đề tài phương pháp pcr

Nguyên tắc PCR  PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase..  Đoạn mồ

1.Giai đoạn biến tính

2.Giai đoạn bắt mồi

3.Giai đoạn kéo dài

V Ý nghĩa và các ứng dụng PCR

VII Các hạn chế

Tài liệu tham khảo

II Nguyên tắc PCR

 PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.

 Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh

II Nguyên tắc PCR

 Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp

nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

1 chu kỳ

III Điều kiện phản ứng

Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau :

Hình : Thực nghiệm PCR

1 Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt giới hạn ….

3 Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

Deoxyadenosine 5’ triphosphate

4 Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA

Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm:

o Mồi xuôi (forward primer)

o Mồi ngược (reverse primer)

5.Enzyme DNA polymerase (Taq)

Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,

T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp

Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA

polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 o C lặp lại nhiều lần mà

không mất khả năng tổng hợp DNA

6 DNA mẫu (DNA template)

Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất.

Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả cao

III Quy trình phản ứng

 Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng

và kèm theo là yếu tố thời gian.

 Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong một chu kỳ:

1 Giai đoạn biến tính:

 Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn mồi và các dNTP.

2.Giai đoạn bắt cặp:

 Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 650C tốt nhất là

55oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút

 Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase và chiều dài sản phẩm.

3 Giai đoạn kéo dài:

 Nhiệt độ lúc này được nâng lên 720C trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ sung

=> Một bản sao DNA mới đã được hình thành

3 Giai đoạn kéo dài:

Sơ đồ phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ

Hình: Nhiệt độ của các chu kỳ phản ứng PCR

V Ý nghĩa và các ứng dụng

a Phương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều lý do:

 Độ tinh sach của mẫu không cần cao

 Dễ thực hiện

 Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn

 Độ chính xác cao đáng tin cậy

b Các ứng dụng chủ yếu của PCR gồm:

 Phát hiện đột biến

 Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

 Chọn giống vật nuôi, cây trồng

 Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

 Xác định mầm bệnh từ động vật thủy sản như bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV…và bệnh trên cá: VNN…

VII Kết luận

Ngày nay kĩ thuật PCR đang được áp dụng rộng rãi góp phần không nhỏ cho sự phát triển của y học nói

chung,cho ngành thủy sản nói riêng

Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm của kỹ thuật này thì cần phải khắc phục những hạn chế để giảm giá thành, mang lại kết quả cao hơn trong việc chuẩn đoán các mầm bệnh mới gây hại cho động – thực vật và con người.

Tài liệu tham khảo

 Bùi Trang Việt – Lê Thị Phương Hồng 2006 Sinh học

di truyền và phân tử, phần II Sinh học phân tử.

 Đỗ Hiếu Liêm, 2007 Sinh hóa đại cương.

BÀI THUYẾT TRÌNH CỦA

NHÓM