CHIẾN lược TINH CHẾ PROTEIN, các PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ví dụ TINH CHẾ một PROTEIN tự NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG BÀI TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ PROTEIN Đề tài: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROTEIN, CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH. VÍ DỤ TINH CHẾ MỘT PROTEIN TỰ NHIÊN Giảng viên : ThS. Trịnh Đình Khá Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thu Huyền Mã sinh viên : DTZ1153310024 Lớp : Công nghệ sinh k9 Thái Nguyên, tháng 12 năm 2014 1 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Mối liên hệ giữa DNA, RNA và protein trong tế bào 5 Hình 2: Các bậc cấu trúc của protein 6 Hình 3: Sơ đồ chiến lược tinh chế protein 7 Hình 4: Sơ đồ sắc ký lọc gel 12 Hình 5: Mô tả nguyên lý của quá trình sắc ký trao đổi ion 13 Hình 6: Sơ đồ sắc ký ái lực 14 Hình 7: Hệ thống HPLC 15 Hình 8: Điện di đồ SDS-PAGE của ricin tinh chế. Điện di được thực hiện trong điều kiện có 0,1% SDS trong gel polyacrylamide 12,6%. Các băng protein được nhuôm bằng Coommasie Brillant Blue R250; 1: ricin dưới các điều kiện biến tính; 2: marker protein: 4,4, 18,4, 25, 35, 45, 66,2, 116 (kDa); 3: ricin dưới điều kiện không biến tính 24 2 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 4 CHƯƠNG 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN 5 1. Khái niệm và cấu trúc protein 5 2. Vai trò của protein 6 CHƯƠNG 2: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROETIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP 7 1. Thu hồi và chiết xuất protein. 7 1.1. Thu hồi các protein ngoại bào 8 1.2. Thu hồi các protein nội bào 8 1.3. Phá vỡ tế bào 8 1.4. Chiết rút protein 9 2. Tinh sạch sơ bộ 9 2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào 9 2.2. Ly tâm mẻ 9 2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục 9 2.4. Lọc bằng màng 9 3. Thẩm tích 9 4. Hệ phân tách hai pha nước 10 5. Các phương pháp kết tủa 10 5.1. Kết tủa bằng ammonium 11 5.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ 11 5.3. Kết tủa bằng các polymer khối lượng phân tử cao 11 5.4. Kết tủa bằng nhiệt 11 6. Các phương pháp sắc ký 12 6.1. Sắc ký lọc gel 12 6.2. Sắc ký trao đổi ion 13 6.3. Sắc ký ái lực (affinity chromatography) 13 6.4. Sắc ký tương tác kỵ nước 14 6.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC 15 7. Siêu lọc 15 8. Thiết kế các protein để tinh sạch 16 8.1. Các thể vùi (inclusion) 16 8.2. Các đuôi ái lực 16 9. Phân tách protein bằng điện di trên gel 18 9.1. Điện di một chiều 18 9.2. Điện di dựa vào điểm đẳng điện 19 9.3. Điện di hai chiều 19 9.4. Đánh giá kết quả tinh sạch 20 10. Kết tinh protein 20 11. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein 21 CHƯƠNG 3: VÍ DỤ VỀ TINH CHẾ PROTEIN TỰ NHIÊN TINH SẠCH 22 VÀ XÁC ĐỊNH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU (RICINUS COMMUNIS) 22 KẾT LUẬN 26 KẾT LUẬN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 3 MỞ ĐẦU Đất nước ngày càng phát triển, mức sống của người dân cũng được nâng cao nên nhu cầu về ăn, mặc, đáp ứng các dịch vụ cũng tăng lên. Để đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng thì cơ thể cần cung cấp đầy đủ các acid amin nên protein là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho con người nói riêng và vi sinh vật nói chung. Ngoài ra protein còn là chất xúc tác quan trọng cho các phản ứng sinh học trong sản xuất và được gọi là enzyme. Trong sản xuất protein để sử dụng ở các lĩnh vực khác nhau đặc biệt trong chuẩn đoán lâm sàng và cho ứng dụng trị liệu, công nghệ protein và công nghệ DNA tái tổ đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng. Các protein vốn chỉ có một lượng nhỏ từ mô động vật bây giờ có thể sản xuất trong một lượng gần như vô hạn từ các vi khuẩn sinh trưởng dễ dàng. Trong quá trình sản xuất đó thì mức độ protein ở mức độ tinh sạch là điều vô cùng quan trọng. Xuất phát từ việc tinh sạch protein quan trong đó chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu: “Chiến lược tinh chế protein, các phương pháp và ví dụ tinh chế một protein tự nhiên.” 4 CHƯƠNG 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN Hình 1: Mối liên hệ giữa DNA, RNA và protein trong tế bào 1. Khái niệm và cấu trúc protein Protein (Protid hay Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các axit amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amine (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của acid amine. Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 acid amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống. Cấu trúc protein được chia làm thành bốn bậc: Cấu trúc bậc một (cấu trúc sơ cấp) là trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ các liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị). Cấu trúc bậc hai (cấu trúc thứ cấp) là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong chuỗi polypeptide, hay nói cách khác đó là dạng cuộn xoắn cục bộ (local fold) của từng phần trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết hydrogen được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định. Cấu trúc bậc ba là 5 tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng cuộn xoắn trong không gian của toàn chuỗi polypeptide (overall fold), đây là hình dạng chung của chuỗi polypeptide. Các liên kết như liên kết Van der Waals, liên kết tĩnh điện, liên kết hydrogen giữa các mạch bên của các gốc amino acid đều tham gia giữ vững cấu trúc bậc ba. Cấu trúc bậc bốn xuất hiện ở những phân tử protein bao gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu (bậc ba), tương tác không gian (sự sắp xếp) giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu trúc bậc bốn. Mỗi chuỗi polypeptide này được gọi là một tiểu đơn vị (subunit). Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydrogen, lực Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị. Hình 2: Các bậc cấu trúc của protein 2. Vai trò của protein. - Vai trò vận chuyển - Vai trò xúc tác - Vai trò dinh dưỡng và dự trữ - Vai trò vận động - Vai trò cấu trúc, chống đỡ cơ học - Vai trò bảo vệ - Vai trò điều hoà - Các vai trò khác 6 CHƯƠNG 2: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROETIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP Trong thiết kế quy trình tinh sạch ở quy mô lớn thì số lượng các bước và sự thu hồi sản phẩm ở mỗi bước đã ảnh hưởng quan trọng lên sản lượng toàn phần. Sự thu hồi đặc trưng của một bước sắc ký là trong khoảng 80% và 90%, vì sự tinh sạch phức tạp đòi hỏi nhiều bước do đó sản lượng toàn phần nhiều khi chỉ bằng 10% của nguyên liệu khởi đầu. Điều này không thành vấn đề ở trường hợp tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm, nhưng nếu tinh sạch ở quy mô lớn thì đó là vấn đề rất quan trọng cần quan tâm để tối ưu toàn bộ quá trình từ hệ thống biểu hiện hoặc sự lên men đến bước tinh sạch cuối cùng, để giảm thiểu số bước tinh sạch cần thiết. Chiến lược tinh chế gồm những bước sau:  Giải phóng protein đích ra khỏi nguyên liệu  Hòa tan vào dung dịch nổi, loại chất cặn.  Loại nước, cô đặc protein.  Loại chất tạp nhiễm, tinh sạch.  Làm bền protein. Hình 3: Sơ đồ chiến lược tinh chế protein. 1. Thu hồi và chiết xuất protein. Sự thu hồi và tinh sạch các protein và enzyme cũng quan trọng như các giai đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein. Trong phần này sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein. 7 1.1. Thu hồi các protein ngoại bào Các protein ngoại bào tương đối dễ thu hồi và tinh sạch. Tế bào và nồng độ của dung dịch hoạt động được loại bỏ một cách đơn giản, và có thể cung cấp trực tiếp protein thô thích hợp cho một số ứng dụng. Dung dịch protein tương đối sạch có thể thu được bằng cách cho các nuôi cấy sinh trưởng trên môi trường đơn giản có thành phần xác định. Các bước thu hồi và tinh sạch giống như các bước đã dùng cho protein nội bào sau khi phá vỡ tế bào. 1.2. Thu hồi các protein nội bào Để tách chiết các protein nội bào từ các nguồn động-thực vật, mô phải được phá vỡ để giải phóng chúng. 1.3. Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng. Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiên đồng thể (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thùy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy. Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết. Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent). Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. 8 1.4. Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu. 2. Tinh sạch sơ bộ Tinh sạch protein là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những protein có giá trị ứng dụng cao. 2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào Sau khi phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch protein nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong phân lập protein, và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. 2.2. Ly tâm mẻ Ly tâm mẻ thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng từ nhỏ hơn 1 mL đến một vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm (rotational centrifugal force, RCF) tương đối lớn lên tới 100.000 g (hằng số hấp dẫn). Tuy nhiên, để loại bỏ các tế bào vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein, thì lực ly tâm chỉ cần đạt khoảng 20.000 g. 2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục Ly tâm dòng chảy liên tục thường được sử dụng cho quá trình tinh sạch protein ở quy mô lớn để loại bỏ các chất dạng hạt. Có ba kiểu ly tâm chính thích hợp hơn cả là: ly tâm thùng rỗng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng (multi-chamber) hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng (basket). 