dải xạ không nhìn thấy có bước sóng từ 0,75 đến 1000 nm ông chứng minh xạ tuân theo qui luật ánh sáng nhìn thấy Kể từ mốc lịch sử đến nay, lĩnh vực nhân loại đạt bước phát triển đáng kể Về nguồn phát xạ: Vào nửa đầu kỷ 19 tìm định luật xạ nhiệt, đầu kỷ 20 hoàn thành qui luật xạ không kết hợp Trong năm 1920-1930 tạo nguồn IR nhân tạo, phát hiệu ứng điện phát quang làm sở để tạo nguồn phát xạ IR (các diodes phát quang) Về detectors (dùng để phát IR): Năm 1830 detectors theo nguyên lý cặp nhiệt điện (thermopile) đời Năm 1880 đời quang trở cho phép tăng đáng kể độ nhạy phát IR Từ năm 1870 đến 1920, detectors lượng tử theo nguyên lý tương tác xạ với vật liệu đời (với detectors xạ chuyển đổi trực tiếp sang tín hiệu điện thông qua hiệu ứng nhiệt xạ sinh ra) Từ năm 1930-1944 phát triển detectors sulfure chì (PbS) phục vụ chủ yếu cho nhu cầu quân Từ năm 1930-1950 khai thác vùng IR từ đến mm detectors Antimonium d ’Indium (InSb) từ 1960 bắt đầu khai thác vùng IR từ đến 14 mm detectors Tellure de Cadmium Mercure (HgTeCd) Trên giới IR áp dụng nhiều lĩnh vực: Như ứng dụng chế tạo thiết bị quang điện tử đo lường - kiểm tra lĩnh vực thực phẩm, thiết bị chẩn đoán điều trị y tế, hệ thống truyền thông, hệ thị mục tiêu thiên văn, điều khiển thiết bị vũ trụ năm gần đây, chúng sử dụng để thăm dò tài nguyên thiên nhiên trái đất hành tinh khác, để bảo vệ môi trường Đặc biệt, có ứng dụng quan trọng lĩnh vực quân Các ứng dụng quân IR đòi hỏi detectors phải có độ nhậy cao, đáp ứng nhanh, phải mở rộng dải phổ làm việc detectors dải truyền qua vật liệu quang học Cuối chiến tranh giới lần thứ hai nhờ ứng dụng IR người ta chế tạo bom quang - điện tự điều khiển, hệ thống điều khiển hỏa lực sở biến đổi quang - điện, thiết bị nhìn đêm cho vũ khí binh, điện đàm IR sau chiến lần thứ hai tạo nhiều hệ thống điều khiển tên lửa không đối không, không đối đất, đất đối không Ở nước ta nay, lĩnh vực số quan khoa học có Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ, tiếp cận, nghiên cứu từ cuối năm 60 kỷ 20 Và đặc biệt, phổ hồng ngoại ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm… II ĐẠI CƯƠNG VỀ PHỔ HỒNG NGOẠI: Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại kỹ thuật phân tích hiệu Một ưu điểm quan trọng phương pháp phổ hồng ngoại vượt phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử vv…) phương pháp cung cấp thông tin cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi phương pháp tính toán phức tạp Kỹ thuật dựa hiệu ứng đơn giản là: hợp chất hoá học có khả hấp thụ chọn lọc xạ hồng ngoại Sau hấp thụ xạ hồng ngoại, phân tử hợp chất hoá học dao động với nhiều vận tốc dao động xuất dải phổ hấp thụ gọi phổ hấp thụ xạ hồng ngoại Các đám phổ khác có mặt phổ hồng ngoại tương ứng với nhóm chức đặc trưng liên kết có phân tử hợp chất hoá học Bởi phổ hồng ngoại hợp chất hoá học coi "dấu vân tay", vào để nhận dạng chúng Phổ hấp thu hồng ngoại phổ dao động quay hấp thu xạ hồng ngoại chuyển động dao động chuyển động quay bị kích thích Bức xạ hồng ngoại có độ dài sóng từ 0,8 đến 1000µm chia thành ba vùng: 1- Cận hồng ngoại ( near infrared) λ = 0,8 – 2,5µm 2- Trung hồng ngoại ( medium infrared) λ = 2,5 – 50µm 3- Viễn hồng ngoại ( far infrared) λ = 50 - 100µm Trong thực tế, phổ hồng ngoại thường ghi với trục tung biểu diễn T%, trục hoành biểu diễn số sóng với trị số giảm dần ( 4000 – 400 cm-1) 2.1 Điều kiện hấp thụ xạ hồng ngoại: Không phải phần tử có khả hấp thụ xạ hồng ngoại Mặt khác thân hấp thụ có tính chất chọn lọc Để phần tử hấp thụ xạ hồng ngoại, phân tử phải đáp ứng yêu cầu sau: * Độ dài sóng xác xạ: Một phân tử hấp thụ xạ hồng ngoại tần số dao động tự nhiên phần phân tử (tức nguyên tử hay nhóm nguyên tử tạo thành phân tử đó) dao động tần số xạ tới Ví dụ: Tần số dao động tự nhiên phân tử HCl 8,7.1013s-1 13 8,7 x10   10 2890cm 3.10 1 Ứng với: Thực nghiệm cho thấy cho xạ hồng ngoại chiếu qua mẫu HCl phân tích xạ truyền qua quang phổ kế hồng ngoại, người ta nhận thấy phần xạ có tần số 8,7.1013s-1 bị hấp thụ, tần số khác truyền qua Vậy tần số 8,7.1013s-1 tần số đặc trưng cho phân tử HCl Sau hấp thụ bước sóng xác xạ hồng ngoại (năng lượng xạ hồng ngoại bị tiêu tốn) phân tử dao động có biên độ tăng lên Điều kiện áp dụng chặt chẽ cho phân tử thực chuyển động dao động điều hoà * Lưỡng cực điện: Một phân tử hấp thụ xạ hồng ngoại hấp thụ gây nên biến thiên momen lưỡng cực chúng Một phân tử gọi có lưỡng cực điện nguyên tử thành phần có điện tích (+) điện tích (-) rõ rệt Khi phân tử lưỡng cực giữ điện trường (như phân tử giữ dòng IR), điện trường tác dụng lực lên điện tích phân tử Các điện tích ngược chịu lực theo chiều ngược nhau, điều dẫn đến tách biệt hai cực tăng giảm.Vì điện trường xạ hồng ngoại làm thay đổi độ phân cực chúng cách tuần hoàn, khoảng cách nguyên tử tích điện phân tử thay đổi cách tuần hoàn Khi nguyên tử tích điện dao động, chúng hấp thụ xạ hồng ngoại Nếu vận tốc dao động nguyên tử tích điện phân tử lớn, hấp thụ xạ mạnh có đám phổ hấp thụ mạnh, ngược lại vận tốc dao động nguyên tử tích điện phân tử nhỏ, đám phổ hấp thụ hồng ngoại yếu.Theo điều kiện phần tử có nguyên tử giống không xuất phổ dao động Ví dụ O2, N2 v.v… không xuất phổ hấp thụ hồng ngoại Đó điều may mắn, không người ta phải đuổi hết không khí khỏi máy quang phổ kế hồng ngoại Tuy nhiên không khí có CO2 nước (H2O) có khả hấp thụ tia hồng ngoại điều bù trừ thiết bị thích hợp 2.2 Sự quay phân tử phổ quay: Xét phân tử AB tạo thành từ hai nguyên tử A B có khối lượng m1 m2, xem khối lượng m1 m2 đặt tâm hai hạt nhân với khoảng cách hai nhân r0 Hai nguyên tử xem nối cứng vào gọi “ quay tử cứng” Dưới dạng quay tử cứng, phân tử có khả quay xung quang trục qua trọng tâm hệ, cách tâm hạt nhân khoảng r1 r2 Hình 1: Mô hình quay tử cứng phân tử hai nguyên tử Momen quán tính I quay tử xác định: mm (1) I m1r12  m2 r22  ro2 ro2 m1  m2 µ gọi khối lượng rút gọn phân tử: 1m m (2)   1 m22 m11  m Sự quay quay tử cứng  m xem tương đương với quay khối lượng rút gọn µ đặt cách trục quay khoảng r0 Theo học lượng tử, lượng chuyển động quay phân tử hai nguyên tử xác định biểu thức: (3) h2 Eq  J ( J  1) 8 I J số lượng tử quay, có giá trị không nguyên dương ( J= 0,1,2,3…) Đại lượng (h/8π2I) gọi số quay kí hiệu B Biểu thức (3) trở thành: Eq hBJ ( J  1) (4) Hệ thức (4) cho thấy lượng quay tỉ lệ nghịch với momen quán tính I mức lượng quay ứng với J lớn cách xa nhau: J J(J+1) Eq hBJ ( J  1) 1 2hB 6hB 12 12hB 20 20hB 30 30hB Một số mức lượng quay thấp phân tử hai nguyên tử chuyển dịch cho phép đựơc trình bày hình 2a sau: Hình 2: a Một số mức quay thấp phân tử hai nguyên tử chuyển dịch phép chúng b Sơ đồ phổ quay với chuyển mức  Phổ quay phân tử phát sinh chuyển dịch mức lượng quay Đối với quang phổ quay tuý phân tử hai nguyên tử, chuyển dịch tuân theo qui tắc chọn lọc: J 1 (+1: hấp thu, -1: phát xạ) Theo mô hình cứng, phổ quay phân tử hai nguyên tử dãy vạch với tần số: 2B (01); 4B( 12) ; 6B( 23)… Người ta thu phổ quay phân tử dùng xạ hồng ngoại xa vi sóng tác động lên mẫu khảo sát Các phổ quay giúp nhận dạng