Đề tài TỔNG QUAN về PHƯƠNG PHÁP sắc ký TRAO đổi ION

    !!  " #$%&'()*&+(, # /0123444 ,567((#58( &'((#58( 9:5;(&5(, <=5>(, 1 !$?(,@5A(BCD*EF Sắc kí là một họ các kĩ thuật ha học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp. N bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Sắc kí là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp c thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ. Nguyên tắc chung: Phương pháp sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vàosự phân bố của chúng giữa hai pha động và tĩnh tiếp xúc vớinhau nhưng không trộn lẫn !!$#;(GHI Tùy theo các dạng pha tĩnh và pha động và cơ chế phân bố người tac thể chia các phương pháp sắc ký thành một số nhm chính sau: 1. Sắc kí giấy 2. Sắc kí lớp mỏng 3. Sắc kí khí-lỏng 4. Sắc kí trao đổi ion 5. Sắc kí ái tính ion kim loại bất động 6. Sắc kí lỏng hiệu năng cao 7. Sắc kí thẩm thấu gel 8. Sắc kí ái lực 2 !!!$D*EJ&AHK?H( Sắc kí trao đổi Ion (IC) là một quá trình cho phép phân tách các ion hay các phân tử phân cực dựa trên tính chất của chúng 4$,56<(D**LA!M Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích, khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh. Các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chất trao đổi ion. Bản chất của quá trình tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion của ionit Trước tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhm mang điện tích trái dấu, Sau đ, protein gắn được chiết rút riêng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tương tác ion bị bẻ gãy hoàn toàn) Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và vào lực ion của môi trường. Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi, Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra 3 N$O*6P5QR(##ST(,0&AHK?!H( Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào: 1. Sự phân bố điện tích bề mặt của protein. 2. ph. 3. Bản chất các ion trong dung dịch. 4. Các chất được thêm vào như dung môi hữu cơ. 5. Đặc tính của chất trao đổi. 6. Điện tích của protein càng cao, n càng gắn chặt vào chất trao đổi tích điện trái dấu. Tương tự như vậy, chất trao đổi càng tích điện nhiều (c nghĩa là c mức độ thay thế các nhm tích điện mạnh hơn), sẽ liên kết với protein mạnh hơn các chất tích điện yếu 4 U$O**#8V(#WAX&AHK?H( Nhựa trao đổi ion: được cấu tạo từ hợp chất polymer hữu cơ gồm một sườn hydrocacbon (polystyrene) c mang các nhm chức hoạt động. các nhm chức này nối với các ion linh động bằng lực hút tĩnh điện. c hai loại nhựa chính: cationit và anionit. Ngoài ra còn c các ionit đặc biệt như ion lưỡng tính( trao đổi cả cation và anion), ionit chứa nhm tạo phức, ionit chứa nhm oxy ha khử, ionit lỏng và cả màng trao đổi ion. Các chất trao đổi c chứa hoặc nhm acid hoặc base: 5 U$4$AH( Chất trao đổi ion base c chứa nhm tích điện dương và được gọi là anionit (nhựa trao đổi cation, vì chúng gắn và trao đổi cation).Anionit c dạng R+X- với nhm hoạt động R+ thường là nhm amin. Do c nhm amin gắn trên mạng lưới cao phân tử nên anionit mang tính bazơ. U$N$(H( Ngược lại, chất trao đổi acid c chứa nhm tích điện âm là cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi anion) .Cationit chứa nhm hoạt động là các anion R - , ion linh động là M + . Anion R - c thể là nhm sulphonate, nhm phosphate, cacboxylate hoặc amino diacetate 6 -CH 2 -CH- SO 3 - H + Các nhựa tích điện dương được gọi là "trao đổi anion"; các nhựa tích điện âm là "chất trao đổi cation" Các nhựa pha rắn thông dụng gồm: cellulose, dextran, agarose, và polystyrene Nhm trao đổi anion yếu: DEAE (diethylaminoethyl) là 1 base yếu (c điện tích dương rõ khi ion hoá và do vậy sẽ liên kết với các anion trao đổi), pH 2-9; chất giá c thể là dextran agarose, cellulose dạng hạt hay sợi. Nhm trao đổi cation yếu: CM (carboxymethyl):là 1 axit yếu c điện tích âm rõ khi ion hoá, do vậy liên kết với cation trao đổi; pH 3- 10, chất giá c thể là dextran agarose, cellulose dạng sợi. Protein là những chất lưỡng tính, c tổng điện tích thay đổi tuỳ thuộc môi trường: Dương ở pH thấp, Âm ở pH cao Zero ở pI . Nhm tham gia tương tác của protein thường là carboxyl: 7 -CH 2 -CH- CH 2 - NR 3 + X - - COOH → - COO - + H + và amino hoặc amin bậc ba: - NH 2 + H + → -NH 2 H + Y$*Z*#P&AHK?H( Tách trong sắc ký trao đổi ion thực hiện trong năm giai đoạn chính Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều c mang một điện tích tương ứng với điểm pH đ. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta c thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử 8 (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein c điện tích dương, do đ, những protein mang điện tích dương được phng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Y$4$Z*#P&AHK?H(*LA*AH( Giả sữ cationit sữ dụng là nhựa sulphonate R’SO3H. sau khi ngâm vào nước , nhựa bị trương nở và trở nên phân cực (chuyển thành R’SO3-H+). Khi nhựa tiếp xúc với dd chứa ion Mn+ phản ứng xảy ra như sau: n R’SO3H+(R) + Mn+(dd) = (R’SO3-)nMn+(R) + nH+(dd) phản ứng trên c thể viết lại như sau: nH+(R) + Mn+(dd) = Mn+(R) + nH+(dd) Y$N$*Z*#P&AHK?H(*LAA(H( nhm amin của anionit tác dụng tương tự như các amin trong dung dịch nước: RNH2+H2O=RNH3+OH Ion OH- trên anionit được trao đổi với các anion trong dung dịch. RNH3+ + HCl = RNH3+Cl- + H2O [$*O*##W*#\(!M chia làm hai bước: 1. gắn protein vào các điện tích cố định trên cột 9 2. chiết rút ra Trước tiên protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhm mang điện tích trái dấu Sau đ protein sẽ chiết rút riêng biệt,thường là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tương tác ion bị gãy hoàn toàn) Hay dùng nhất là gradien NACL của điệm (c rất nhiều loại khác nhau được sử dụng để cân bằng chát trao đổi) C thể bằng cách trao đổi PH(ít dùng hơn) khiến cho các nhm tương tác trên protein bị mất điện tích Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhm điện tích trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion cần tách với các ion khác Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và vào lực ion của môi trường Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với các ion trao dổi Khi nồng độ cạnh tranh cao ,các ion cần tách sẽ rời ra Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion. Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng nhựa trao đổi cation. Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng đến sự tách. Độ mạnh của liên kết liên quan đến cả pI của protein lẫn số điện tích tổng số. Do vậy, hai protein c pI bằng nhau không tách được bằng đẳng điện cân bằng lại c thể tách bằng IEC nếu sử dụng giá trị pH mà tại đ chúng c chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử. !$G\5#A.E#RH 10 [...]... Phân Tích Định Lượng,NXB Đại học Quốc Gia TP HCM,2004 MỤC LỤC I .Tổng quan về Sắc ký II.Phân loại III Sắc kí trao đổi ion 1.Nguyên tắc của IEC: 2.Các yếu tố ảnh hưởng tới trao đổi Ion: 3.Các chất (nhựa) trao đổi ion: 3.1.Cation 3.2.Anionit 4.cơ chế trao đổi ion 4.1.Cơ chế trao đổi ion của cationit: 4.2.cơ chế trao đổi ion của anionit 5 .Về cách thực hiện IEC IV.Tài liệu tham khảo 11 12 ...1 .Ion_ exchange_chroIon exchange chromatographic characterization of stinging insect vespid venoms Toxicon (Pergamon Press), 22,1 (1984) 154-160, Einarson, R., Renck, B 2 Ion Exchange Chromatography Protein Purification, Principles, High resolution methods and Applications, Janson, J.C., Ryden, L (Eds) VCH, Publishers Inc 3.Nguyễn Thị . ]^^ I .Tổng quan về Sắc ký II.Phân loại III. Sắc kí trao đổi ion 1.Nguyên tắc của IEC: 2.Các yếu tố ảnh hưởng tới trao đổi Ion: 3.Các chất (nhựa) trao đổi ion: 3.1.Cation 3.2.Anionit 4.cơ. thể chia các phương pháp sắc ký thành một số nhm chính sau: 1. Sắc kí giấy 2. Sắc kí lớp mỏng 3. Sắc kí khí-lỏng 4. Sắc kí trao đổi ion 5. Sắc kí ái tính ion kim loại bất động 6. Sắc kí lỏng. cationit và anionit. Ngoài ra còn c các ionit đặc biệt như ion lưỡng tính( trao đổi cả cation và anion), ionit chứa nhm tạo phức, ionit chứa nhm oxy ha khử, ionit lỏng và cả màng trao đổi ion. Các