2.4. Lọc bằng màng 3. Thẩm tích Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể.Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp ) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó 9 các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa). Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ammonium sulphate ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng hơn). Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Như vậy, muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịch đêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giử lại trong túi. Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên. Muối (NH 2 )SO 4 hòa tan trong nước và bị loại dần. Thời gian thẩm tích có thể từ 24 - 48 giờ, làm thẩm tích lần cuối cùng bằng nước cất. 4. Hệ phân tách hai pha nước Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha nước (aqueous two-phase separation), hay chất lỏng-chất lỏng. Các hệ hai pha nước đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia (partitioning) protein trong suốt quá trình tinh sạch. Sự phân chia chính xác của một protein tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của chúng, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các muối đa trị như phosphate hoặc sulphate. 5. Các phương pháp kết tủa Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch enzyme. Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc 10 [...]... năm Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ và giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Sắc ký chỉ là phương pháp, với khả năng chọn lọc được yêu cầu, để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95% Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký được sử dụng phổ... sau:  Nắm được khái quát về protein, cấu trúc, vài trò protein và chiến lược tinh chế protein  Các phương pháp để tinh sạch protein  Tinh chế một protein cụ thể qua đó rút ra được các phương pháp phù hợp để tách chiết tùy vào điều kiện thực tế Bài tiểu luận này là bài thu hoạch sau những buổi học lý thuyết, những giờ thực hành tại phòng thí nghiệm cũng như trong giáo trình, các tài liệu tham khảo khác... dụng phương pháp này có thể ứng dụng cho hầu hết mọi quy mô hoạt động 8 Thiết kế các protein để tinh sạch Các nhân tố ở quá trình chuẩn bị cơ chất và nguyên liệu sản xuất (upstream processing) có thể ảnh hưởng đến sự phát triển phương thức tinh sạch protein sau này, công nghệ DNA tái tổ hợp cũng có một ảnh hưởng quan trọng lên sự tinh sạch protein Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự. .. tính do các protein tan không tốt dưới điều kiện này nên có xuất hiện một số vạch phụ Chế phẩm protein này sau đó tiếp tục được tinh chế bằng điện di SDS-PAGE kết hợp thôi protein từ gel điện di không biến tính nhằn thu protein nguyên Tuy nhiên, phương pháp này không nên áp dụng ở quy mô lớn vì tốn kém và hiệu xuất tinh chế không cao Trong các trường hợp 24 muốn thu lượng ricin tinh sạch, có một số... tiên Ví dụ: Ở quy mô lớn, 55% protein không mong muốn được loại bỏ trong một bước riêng rẽ bằng cách làm nóng dịch chiết E coli mang protein A của Staphylococcus tái tổ hợp ở 80ºC trong 10 phút Nếu protein tái tổ hợp được tinh sạch khỏi một cơ thể ưa nhiệt thì kết quả của xử lý nhiệt đầu tiên có thể là hiệu quả hơn nhiều 11 6 Các phương pháp sắc ký Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực... cho sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn Gen của protein quan tâm được dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid sẽ đơn giản hóa quá trình tinh 16 sạch protein, bằng cách biến đổi các tính chất của nó trong một kiểu có thể dự đoán Một trong các trường hợp đầu tiên là dung hợp di truyền của một số gốc arginine với C-terminus của urogastrone Gen này sẽ sản xuất một protein. .. thời, các peptide trong các protein đã được nhận có điểm số lớn hơn 31 đảm bảo sự tương đồng của các phổ thực nghiệm và lý thuyết, với mức ý nghĩa P . KHOA HỌC SỰ SỐNG BÀI TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ PROTEIN Đề tài: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROTEIN, CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH. VÍ DỤ TINH CHẾ MỘT PROTEIN TỰ NHIÊN Giảng viên : ThS. Trịnh Đình Khá Sinh. tiến hành tìm hiểu: Chiến lược tinh chế protein, các phương pháp và ví dụ tinh chế một protein tự nhiên. ” 4 CHƯƠNG 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN Hình 1: Mối liên hệ giữa DNA, RNA và protein trong tế. chiều 19 9.4. Đánh giá kết quả tinh sạch 20 10. Kết tinh protein 20 11. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein 21 CHƯƠNG 3: VÍ DỤ VỀ TINH CHẾ PROTEIN TỰ NHIÊN TINH SẠCH 22 VÀ XÁC ĐỊNH RICIN TỪ