chất cho phép xác định khoảng cách hạt nhân nguyên tử góc liên kết phân tử đơn giản, momen lưỡng cực điện nhiều phân tử… Phổ vi sóng cho độ xác cao nhiều so với phổ hồng ngoại xa, việc nghiên cứu vùng phổ vi sóng gặp phải hai hạn chế: Thứ nhất, mẫu phải chuyển thành trạng thái khí với áp suất không 10 mmHg -3 Thứ hai, để hấp thu xạ vi sóng, phân tử phải có momen lưỡng cực trạng thái bản, quay tự không tạo momen lưỡng cực Để nghiên cứu phân tử momen lưỡng cực O2, N2… người ta dùng phổ quay khuyếch tán tổ hợp Các phổ quay thực nghiệm cho thấy khoảng cách (2B, 4B…) vạch không hoàn toàn nhau, phân tử quay khoảng cách hai nguyên tử dao động cách xa không cố định giả thiết tính toán 2.3 Phổ dao động quay phân tử hai nguyên tử: Sự xuất quang phổ dao động: Dao động phân tử gồm hai nguyên tử dao động giãn nén dọc theo trục liên kết hai nguyên tử, gọi dao động giãn (stretching) hay dao động hoá trị Kết dao động làm thay đổi độ dài liên kết nguyên tử phân tử Trước hết xét trường hợp phân tử AB tạo thành từ hai nguyên tử A B A B xem hai cầu khối lượng mA, mB nối với lò xo Khoảng cách tâm A tâm B vị trí cân r Nếu giữ chặt cầu ép lại bỏ tay cầu thứ hai dao động quanh vị trí cân ban đầu với độ lệch ∆r Trong hệ xuất lực luôn có khuynh hướng kéo chúng vị trí cân gọi lực hồi phục, kí hiệu F ﾧﾧ Bài toán dao động đưa trường hợp toán tính dao động điểm động điểm tĩnh (được gọi hệ dao động tử) xảy với biên độ dao động không đổi (dao động điều hoà) biên độ dao động thay đổi (dao động không điều hoà) Dao động điều hoà: Trong trường hợp này, lực hồi phục F tỉ lệ với biên độ ∆r: F = - k∆r (5) k - hệ số tỉ lệ, gọi số lực hay số lực hoá trị ; dấu trừ cho biết lực F hưóng ngược với chiều chuyển động Thực trình tính toán theo học, người ta chứng minh dao động điều hoà có tần số dao động vdđ xác định sau: vdđ  Với µ khối lượng thu gọn hai cầu nối 2 k (6)  Biểu thức cho thấy dao động có tần số cao số lực liên kết k lớn khới lượng thu gọn µ nhỏ Khi đồng dao động tự nhiên phân tủ gồm hai nguyên tử theo mô hình hai cầu nói trên, biểu thức (6) trở thành: vm  2 k  Trong đó: vm - tần số dao động tự nhiên phân tử k - lực liên kết hai nguyên tử µ - khối lượng thu gọn phân tử Mặt khác dao động tử thực dao động, tác dụng lực hồi phục F Er: F  Er  kr  k (r  ro ) dr E R  k (r  ro )  EO (7) suy ra: (8) Với: Er - hệ ứng với chuyển dịch khỏi vị trí cân E0 - hệ ứng với vị trí cân ( tức r = r 0), cực tiểu hệ Biểu thức (8) giúp ta hình dung đồ thị biểu diễn phụ thuộc phân tử hai nguyên tử dao động điều hoà vào khoảng cách r hai nguyên tử Đó parabol có trục đối xứng đường thẳng đứng qua điểm cực tiểu Ở trạng thái dao động, khoảng cách r hai nguyên tử thay đổi xung quanh giá trị ro từ giá trị cực đại rmax đến giá trị cực tiểu rmin Ở hai giá trị giới hạn Er hệ lượng toàn phần dao động E dđ Theo học lượng tử, lượng toàn phần Edđ nhận dãy giá trị gián đoạn: Hình3: a) Đường cong mức lượng dao động phân tử hai nguyên tử dao động điều hoà b) Phổ dao động trường hợp dao động điều hoà 10 –N+–O– béo VCN 970-950(m) Mạnh 3.6 Tần số hấp thu hợp chất chứa phosphor: Bảng 19: Tần số hấp thu đặc trưng hợp chất chứa phosphor Nhóm – P– H P=O P– OH P– O– P P– O– C P– O– C Dao động VP-H δP-H(nmp) δP-H(nmp) VP=O VP=O Tần số(cm-1) 2440-2350(m) 1090-1080 940-909 1150 1190 1299-1250 1040-910 1000-870 1050-970 1260-1160 Ghi Nhọn Phorus oxide thẳng Phorus oxide thơm Phosphoric ester Rộng P-O-C thẳng P-O-C thơm 3.7 Tần số hấp thu hợp chất chứa lưu huỳnh: Bảng 20: Tần số hấp thu đặc trưng hợp chất chứa chứa lưu huỳnh Nhóm – S– H (của imine) >C=S – CS– NH– (Thioamide) >S=O >SO2 – SO2– O Dao động VS-H Tần số(cm-1) 2600-2550 (y) VC=S VN-H VC=S δN-H VS=O VS=O 1200-1050 3400 1300-1100 (m) 1550-1460 (m) 1060-1040 (m) 1370-1310 (m) 1180-1120 (m) 1420-1330 (m) 1200-1145 (m) Ghi Yếu VO-H bị ảnh hưởng liên kết hydrogen 3150 cm-1 thể rắn DĐ hóa trị bất đối xứng DĐ hóa trị đối xứng 3.8 Tần số hấp thu hợp chất chứa nối đôi liền nhau: Bảng 21: Tần số hấp thu đặc trưng số hợp chất chứa nối đôi liền 34 Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi O=C=O Carbon dioxide – N=C=O Isocyanate 2349 (m) 2275-2250 (m) – N=N=N– Azit 2160-2120 (m) – N=C=N– Carbodilmide >C=C=O Cetene – N=C=S– Isothiocyanate 2125-2130 (m) 2150 (m) Rất mạnh 2140-1990 (m) Vân rộng mạnh >C=C=NCeteneimine C=C=C Allen 2000 (m) 1950 (tb) Rất mạnh; Vị trí không bị ảnh hưởng liên hợp Nhóm allen đầu mạch liên hợp với nhóm hút electron thường có hai vân 3.9 Tần số hấp thu hợp chất chứa halogenur: Bảng 22: Tần số hấp thu đặc trưng số hợp chất chứa halogenur Nhóm Dao động Tần số(cm-1) C– F VC-F CF2,CF3 – C– C– Cl VC-F VC-Cl 1400-730: 1100-1000 1350-1120 830-560: VC-C δC-F 726 649 760-505 (m) CCl3 VC-Cl 450-250 830-700 CH2– Cl C– Br δCH2 VC-Br δC-Br 1230 (m) 650-485 (m) 300-140 35 Ghi Monofluoralkane Thay đổi theo vị trí không gian halogenur phân tử Dạng trans ziczac C-C-C-Cl Dạng “Gốt” Rất mạnh; có mũi họa tần khoảng 1510-1450 cm-1 C– I VC-I CH2– I CH2– CH2– I Aryl- δCH2 halogen IV VC-F VC-Cl (para) VC-Cl (meta) VC-Cl (ortho) VC-Br (para) VC- Br (meta) VC- Br (ortho) VC-I (para) 600-200 610-485 1170 (m) 594 503 1270-1100 1096-1089 1078-1074 1057-1034 1073-1068 1073-1065 1042-1028 1061-1057 Mạch thẳng Hai vân KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI: 4.1 Máy quang phổ IR: Phổ kế hồng ngoại thông dụng loại tự ghi, hoạt động theo nguyên tắc sau: Chùm tia hồng ngoại phát từ nguồn tách hai phần, qua mẫu (2) qua môi trường đo (dung môi) (2’) tạo đơn sắc (3) tách thành xạ có tần số khác chuyển đến detector (4) Detector so sánh cường độ hai chùm tia chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỉ lệ với phần xạ bị hấp thu mẫu Dòng điện có cường độ nhỏ nên phải nhờ khuếch đại (5) tăng lên nhiều lần trước chuyển sang phận tự ghi (6) vẽ lên phổ đưa vào máy tính xử lý số liệu in phổ Hình 6: Sơ đồ nguyên lý máy phổ hồng ngoại hai chùm tia Các máy phổ hồng ngoại hệ chế tạo theo kiểu biến đổi Fourier (Fourier Transformation Infrared Spectrometer-FTIR Spectrometer) Trong máy này, người ta dùng giao thoa (giao thiết kế) Michelson thay cho tạo đơn sắc 36 Giao thoa kế Michelson thiết bị tách chùm xạ thành hai thành phần có cường độ sau kết hợp trở lại thành xạ có cường độ thay đổi theo thời gian Sự thay đổi cường độ xạ quãng đường hai xạ bị tách không giống Giá trị I(t) hàm hiệu số hai quãng đường nói Giao thoa kế gồm gương cố định Mı, gương di động M2 (có thể di chuyển tịnh tiến đường thẳng nằm ngang) đặt vuông góc phận chia chùm sáng S Chùm xạ từ nguồn qua phận tách S chia thành hai chùm xạ vuông góc, chùm đến gương cố định Mı chùm đến gương cố định M2 Khi gặp gương chúng phản xạ trở lại phận tách S Đến chùm lại chia thành đôi, nửa nguồn nửa qua mẫu đo đến detector Như vậy, chùm xạ đến mẫu đo gồm hai xạ nhập lại có thời gian trễ khác nên cường độ xạ thay đổi theo thời gian, phụ thuộc vào quãng đường d xạ đến gương di động M2 (H.7) Hình 11.7 Cấu tạo giao thoa kế Michelson Detector ghi nhận biến đổi cường độ xạ theo quãng đường d chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu thu dạng hàm điện V theo quãng đường V=f(d), máy tính dùng phép biến đổi Fourier chuyển thành hàm cường độ I theo nghịch đảo quãng đường d ( tức d-1 hay số sóng v) : V = f(d)→I = f(v) So với máy hồng ngoại hệ cũ, máy hồng ngoại biến đổi Fourier (H.11.8) có nhiều ưu điểm: việc sử dụng giao thoa kế cho phép khe sáng rộng nên cường độ xạ vào detector lớn hơn; tỉ lệ S/N tăng lên nhờ giảm nhiễu; nhờ sử dụng máy tính, việc đo phổ tự động hoá mức cao phổ lưu trữ đối chiếu với phổ chuẩn có “thư viện” máy 37 Hình 8: Sơ đồ nguyên lý máy phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Trong trình làm việc, khung số sóng máy phổ hồng ngoại bị lệch Để kiểm tra, người ta thường sử dụng chất chuẩn polystirene, ammonia nước 4.2 Cách chuẩn bị mẫu: Người ta đo phổ hồng ngoại chất thể rắn, thể lỏng tinh khiết, DD thể Mẫu thể rắn: Có ba cách đo mẫu thể rắn: Nghiền nhỏ vài mg chất nghiên cứu với vài giọt parafin lỏng (nujol) ép phần thu hai NaCl Để tránh vân hấp thu mạnh parafin 29502850 cm -1 1450-1350 cm -1 khảo sát hấp thu nhóm C-H, người ta thay parafin hexachlor butadien Trộn mẫu thật đồng với KBr theo tỉ lệ 1:10 1:100 ép thành viên mỏng suốt máy ép thuỷ lực Do KBr có tính hút ẩm, phổ hồng ngoại thường xuất vân hấp thu nước 3450 cm -1 Dùng KBr cầu lưu ý đến khả xảy phản ứng trao đổi cation anion trường hợp chất nghiên cứu muối phức chất vô Đo phổ chất rắn dạng màng lỏng cách làm nóng chảy chất nghiên cứu làm bay dung môi DD chất nghiên cứu chất có khả tạo màng Mẫu thể lỏng tinh khiết: Khi mẫu thể lỏng tinh khiết, người ta chuẩn bị mẫu cách ép giọt nhỏ chất lỏng hai NaCl để có màng mỏng dày khoảng 0,01-0,1mm, gọi màng lỏng Mẫu DD: Hoà tan chất nghiên cứu dung môi thành DD có nồng độ 1-5% Cho DD dung môi nguyên chất vào hai cuvet có bề dày 0,1-1mm việc so sánh hai chùm tia qua DD dung môi loại vân hấp thu dung môi Dung môi không phép hấp thu 65% xạ chiếu vào cường độ xạ lại yếu Ngoài ảnh hưởng chất dung môi, cần lưu ý đến bề dày cuvet Những dung môi thường sử dụng CCl4, CHCl3, CH2Cl2, Cl2C=CCl2… Mặc dù vùng không hấp thu CHCl3 hẹp CCl4 khả hoà tan chất CHCl3 tốt nên thường sử dụng nhiều hơn, đặc biệt đo DD đặc cuvet có bề dày nhỏ Các cuvet thường có cửa sổ NaCl, CaF2 AgCl cửa sổ bị đen sau thời gian sử dụng Mẫu thể hơi: 38 Khi mẫu thể hơi, đưa vào ống đặc biệt có chiều dài khoảng 10 cm với hai đầu ống bịt NaCl Trong thực tế để phân tích chất hữu phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại ghép với máy sắc kí khí Trong hệ thống sắc kí khí-hồng ngoại (GC/IR), sau tách máy sắc kí khí, hợp phần từ cột sắc kí (tương ứng với peak sắc kí đồ) ghi phổ hồng ngoại (thường dùng FTIR) lưu giữ nhớ máy tính Máy in phổ đồ hồng ngoại hợp phần ứng với peak sắc kí đồ mà ta quan tâm Nhờ so sánh phổ mẫu với thư viện phổ chuẩn lưu máy tính, máy rõ cấu tạo hợp chuẩn cho biết nhóm chức có mặt hợp phần 4.3 Ứng dụng: Các số liệu ghi nhận từ phổ hồng ngoại cung cấp nhiều thông tin chất nghiên cứu Dưới số ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại 4.3.1 Đồng chất: Số liệu hồng ngoại đặc trưng sử dụng cho trình đồng chất hữu hiệu Từ đồng phổ hồng ngoại hai mẫu hợp chất kết luận đồng chất hai mẫu hồng ngoại với mức độ xác cao Để thực trình đồng nhất, người ta thường so sánh phổ chất nghiên cứu với phổ chuẩn ghi điều kiện xác định (hiện người ta thành lập phổ chuẩn hàng ngàn hợp chất hữu khác gọi Atlas phổ hồng ngoại) Nếu chất nghiên cứu chưa có Atlas, người ta so sánh phổ chất chuẩn theo ba giai đoạn sau đây: So sánh phổ hai chất nồng độ hai môi trường khác hai trạng thái khác ( ví dụ, DD viên nén) Ghi phổ chất nồng độ đủ lớn để so sánh vân có cường độ thấp So sánh cường độ vân tương ứng với 4.3.2 Xác định cấu trúc phân tử: Từ tần số vân phổ hấp thu cho phép kết luận có mặt nhóm chức phân tử, nghĩa số liệu hồng ngoại giúp xác định cấu trúc phân tử chất nghiên cứu Mức độ xác việc xác định cấu trúc phụ thuộc lớn vào độ tin cậy, xác tần số vân hấp thu phổ hồng ngoại (các máy hồng ngoại thường hiệu chỉnh tần số chất chuẩn polytyrol) Ngoài việc đề phòng sai lệch vị trí vân phổ máy, tiến hành định tính phương pháp cần lưu ý đến hiệu ứng khả làm dịch chuyển phổ vùng khác phải loại trừ vân hấp thu dung môi… 4.3.3 Nghiên cứu động học phản ứng: Việc nghiên cứu động học phản ứng có thề kiểm tra phương pháp phổ hồng ngoại cách ghi phổ hấp thu ứng với miền phổ 39 khoảng thời gian thích hợp, nghĩa ghi trực tiếp đường cong biểu diễn thay đổi cường độ hấp thu theo thời gian miền phổ chọn tạo thành sản phẩm phản ứng hay đk tác chất ban đầu 4.3.4 Nhận biết chất: Trước ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta có nhiều thông tin hợp chất hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngoài, độ tan, điểm nóng chảy, điểm cháy, đặc biệt lịch sử mẫu Nếu cần biết mẫu chất nguyên chất hay hỗn hợp Sau ghi phổ hồng ngại, chất nghiên cứu hợp chất hữu trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hai Sau nghiên cứu vùng tần số nhóm để xác định có hay nhóm chức Trong nhiều trường hựp việc đọc phổ (giải phổ) tìm tần số đặc trưng không đủ để nhận biết cách toàn diện chất nghiên cứu, có lẽ suy đoán kiểu loại hợp chất.Cũng cần tránh khuynh hướng cố gắng giải gán cho đám phổ quan sát thấy, đám phổ vừa yếu vùng phổ phức tạp Mỗi phát loại chất, người ta so sánh phổ chất nghiên cứu với phổ chất nguyên chất tương ứng để nhận định đúng.Hiện người ta công bố số tuyển tập phổ hồng ngoại chất tần số nhóm đặc trưng 4.3.5 Xác định độ tinh khiết: Phổ hồng ngoại dùng để xác định độ tinh khiết chất Khi thích hợp chất không tinh khiết thường độ rõ nét đám phổ riêng biệt bị giảm, xuất thêm đám phổ làm "nhoè" phổ Khi tạp chất có hấp thụ mạnh IR mà thành phần không hấp thụ hấp thụ yếu việc xác định thuân lợi Ví dụ nhận lượng nhỏ xeton hidrocacbon hidrocacbon thực tế không hấp thụ vùng phổ - 1720cm-1 số sóng đặc trưng cho nhóm C = O Phương pháp thường dùng để kiểm tra sản xuất nhiều loại hoá chất quy mô công nghiệp 4.3.6 Suy đoán tính đối xứng phân tử: Ví dụ xét xem phân tử NO2 phân tử gồm nguyên tử thẳng hàng hay có cấu tạo uốn võng Thực tế cho thấy phổ hấp thụ IR NO2 có đám 750, 1323, 1616cm-1 (không giống CO2 có đám phổ, nên phân tử NO2 phải có cấu tạo uốn võng 4.3.7 Phân tích định lượng: Khả ứng dụng phổ hồng ngoại ngành phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị trình độ phòng thí nghiệm Ngày nay, đời máy quang phổ hồng ngoại đại, tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu làm cho việc phân tích định lượng thêm xác mở rộng phạm vi phân tích định lượng Về nguyên tắc, việc phân tích định ượng theo phương pháp phổ hồng ngoại dựa vào định luật Lambert – Beer: A=lg(Io/I)=abc 40  A: Độ hấp thụ tia IR  Io: Cường độ xạ trước qua mẫu, I: cường độ xạ sau qua mẫu  a: Hệ số hấp thụ, b: bề dày mẫu  c: Nồng độ chất nghiên cứu Thực tế, người ta xác định nồng độ nhóm chức hợp chất cần phân tích Ví dụ: xác định nồng độ hexanol theo độ hấp thụ liên kiết O-H Về thực nghiệm, có cách xác định độ hấp thụ A a.Phương pháp đường chuẩn: Ví dụ: Xác định chất dạng dung dịch.Chọn số sóng thích hợp, cho dung dịch cần đo vào cuvét Chỉ số độ đo máy tỷ lệ với I Lại cho dung môi nguyên chất vào Cuvet Lần số đo tỷ lệ với Io.Theo hệ thức trên, xác định A tương ứng với nồng độ C Ở máy đại, giá trị A tính ghi trực tiếp Từ nồng độ khác biết, đo giá trị A tương ứng, vẽ đồ thị A - C.Sau với nồng độ cần xác định, đo A theo đồ thị chuẩn mà tìm C b Phương pháp đường nền: Có giá trị A cho trực tiếp máy.Nếu hỗn hợp có nhiều thành phần có đám phổ xen phủ để tìm nồng độ thành phần phải giải hệ phương trình nhiêu ẩn (tương tự phương pháp phổ điện tử) Kết thu theo phương pháp phổ hồng ngoại bị hạn chế sau: - Cuvet đựng mẫu thường làm NaCl, KBr mềm, dễ bị biến dạng, bề dày mẫu (giá trị b) thay đổi từ mẫu sang mẫu khác Cuvét bị tác động hoá học dung môi Do dẫn đến sai số phép đo Sai số phép đo nguyên nhân khác - Do hiệu ứng tập hợp phân tử chất hoà tan dẫn đến thay đổi tần số hấp thụ, hình dáng, cường độ hấp thụ - Do máy quang phổ hồng ngoại không đủ độ phân giải cần thiết nên không đủ khả đo đám phổ có tần số hẹp Mặc dù phương pháp phổ dao động phương pháp hữu hiệu để xác định chất định tính định lượng, ứng dụng rộng rãi nghiên cứu khoa học kiểm tra công nghiệp, phương pháp có hạn chế định: - Bằng phương pháp phổ hồng ngoại không cho biết phân tử lượng (trừ trường hợp đặc biệt) - Nói chung phổ hồng ngoại không cung cấp thông tin vị trí tương đối nhóm chức khác phân tử - Chỉ riêng phổ hồng ngoại chưa thể biết chất nguyên chất hay chất hỗn hợp có trường hợp chất có phổ hồng ngoại giống 41 V ỨNG DỤNG PHỔ HỒNG NGOẠI TRONG THỰC PHẨM: Quang phổ hồng ngoại (IR) xem kỹ thuật phân tích ứng dụng nhiều phân tích thực phẩm Kỹ thuật coi tốt không sử dụng hoá chất, vấn đề sức khoẻ an toàn IR phân tích dư lượng axit amin protein, đánh giá chất lượng chất béo, protein thành phần sản phẩm sữa hạt Phân biệt bột cá, bột thịt, bột đậu nành có mẫu phân tích thành phần hóa học sản phẩm thực phẩm phomat, ngũ cốc, bánh kẹo, thịt bò Phương pháp quang phổ IR dễ dàng thực hữu ích việc loại bỏ nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm mà ta nghĩ ngờ không đạt chất lượng PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH Phần lớn ứng dụng IR bao gồm phân tích thành phần nước, protein, chất béo đường 5.1 Nước: Việc đo độ ẩm ứng dụng pp NIR Nước tinh khiết có dải hấp thụ mạnh 970, 1190, 1440 1940 nm Sóng dao động mãnh liệt, cao 1940 nm Nó kết hợp rung động sóng có tần số cao thấp khác Các sóng 970 760 nm tương ứng dao động thứ hai thứ ba rung động kéo dài Vị trí hình dạng dải hấp thụ nước bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: nhiệt độ, nồng độ chất tan hạt kích thước mẫu Tính chất liên kết hydro có tác động đến hình dạng quang phổ khu vực phổ 1400-1500 nm Trong bột mì, lúa mì, hàm lượng nước tỷ lệ với khác biệt hấp thụ 940 2310 nm (Osborne et al 1993) Tuy nhiên, thường cần thiết để áp dụng phương trình hiệu chỉnh phức tạp dự đoán, lượng nước thực phẩm Việc đo độ ẩm phương pháp IR xác phương pháp tham khảo hầu hết sản phẩm đồng nhất, chẳng hạn bột, thay đổi tùy theo sản phẩm không đồng đem nghiên cứu Các kết đo nguyên liệu riêng xác so với hỗn hợp phức tạp Độ ẩm đo bị sai lệch 0,15-0,8% tùy thuộc vào thực phẩm đem phân tích 42 5.2 Protein : Phổ IR protein phức tạp khó để giải thích Người ta sử dụng phương pháp cận hồng ngoại (NIR) Các protein có đặc tính hấp thu bước sóng đến 1523, 1600 nm, 2050 2180 nm Các bứoc sóng 2180 nm thường sử dụng phân tích protein ( Osborne cộng (1993)) Ví dụ : phương trình dự đoán protein bột mì: %pr = 12,68 + 493,7*A2180 - 323,1*A2100 - 243,4*A1680 A2180 độ hấp thụ 2180 nm 323,1 * A2100 yếu tố cần thiết cho phản ánh quang phổ tinh bột, bao gồm dải hấp thụ protein đến 2180 nm Việc hấp thụ 1680 nm sở tham chiếu quang phổ Phân tích sản phẩm protein đơn giản bột xác Tuy nhiên chất không đồng thức ăn với thành phần hỗn hợp có sai lệch 0,16-0,45% 5.3 Lipid: Lipid cho quang phổ đơn giản chủ yếu đại diện hydrocarbon chuỗi axit béo Các dải hấp thụ xuất đến 1734, 1765, 2304 2348 nm Các chất béo phân tích IR nhiều sản phẩm, với chi tiết khác Tùy sản phẩm có mức độ chất béo cao hay thấp hơn, nhiều sản phẩm thô có hàm lượng lipid thấp Trong trường hợp độ nhạy độ xác phương pháp không đủ tin cậy 5.4 Glucid: Glucid có tầm quan trọng lớn thức ăn động vật Theo tính chất sinh hóa nó, glucid có vai trò dinh dưỡng khác Các vùng quang phổ hấp thụ mạnh 2070 2110 nm, nơi carbohydrate có dải hấp thụ mạnh sóng kéo dài rung động nhóm CO OH Khu vực phân biệt loại đường đơn giản polyme chúng saccharose phân tích nhiều loại thực phẩm dành cho người động vật, với sai số từ 0,2 đến 1% 43 Nó giúp xác định dễ dàng lượng saccharose thêm vào thực phẩm dựa vào kết phân tích đường dạng tự nhiên 5.5 Chất xơ : Phương pháp Van Soest phương pháp tiếng để xác định hàm lượng chất xơ phương pháp đo lường NDF (Neutral Detergent Fibre) ADF (Acid chất tẩy rửa chất xơ) NDF tổng hàm lượng hemixenluloza, cellulose lignin, ADF xác định hàm lượng cellulose lignin Phương pháp phân tích thông số với độ xác cao 5.6 số ứng dụng khác: - thực phẩm: + Xác định hàm lượng tro, béo, xơ, đạm, ẩm, phospho bột cá thức ăn gia súc + Xác định hàm lượng béo chocolate kem, sữa chua + Xác định hàm lượng béo, đạm, nước, acid béo bão hòa, acid béo không bão hòa sữa + Xác định hàm lượng béo, đạm, ẩm thịt, thịt bò, thịt bê, thịt heo, thịt gà, + Xác định hàm lượng tro, béo, ẩm, đạm thành phần amylose gạo - Công nghiệp dược phẩm : + Xác định mức độ este hóa acid acetic benzyl alcohol + Xác định hàm lượng nước dư sau sấy khô lạnh + Xác định hàm lượng nước dung môi + Xác định hàm lượng acid nitric dẫn xuất pyridine - Công nghiệp Hóa chất : + Xác định hàm lượng chất keo hỗn hợp dung môi (40-50%) + Xác định hàm lượng nước polymer phân tán + Xác định mức độ este hóa hóa chất công nghiệp + Xác định hàm lượng cyanamide dung môi (10-60%) Dinh dưỡng: 44 phương pháp IR thường xác định giá trị dinh dưỡng tiêu chuẩn thực phẩm tiêu hóa chất hữu lượng Dự đoán hàm lượng sử dụng tuyến tính dựa phương trình có dạng: Giá trị dinh dưỡng = số + α [protein] + β [lipid] + δ [carbohydrates] + Trong α, β, δ hệ số Từ IR để xác định thành phần riêng lẻ, sử dụng phương pháp phân tích để đánh giá giá trị dinh dưỡng nguyên vật liệu hỗn hợp nghiên cứu Một số nghiên cứu công bố thực để dự đoán thành phần sau áp dụng mô hình tuyến tính để xác định giá trị dinh dưỡng thực phẩm Một cách khác dự đoán trực tiếp giá trị dinh dưỡng từ pp NIR Tuy nhiên, phương pháp, tài liệu tham khảo để đo lường giá trị dinh dưỡng thực phẩm dài để thực tốn Các vấn đề phải có đủ số lượng mẫu phân tích hiệu chỉnh quang phổ IR VI NHỮNG LOẠI MÁY QUANG PHỔ TRÊN THỊ TRƯỜNG HIỆN NAY: 6.1 Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier: Thông tin chi tiết Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Model: Nicolet 6700 ThermoNicolet (Mỹ) Đặt tính kỹ thuật: - Độ phân giải quang học : 0.09 cm - Độ xác số sóng: 0.01 cm-1 - Độ tuyến tính theo tieue chuẩn: ASTM: