Nghien cứu sản xuất kẹo viên synbiotic trường ĐH BÁCH KHOA TP.HCM

Nội dung và mục tiêu cần đạt đƣợc trong đề tài: Nghiên cứu sản xuất prebiotic, cụ thể là FOS trong quy mô công nghiệp, để làm thành phần quan trọng bổ sung vào kẹo viên synbiotic. Nghiên cứu quy trình sản xuất kẹo synbiotic. Khảo sát ảnh hƣởng có lợi của prebiotic lên probiotic trong sản phẩm. Khảo sát yếu tố vi gói và tối ƣu môi trƣờng sấy thăng hoa, tác động của chúng lên sự sống của probiotic. Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm.

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… 2

1.1 Thực phẩm chức năng cho hệ tiêu hóa: 2

1.1.1 Thực phẩm đường ruột 2

1.1.2 Chuyển hóa thực phẩm đường ruột 2

1.1.3 Hệ vi sinh vật đường ruột: 3

1.1.4 Thực phẩm chức năng đường ruột: 3

1.2 Tổng quan về prebiotic 4

1.2.1 Định nghĩa prebiotic 4

1.2.2 Tính chất prebiotic 5

1.2.2.1 Tính chất hóa lí 6

1.2.2.2 Tính chất sinh lí 7

1.2.3 Tác động có lợi cho sức khỏe người 8

1.2.4 Tác động của prebiotic lên probiotic 11

1.2.5 Phân loại prebiotic 15

1.2.5.1 Prebiotic có nguồn gốc tự nhiên 15

1.2.5.2 Prebiotic tổng hợp 16

1.2.6 Prebiotic tiêu biểu 17

1.2.6.1 Fructooligosaccharide (FOS) 17

1.2.6.1.1 Nguồn gốc 18

1.2.6.1.2 Cấu tạo 19

1.2.6.1.3 Tính chất 19

1.2.6.1.4 Tình hình tổng hợp 23

1.2.6.1.5 Enzyme fructotransferase (FTS)- hoạt tính và cố định FTS 26

1.2.6.1.6 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ 31

1.2.6.2 Inulin 36

1.2.6.3 Trans-galactooligosaccharide (TOS) 37

1.2.7 Ứng dụng của prebiotic 40

1.2.8 Hướng nghiên cứu và phát triển prebiotic 41

1.2.8.1 Hướng mở cho ngành thực phẩm 41

1.2.8.2 Trong y học, cải thiện sức khỏe người 41

1.3 Tổng quan về synbiotic 41

1.3.1 Khái niệm 41

1.3.2 Ứng dụng 42

1.4 Sấy thăng hoa 43

1.4.1 Định nghĩa 43

1.4.2 Ưu, nhược điểm sấy thăng hoa 43

1.4.3 Các giai đoạn trong sấy thăng hoa 44

CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KẸO VIÊN SYNBIOTIC……… 47

2.1 Công nghệ sản xuất kẹo 47

2.1.1 Thuyết minh quy trình 47

2.1.2 Vật liệu, phương pháp 49

2.1.3 Thảo luận: hiệu quả sử dụng prebiotic 51

2.1.3.1 Hiệu lực prebiotic 51

2.1.3.2 Đánh giá sản phẩm kẹo trong quá trình lưu trữ lạnh 53

2.2 Ảnh hưởng chế độ vi gói 56

2.2.1 Cơ sở khoa học vi gói 56

2.2.2 Vật liệu, phương pháp vi gói 58

2.2.3 Thảo luận: tác động của vi gói 61

2.2.3.1 Sự sống của các tế bào probiotic vi gói 61

2.2.3.2 Nghiên cứu vỏ vi gói 61

2.3 Khảo sát tối ưu môi trường sấy thăng hoa 63

2.4 Khảo sát, tối ưu quả trình bảo quản 64

2.5 Đánh giá cảm quan viên kẹo 67

2.6 Bảo quản kẹo synbiotic bằng bacteriocin: 68

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ………73

Kết luận: 73

Hướng phát triển 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 75

DANH MỤC BẢNG

CHƯƠNG 1……… 2

Bảng 1.2: Khả năng tiêu hoá của một số prebiotic trên đường ruột người 7

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của prebiotic lên lipid máu 9

Bảng 1.4: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) 18

Bảng 1.5: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác 20

Bảng 1.6 : Nguồn thực vật tổng hợp FOS 24

Bảng1.7 : Vi sinh vật tổng hợp enzym sản xuất FOS 24

Bảng 1.9: Thành phần của trans-galactooligosaccharides: 37

Bảng 1.10 : Kết quả kiểm tra vai trò của TOS trên động vật 39

CHƯƠNG 2……… 47

Bảng 2.1 Tính chất hóa lí của các prebiotic nghiên cứu 50

Bảng 2.2 Khả năng sống của LC-01, LB trong môi trường khảo sát bảo quản ở 4oC 55

Bảng 2.3 Hoạt độ nước của các mẫu thí nghiệm Lactobacillus, Bifidobacterium 62

Bảng 2.4 Tính chất lí hóa và lượng tế bào sống của kẹo 68

Bảng 2.5 Bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn probiotic 70

Bảng 2.6 Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactococcus lactis 71

DANH MỤC HÌNH

CHƯƠNG 1……… 2

Hình 1.1: Đơn phân monosaccharide của các NDOs 6

Hình 1.2 Chuyển hóa acid béo ở gan 10

Hình 1.3 Lượng tế bào sống probiotic qua thời gian bảo quản 14

Hình 1.4 Giá trị pH và độ acid của L acidophilus La-5 theo thời gian bảo quản 14

Hình 1.5 Hàm lượng N phân giải L.casei-01 (a) or L acidophilus La-5 (b) 15

Hình 1.6: Sơ đồ các quá trình sản xuất của oligosaccharide prebiotic 17

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của FOS 19

Hình1.8: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu 21

Hình1.9: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu 21

Hình 1.10: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của FTS A.pullulans 27

Hình 1.11 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ ở quy mô công nghiệp 33

Hình 1.12 Quá trình oxy hóa glucose dưới tác dụng của enzyme GOD 34

Hình 1.13: cấu trúc hoá học của inulin 36

Hình 1.14 Biểu đồ chuyển hóa prebiotics 41

Hình 1.15: Hệ thống sấy thăng hoa……… 46

CHƯƠNG 2……… 47

Hình 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất kẹo viên synbiotic 48

Hình 2.2 Hiệu quả sử dụng của prebiotic lên probitic …………… 52

Hình 2.3 Biểu diễn sự thay đổi pH và TA cho bốn mẫu bảo quản ở 4 0 C 54

Hình 2.4 Phương pháp vi gói phun phủ 57

Hình 2.5 Kĩ thuật tạo hạt gel vi gói 58

Hình 2.6 Phần cắt ngang của gel casein sau vi gói Lactobacillus,Bifidobacterium 59

Hình 2.7 Khả năng sống tế bào Bifidobacterium và Lactobacillus trong các mẫu khi sấy thăng hoa 61

Hình 2.8 Lượng tế bào Lactobacillus trên môi trường khảo sát trong sấy thăng hoa 63

Hình 2.9 Khả năng sống của Bifidobacterium bảo quản ở 4 o C và 25 o C, 11% 65

Hình 2.10 Khả năng sống của Bifidobacterium bảo quản ở 4 o C và 25 o C, độ ẩm 33% 65

Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus bảo quản ở 4 o C và 25 o C, độ ẩm 11% 66

Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus bảo quản ở 4 o C và 25 o C, độ ẩm 33% 67

Hình 2.13 Vi khuẩn gây bệnh bị ức chế hoạt động ở pH thấp (<3.5)……… 69

Hình 2.14 Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lc.lactis ……… … 72

MỞ ĐẦU

Ngày nay, ta dường như quá quen thuộc với các sản phẩm chức năng hỗ trợ tăng cường sức khỏe con người, giúp phòng ngừa và có thể chữa trị nhiều loại bệnh Trong

số đó, có tác dụng khá lớn và cũng được nhắc đến khá nhiều đó là các sản phẩm có bổ

sung probiotic, như là: sữa chua probi, yakult, kem probiotic, phomat có chứa probiotic

Thế nhưng, khái niệm kẹo synbiotic là còn mới lạ, probiotic là những vi sinh vật

có tác động có lợi cho con người và động vật, như là lợi ích cho đường tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, giảm dị ứng lactose, giảm ung thư…Prebiotic là những thành phần chất không tiêu hóa được, nhưng có thể được lên men bởi hệ vi sinh vật đường ruột mang lại những lợi ích cho cơ thể chủ Những lợi ích này sẽ càng có hiệu quả hơn nếu kết hợp probiotic với prebiotic chức năng Sự kết hợp đồng thời probiotic và prebiotic mang lại sản phẩm synbiotic, cho nhiều tác động có lợi hơn nhiều so với khi chỉ sử dụng đơn lẻ từng chất

Viên kẹo synbiotic mang hương vị sữa chua là một sản phẩm có sự kết hợp đó, nhằm mang lại hiệu quả cao hơn cho sức khỏe con người Với những điểm thú vị còn chưa khai thác hết, đã cuốn hút sinh viên thực hiện đề tài ―nghiên cứu sản xuất kẹo viên synbiotic‖, mong muốn được làm sáng tỏ hơn lợi ích về synbiotic cũng như về sản phẩm kẹo chức năng

Nội dung và mục tiêu cần đạt được trong đề tài:

- Nghiên cứu sản xuất prebiotic, cụ thể là FOS trong quy mô công nghiệp, để làm thành phần quan trọng bổ sung vào kẹo viên synbiotic

- Nghiên cứu quy trình sản xuất kẹo synbiotic

- Khảo sát ảnh hưởng có lợi của prebiotic lên probiotic trong sản phẩm

- Khảo sát yếu tố vi gói và tối ưu môi trường sấy thăng hoa, tác động của chúng lên sự sống của probiotic

- Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Thực phẩm chức năng cho hệ tiêu hóa:

1.1.1 Thực phẩm đường ruột

Vi khuẩn thường trú trong ruột già phụ thuộc vào nguồn cơ chất cung cấp cho

sự hoạt động và tăng sinh của chúng Cơ chất này chủ yếu được cung cấp bởi chế độ ăn uống, cũng có một phần từ nguồn nội sinh như mucin và chondroitin sulphate Bất kỳ thực phẩm nào không tiêu hóa ở phía trên đường tiêu hóa (dạ dày, ruột non) được xem

là một thực phẩm đường ruột cho các vi sinh vật cư trú tại ruột già, phụ thuộc vào quá trình lên men xảy ra, chúng có thể có những tác động tích cực hay tiêu cực cho sức khỏe của vật chủ [17]

Nguồn dinh dưỡng carbohydrate là tiền chất chính cho quá trình lên men, ATP được hình thành thông qua phosphoryl hóa cơ chất, phân hủy saccharose Nguồn cacbon chủ yếu là dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển trong ruột già là tinh bột, polysaccharide, cùng với các protein, peptide khác nhau và carbohydrate trọng lượng phân tử thấp Một loạt các endo và exo-glycosidase, protease, các amino- peptidase của

vi khuẩn có thể phân hủy các polyme phức tạp này, hình thành sản phẩm nhỏ hơn: đường, amino axit Vi khuẩn đường ruột sau đó có khả năng lên men các chất trung gian này để thành chất chuyển hóa có lợi khác

1.1.2 Chuyển hóa thực phẩm đường ruột

Các sản phẩm chủ yếu của lên men carbohydrate là các axit béo chuỗi ngắn (SCFA) và các loại khí Phần lớn các sản phẩm cuối cùng (95-99%) được hấp thu vào máu SCFA sinh ra là acetate, propionate và butyrate Người ta cho rằng acetate được làm sạch ở cơ bắp Propionate phần lớn bị hủy trong gan, trong khi butyrate là nguồn năng lượng chính cho đường ruột, các axit hữu cơ chẳng hạn như succinat và pyruvate thì làm tăng hiệu quả lên men trong ruột già Các hệ thống trao đổi chất của SCFA trong gan được cho là đóng góp khoảng 7-8% nhu cầu năng lượng hàng ngày cho vật chủ , tất cả cho thấy vai trò quan trọng của vi sinh vật đường ruột trong quá trình dinh dưỡng người[17]

Sản phẩm cuối chiếm ưu thế của quá trình lên men protein, gồm hợp chất phenol, amoniac và một số amine Những chất chuyển hóa này có liên quan trạng thái lâm sàng như tâm thần phân liệt, tạo khối u, chứng đau nửa đầu

Từ đây cho thấy, sản phẩm phân giải saccharose trong ruột là lành tính, trong khi những chất phát sinh từ sự phân giải protein là bất lợi Như vậy, có những kết quả tích cực cũng như tiêu cực liên quan đến quá trình lên men vi khuẩn đường ruột

1.1.3 Hệ vi sinh vật đường ruột:

Đường ruột con người là một hệ khuẩn khu trú phức tạp trong đó có sự tồn tại cân bằng hài hòa giữa các vi sinh đường ruột và cơ thể chủ Vi khuẩn đường ruột được dùng như là một kích thích chính cho sự phát triển của hệ thống miễn dịch niêm mạc (Deplancke và Gaskins năm 2002; Macfarlane và Cummings 2002)

Cho tới nay, kiến thức về thành phần hệ vi khuẩn đường ruột đã được nghiên cứu, có chứa khoảng 400-500 loài vi sinh vật khác nhau trong đường ruột Các nhóm

chính có lợi quan trọng là Bacteroide, với đóng góp đáng kể : Bifidobacteria,

Clostridia, Fusobacteria, Eubacteria, Lactobacilli, Coliform, Peptococci, Peptostreptococci, Streptococci kỵ khí Số lượng các vi khuẩn đường ruột lớn có thể

cao tới 1012 trên gam vật liệu phân, và có nhiều đóng góp tích cực cho hệ tiêu hóa, chống táo bón, tiêu chảy [17]

Hệ vi sinh vật của ruột già cũng có chứa các thành phần gây bệnh nếu phân giải protein, sinh sản phẩm gây hại Hơn nữa, cơ quan này là nơi cho các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm, chẳng hạn như các ký sinh trùng, vi rút và bacteria Tác nhân vi khuẩn gây

bệnh truyền qua thực phẩm bao gồm Campylobacter, Salmonellae, Listeria và một số chủng Escherichia coli Theo thống kê năm 1996, E coli sản xuất ra chất độc

verocytoxin (VTEC) O157, làm 21 người chết, chúng cũng được cho là nguyên nhân gây các bệnh đường ruột nghiêm trọng như bệnh viêm ruột (loét đại tràng, bệnh Crohn), ung thư ruột kết.Mới đây (tháng 6- 2011) Viện gen Beijing Genomics đã phát hiện và

khẳng định dòng E.coli O104 đang hoành hành ở châu Âu là một dòng vi khuẩn mới có

tính dễ truyền nhiễm và siêu độc, có khả năng kháng các loại kháng sinh chính như sulfonamide, cephalothin, penicillin và streptomycin; chủng này đã gây tử vong 22 người [43]

1.1.4 Thực phẩm chức năng đường ruột:

Nhìn chung, các thành phần khác nhau của các vi sinh vật đường ruột có thể mang lại những giá trị thúc đẩy sức khỏe cũng có thể có những tác động tiêu cực gây ra bệnh tật

Từ đây, cần có chế độ dinh dưỡng hợp lí, hỗ trợ bổ sung hệ vi khuẩn chức năng

có lợi, và xem xét nguồn thực phẩm chức năng dùng cho hệ vi sinh này, thông qua đó

sẽ hạn chế được vi khuẩn gây hại Probiotic, prebiotic và synbiotic là tất cả các phương pháp tiếp cận để cải thiện sức khỏe vật chủ bởi sự củng cố hệ vi khuẩn lợi trong đường ruột Đồng thời mang lại nhiều hiệu quả tích cực cho sức khỏe như: giảm ung thư, cải thiện hệ xương, duy trì hệ tiêu hóa khỏe mạnh, tăng cường hệ miễn dịch, ngừa sâu răng, giảm cholesterol trong máu… Từ những lợi ích lớn của dòng thực phẩm chức năng đường ruột này mang lại, đã cuốn hút sinh viên tìm hiểu và mong muốn nghiên cứu mảng thực phẩm probiotic, prebiotic, synbiotic này; và đi tìm hiểu cụ thể về ―sản xuất kẹo viên synbiotic‖

1.2 Tổng quan về prebiotic

1.2.1 Định nghĩa prebiotic

Prebiotic được xác định và định tên lần đầu tiên vào năm 1995 do Marcel Robertfroid và Gibson, cho rằng: ―Prebiotic là những thành phần thực phẩm không tiêu hóa, mang hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách kích thích chọn lọc sự tăng trưởng và hoạt động của một số hữu hạn vi khuẩn trong ruột kết, và do đó cải thiện sức khỏe vật chủ‖ [15]

Tính chất của prebiotic có tiêu chí cải thiện sức khỏe bởi sự kích thích có chọn lọc sự sinh trưởng và hoạt động của một số hữu hạn vi khuẩn ruột, điều này khó mà xác định được Từ đây, các tác giả xem xét lại khái niệm và đề nghị một định nghĩa mới[16]:

"Một prebiotic là thành phần không tiêu hóa, được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật đường ruột, cho phép những thay đổi cụ thể, cả về thành phần và hoạt động của hệ vi khuẩn đường tiêu hóa, đem lại lợi ích và sức khỏe cho cơ thể chủ "

Định nghĩa mới, cho thấy một sự phối hợp, cân bằng "prebiotic" và

"Bifidogenic", làm gia tăng nồng độ bifidobacteria trong phân ứng với mỗi gam probiotic được bổ sung hàng ngày Hiệu quả của bifidogenic phụ thuộc vào loại, nồng

độ của prebiotic và vào nồng độ bifidobacteria trong ruột của vật chủ

Theo những nghiên cứu và báo cáo, Gibson và Roberfroid khẳng định : prebiotic

là nhóm các oligosaccharide, nhưng không phải bất cứ loại carbonhydrate nào cũng có thể xếp vào nhóm prebiotic mà chúng cần thoả mãn các yêu cầu sau:

- Chống chịu được môi trường acid của dạ dày, không bị phân giải bởi enzyme động vật và không bị hấp thu ở ruột non

- Có khả năng lên men bởi các vi khuẩn đường ruột

- Kích thích sự phát triển và hoạt tính của các vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ Prebiotic không nhất thiết phải là các chất không bị tiêu hoá mà chỉ cần khi đến ruột kết chúng vẫn còn một lượng đủ lớn để làm cơ chất cho quá trình lên men ở đây

Những carbohydrate như inulin và oligofructose (OF), (trans-) galacto- oligosaccharides (TOS hoặc GOS) hoặc lactulose, thỏa mãn đầy đủ các tiêu chí, có thể được lên men bằng vi khuẩn đường ruột, (xem bảng 1.1; [33])

Bảng 1.1: Các oligosaccharide, prebiotic

Prebiotic Cấu trúc Nguồn trích Tác động Fructooligosacchride (FOS)  -D-Glu[-(1  2)-  -D-Fru] n ,n=2-4 Tổng hợp từ Sac bởi  -Fru B  , P  Oligofructo [  -D-Glu] m -D-Fru[-(1  2)-  -D-Fru] n Thủy phân inulin B  , P 

Inulin  -D-Glu[-(1  2)-  -D-Fru] n ,n=10-60 chicoree B  , P 

Galactooligosaccharide và TOS  -D-Glu[-(1  4)-  -D-Gal[-(1  6)-  -Gal] n Tổng hợp từ lac bởi  -Gal B  , P 

Oligosaccharide đậu nành [  -D-Gal-(1  6)] n -D-Glu[-(1  2)-  -D-Fru Từ đậu nành B 

Lactulose [  -D-Gal-(1  4) -  -D-Fru Lac B  ,P  ,PM  Lactosucrose [  -D-Gal-(1  4) -  -D-Glu-(1  2)-  -D-Fru Lac+Sac ( tổng hợp bởi  -Fru) B 

Glucoo ligosaccharide Sac+Mal(tổnghợpbởiGlT) B  ,nnE  Xyloo ligosaccharide (XO)  -Xyl[-(1-4)-  -Xyl] n n=1-8 Trích từ bắp  xylan  thủy phân B 

isomalto o ligosaccharide(IMO)  -D-Glu[-(1  6)  -D-Glu] n n=1-4 Thủy phân tinh bột(AmyAmy+Glase

Malto o ligosaccharid  -D-Glu[-(1  4)  -D-Glu] n n=1-6 Thủy phân tinh bột(  -Amy+ iso-Amy) Viết tắt: Glu= Glucose, Fru= Fructose, Sac= Saccharose, Gal= Galactose, Mal=Maltose,  -Fru=  -Fructofuranosidase,  - Gal=  -Galactosidase, GlT= Glucosyltransferase,  /  /iso Amy=  /  /iso-Amylase,  -Glase =  -Glucosidase, B=Bifidogen , P= pathogenic bacteria, PM= putrefactive metabolites, nnE= neonantal necrotising Enterocolitis

[33]

1.2.2 Tính chất prebiotic

Các carbohydrate có thể được phân loại theo kích thước phân tử hoặc mức độ trùng hợp (số đơn vị monosaccharide kết hợp), thành các monosaccharit, oligosaccharide hoặc polysaccharide Theo danh pháp IUPAC, oligosaccharide được định nghĩa là các saccharide có chứa từ 3 đến 10 đường đơn Cũng có định nghĩa khác,

số đơn phân có thể tăng lên 3-19 đơn vị

Đồng thời, dựa trên những đặc tính sinh lý, có thể phân loại thành các carbohydrate tiêu hóa hoặc không tiêu hóa được Prebiotic - oligosaccharide không tiêu hóa (NDOs) có các nguyên tử C anomeric : C1 hay C2 trong các đơn vị monosaccharide, có một cấu hình liên kết osidic không thể tiêu hóa được bởi sự thủy phân của enzyme tiêu hóa (Roberfroid & Slavin, 2000) Các NDOs hiện có sẵn trong tự nhiên , thành phần trong sản phẩm thực phẩm thường có các monosaccharide đơn vị là fructose, galactose, glucose và xylose (Hình 1.2) [35]

Hình 1.1: Đơn phân monosaccharide của các NDOs [35]

1.2.2.1 Tính chất hóa lí

NODs được hòa tan trong nước và cho độ ngọt bằng 0,3-0,6 lần vị ngọt của sucrose Trong thực tế, vị ngọt phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, mức độ trùng hợp của các oligosaccharide Theo Roberfroid và Slavin (2000) độ ngọt giảm dần khi chiều dài chuỗi oligosaccharide tăng lên Cường độ ngọt thấp này khá hữu ích chế biến trong các loại thực phẩm, có thể dùng để thay thế sucrose (có nhược điểm độ ngọt hơi cao)

Ngoài ra, khi so sánh với mono-và disaccharide, prebiotic có trọng lượng phân

tử lớn hơn, tương ứng cũng sẽ có độ nhớt cao hơn

Sự ổn định có thể khác nhau ở từng oligosaccharide prebiotic, tùy thuộc vào dư lượng đường, dạng vòng C cấu hình anomeric và các loại liên kết Mối liên kết β-glycosidic thì mạnh hơn mối liên kết α-glycosidic, và đường hexose liên kết bền vững hơn đường pentose Tuy nhiên, ở pH < 4.0 và nhiệt độ cao hoặc lưu trữ trong thời gian

dài tại điều kiện phòng, bất kì oligosaccharide nào trong thực phẩm đều có thể bị thủy

phân, dẫn đến việc mất dinh dưỡng và giảm tính chất hóa lý (Voragen, 1998)

Các oligosaccharide prebiotic cũng có thể được sử dụng để làm thay đổi nhiệt độ

đóng băng của thực phẩm đông lạnh, được dùng để điều khiển cường độ màu của thực

phẩm do phản ứng Maillard; trong quá trình gia nhiệt chế biến, chúng cũng làm tăng

khả năng giữ ẩm

Giá trị calo của NDOs được ước tính là 1,5-2,0 kcal/g, chiếm khoảng

40-50% của những carbohydrate tiêu hóa như sucrose (Sako và cộng sự, 1999.)

1.2.2.2 Tính chất sinh lí

Mặc dù oligosaccharide có tính chất hóa lý quan trọng , nhưng các lợi ích mang

đến trong thành phần thực phẩm lại chủ yếu do đặc tính sinh lý quyết định

Hai công trình nghiên cứu của Bach Knudsen và cộng sự (1995) và Ellegard

(1997) đã chứng minh prebiotic vẫn giữ nguyên một lượng lớn (86 – 89%) khi đến ruột

Lượng còn lại

Phần trăm còn lại

Tác giả công bố, năm

Inulin

Kỹ thuật mở thông ruột hồi

Bach Knudsen và Hessov,

1995 21.2 18.4 87

Ellegard và cộng sự, 1997 Oligofructose nt 15.5 13.8 89

Oligofructose nt 20.1 6.0 89 Molis và cộng sự, 1996

Một số kết quả nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra khả năng không bị tiêu hoá của prebiotic như: khi dung nạp prebiotic thì lượng đường trong máu không tăng (Hidaka, 1986; Rumessen, 1990) Prebiotic khó bị phân giải bởi dịch tiêu hoá từ dạ dày (Nilsson

và cộng sự, 1988)

Những kết quả trên cùng với hàng loạt nghiên cứu khác đã chứng tỏ prebiotic không bị tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người

 Prebiotic là nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật có lợi trong đường ruột

Như vậy prebiotic sau khi đi qua gần hết ống tiêu hoá vẫn còn một lượng lớn Khi đến ruột già prebiotic trở thành nguồn dinh dưỡng cho hệ vi sinh vật ở đây Trong

số các nhóm vi khuẩn kị khí bắt buộc hiện diện trong đường tiêu hóa, các bifidobacteria

và lactobacilli là những chủng sử dụng chủ yếu oligosaccharide được coi là các vi

khuẩn có lợi Lúc này prebiotic được lên men nhờ khuẩn lợi ở ruột kết

Sở dĩ các vi sinh vật này có khả năng sử dụng prebiotic là do chúng có thể tiết ra một số enzyme ngoại bào có khả năng phân giải các liên kết -(2-1)glycosidic Sản phẩm của quá trình lên men prebiotic là acid béo mạch ngắn (SCFA) như acetate, propionate, butyrate và L-lactate, sinh khối vi sinh vật, và các khí CO2, H2, CH4 Tuy nhiên chỉ một chủng vi sinh vật thì chưa đủ để lên men tuyệt đối prebiotic mà cần sự

phối hợp của nhiều chủng khác nhau Ví dụ như các chủng Bacteroide có khả năng sử dụng carbohydrate có chỉ số polymer hoá (DP) cao, trong khi các chủng Bifidobacteria

chỉ sử dụng được các loại carbohydrate với chỉ số DP thấp

Khả năng lên men, tốc độ lên men prebiotic còn phụ thuộc vào cấu trúc, độ trùng hợp, liên kết glycosidic, mức độ phân nhánh của chúng, sự kết hợp với vi khuẩn trong quá trình lên men, mối quan hệ giữa cơ chất và các sản phẩm lên men (Voragen, 1998) Prebiotic mạch thẳng thì dễ lên men hơn prebiotic mạch nhánh Prebiotic có cấu trúc càng giống tự nhiên thì càng dễ tiêu thụ bởi các vi sinh vật đường ruột

1.2.3 Tác động có lợi cho sức khỏe người

1.2.3.1 Tác động lên chế độ ăn uống

Prebiotic không bị tiêu hóa bởi enzyme trong đường ruột Vì vậy, chúng làm tăng kích thước khối phân, trọng lượng phân, và tần số phân, có tác động tích cực phòng táo bón và tốt cho niêm mạc ruột già [8] Prebiotic cho tác dụng tích cực khi sử dụng đều hàng ngày, và với lượng dùng là 2-10g/ngày

1.2.3.2 Tác động lên hệ vi khuẩn đường ruột

Ảnh hưởng tích cực của prebiotic và synbiotics cho hệ vi khuẩn đường ruột là thúc đẩy tăng sinh các vi khuẩn có lợi (bifidobacteria và lactobacilli) , ức chế các vi sinh vật có khả năng gây bệnh, cũng như sự ổn định của môi trường đường ruột bằng cách giảm pH và sinh ra axit hữu cơ chuỗi ngắn, đã được nghiên cứu, xác nhận trong các thí nghiệm và được kiểm tra khảo sát lại trên cơ thể động vật Inulin, oligofructose, TOS, synbiotic làm tăng bifidobacteria và lactobacilli, ức chế chủng vi khuẩn gây bệnh

cho con người và động vật (Clostridium spec., E coli, Campylobacter jejuni,

Enterobacterium spec., Salmonella enteritidis, hoặc S typhimurium)

1.2.3.3 Tác động lên sự chuyển hóa lipid

Những nghiên cứu gần đây nhằm đánh giá prebiotic ảnh hưởng lên lipid máu (Bảng 1.3) Ba nghiên cứu cho thấy giảm đáng kể cholesterol lipoprotein lượng thấp (LDL) và tổng số, không có thay đổi đáng kể triacylglycerol (TAG) [28]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của prebiotic lên lipid máu

Lipid glucose Yashashati cs FOS 8g ( 2 w)  TC,  LDL glucose

 Cơ chế hạ lipid của prebiotic

Prebiotic được biết như một cơ chất lý tưởng cho phát huy hoạt động của vi khuẩn trong ruột kết, đáng chú ý bifidobacteria và lactobacilli Trong quá trình lên men các sản phẩm sinh ra bao gồm các loại khí (H2S, CO2, H2, CH4), lactate và SCFAs (acetate, butyrate và propionate) Các SCFAs, acetate và propionate đi vào dòng máu,

và sẽ được sử dụng bởi gan Acetate được chuyển thành acetyl CoA trong gan và có vai trò như là một cơ chất cho sự tổng hợp lipid ; trong khi propionate đã được báo cáo

ức chế sự tổng hợp lipid Butyrate, mặt khác, được phân giải bởi các tế bào ruột già (colonocytes) và đã được chứng minh chống lại sự hình thành khối u trong đường ruột Các loại SCFAs được sản xuất trong quá trình lên men phụ thuộc vào các chủng vi khuẩn, các chủng này được kích hoạt bởi prebiotic Inulin đã được chứng minh là tăng

cả lượng acetate và butyrate, galacto-oligosaccharides cũng có tác dụng làm tăng sản xuất acetate và propionate và xylo-oligosaccharides chỉ tăng acetate [17]

Trong một nghiên cứu đã xác định cơ chế hoạt động của prebiotic lên động vật,

mà hai đại diện quan trọng là inulin và FOS Các nghiên cứu in vitro thử nghiệm trên

tế bào gan chuột , cho rằng hoạt động OF có liên quan đến sự ức chế tổng hợp cholesterol nhờ SCFA propionate Trực tràng có mặt acetate và propionate, kết quả là propionate ngăn cản sự hợp nhất acetate đến TAG được giải phóng từ gan Fiordaliso

và cs chứng minh giảm đáng kể TAG trong máu, phospholipid và cholesterol trong chuột, khi chúng được cho ăn với 10% (w/v) OF Các thí nghiệm cũng chỉ ra rằng FOS làm giảm lượng lipoprotein mức thấp (VLDL), TAG và phospholipid được tổng hợp trong gan thông qua este hóa acid béo và glycerol-3-phosphate để tạo thành VLDL Việc giảm cholesterol trong những con chuột chỉ cho kết quả sau khi thời gian dài (16 tuần) cho ăn với OF Bằng chứng gần đây cho rằng ảnh hưởng của OF làm giảm VLDL TAG là do làm giảm hoạt động của các enzym lipogenic (acetyl-CoA , cacboxylaza, acid béo synthase, enzym malic, ATP citrate lyase và glucose 6-phosphate dehydrogenase) Hình 1.2

1.2.3.4 Ảnh hưởng lên đường huyết: glucose và isulin

Cơ chế tác động của prebiotic vào việc giảm mức độ glucose và insulin được đề xuất có liên quan với các SCFA, đặc biệt là propionate Một nghiên cứu trên động vật gần đây cho thấy một sự suy giảm cả insulin và glucose sau bốn tuần cho ăn với OF Các hiệu ứng này đã được hình thành do hoạt động của OF lên sự tiết hormone ruột, glucosedependent insulinotropic polypeptide (GIP) ở ruột non và glucagon-like peptide 1 (GLP- 1) ở cuối hồi tràng và đại tràng [17]

Hình 1.2 Chuyển hóa acid béo ở gan [17]

1.2.3.5 Dinh dưỡng cho trẻ sơ sinh

Trong những năm gần đây những nỗ lực đã được thực hiện để cải thiện chế độ dinh dưỡng cho trẻ bú bình nhằm tạo ra một hệ vi sinh vật đường ruột chứa lợi khuẩn cao tương tự như của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ trong 2 đến 3 tháng đầu Điều này đã được thực hiện bằng cách cho trẻ bú sữa có bổ sung cả probiotic: bifidobacteria , lactobacilli

và Fructo, galacto-oligosaccharide Yếu tố quyết định sự thành công đó là lựa chọn áp dụng bổ sung Fructo và galactooligosaccharide [28]

Oligosaccharide sữa mẹ đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và điều hòa miễn dịch của sữa mẹ Nếu đều đặn bổ sung oligofructose, galacto-oligosaccharide vào các công thức dành cho trẻ sơ sinh với số lượng 0,4-1 g/100 ml trong thời gian nuôi từ 3 đến 12 tuần tuổi, sẽ cho kết quả gia tăng đáng kể bifidobacteria trong phân từ 20% đến xấp xỉ 60% (em bé bú sữa mẹ ~ 80%)

Ngoài ra, các thí nghiệm ở động vật cũng như các nghiên cứu ở trẻ sơ sinh và trẻ

em (1 và 14 tuổi ), cho thấy lợi thế khác của việc bổ sung prebiotic, probiotic , hoặc synbiotic vào thực phẩm cho trẻ đã làm giảm viêm ruột non, giảm rotavirus và do đó làm giảm tiêu chảy ở trẻ em [24]

Trẻ em ở Thái Lan, Brazil, Mexico, Tây Ban Nha, và Bồ Đào Nha mắc chứng suy dinh dưỡng, chế độ cho ăn bổ sung prebiotic đã làm tăng hấp thu canxi giúp tăng trưởng và cải thiện sức khỏe cũng như kích thích miễn dịch, làm giảm các vấn đề dị ứng [31]

1.2.3.6 Ảnh hưởng bất lợi của prebiotic

Tác dụng phụ của carbohydrate prebiotic, nếu dùng số lượng quá nhiều prebiotic ,qua quá trình lên men trong ruột già sinh ra lượng lớn khí có thể dẫn đến đầy hơi, hoặc làm rối loạn tiêu hóa , và tiêu chảy Trong một thử nghiệm cho 80 người khỏe mạnh dùng 31g - 41g oligofructose, tương ứng 0,04- 0,06 g/kg trọng lượng cơ thể [53] Nhận được kết quả là một số người trong số họ bị rối loạn tiêu hóa Nhìn chung, nên dùng 10-20 g oligofructose hoặc inulin mỗi ngày sẽ không gây tác dụng phụ

1.2.4 Tác động của prebiotic lên probiotic

Nếu prebiotic được bổ sung chúng sẽ ảnh hưởng đến đường ruột và có tính nhuận tràng, thông qua việc tác động lên các lợi khuẩn hoặc probiotic Acid béo mạch ngắn ( SCFA) là sản phẩm chính của prebiotic lên men, chúng làm kích hoạt sự phát triển của vi khuẩn và quá trình lên men

Để có thể phát huy tác dụng, prebiotic cần đi đến manh tràng Như đã biết prebiotic khó bị tiêu hóa bởi enzyme ruột non và tuyến tụy do cấu trúc hóa học, cũng như tỉ lệ cơ chất của từng loại prebiotic ( có loại prebiotic tinh khiết chứa đến 86-87% oligosaccharide như inulin và FOS, có loại chỉ chứa 20- 30% oligosaccharide còn lại là tinh bột và polysaccharide không phải tinh bột như XOS chứa 29.4% oligosaccharide, 41% tinh bột, 15% là monosaccharide) [23]

Prebiotic khi đến được manh tràng sẽ là những cơ chất tiềm năng cho lên men bởi hệ vi khuẩn Trong phần này sẽ khảo sát sự ảnh hưởng, tác động của inulin và FOS

lên vài chủng probiotic đại diện: L casei , L paracasei, Lactobacillus acidophillus,

Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis Các chủng giống được phân lập và

nuôi trên10% (w / v) thạch sữa tách kem (Himedia, Ấn Độ) ủ ở 37oC trong 72h điều

kiện hiếu khí cho và chủng Lactobacillus paracasei, điều kiện kỵ khí cho các chủng khác Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis Các chủng qua sấy thăng hoa sẽ được kích hoạt cấy trên môi trường MRS (Biokar

Diagnostics, Pháp)

Tiến hành thử nghiệm khảo sát trên ba nhóm môi trường, chuẩn bị như sau:

- Môi trường sữa kiểm chứng: lượng 50-ml sữa bò tiệt trùng ở 110-1120 C trong 10 phút

- Môi trường sữa đông tụ probiotic: tương tự cho lượng 50-ml sữa bò tiệt trùng ở 110-1120 C trong 10 phút, có thêm 2% các chủng L casei-01, L

acidophilus La-5 hoặc B lactis B94

- Môi trường sữa đông tụ synbiotic : giống môi trường sữa probiotic nhưng được bổ sung thêm 20 g L -1

một hỗn hợp của FOS: Inulin (50:50) Orafti, Bỉ)

(Beneo-Tiến hành phân tích hóa học để đánh giá:

- Độ pH của các môi trường sữa đông bằng cách đo trực tiếp với pH kế (Micro pH năm 2002, Crison, Tây Ban Nha), trong khi độ axit được xác định theo phương pháp AOAC (1990)

- Đánh giá thành phần acid hữu cơ và đường sử dụng trong các mẫu sữa đông bằng bộ máy HPLC của Merck LaChrom (Fullerton CA, USA)

- Tổng nitơ (TN): N tan trong nước (WSN) và phi protein (NPN) được xác định theo phương pháp Kjeldahl

Dùng phương pháp phân tích ba chiều của phương sai (ANOVA) để đánh giá ý nghĩa thống kê của thí nghiệm

Qua các thí nghiệm ta thu các kết quả như sau:

 Khả năng tồn tại của probiotic

B lactis B94 và L casei-01, trong cả hai môi trường sữa đông probiotic và

synbiotic, đạt được số lượng tế bào tối đa là 109-1010 cfu g-1 trong 5 đến 30 ngày bảo

quản (Hình 1.3 a, b) trong môi trường sữa đông probiotic L acidophilus La-5 đã

không thể hiện một sự tăng trưởng đáng kể, giá trị cao nhất lượng tế bào trong 30 ngày đầu bảo quản chỉ gần 8.5 log cfu/g; nhưng nuôi trong môi trường sữa synbiotic thì đạt lượng tế bào cao hơn 9 log cfu/g (hình 1.3 c)[11]

Hình 1.3 Lượng tế bào sống probiotic qua thời gian bảo quản[11]

môi trường sữa synbiotic môi trường sữa probiotic

(a)B lactis B94, (b)L casei-01, (c)L acidophilus La-5

Tuy lượng tế bào trong hai môi trường sữa probiotic và synbiotic của B lactis B94 , L casei-01 tương đương nhau trong 30 ngày đầu bảo quản, nhưng 15 ngày sau

đó lượng trong môi trường sữa probiotic là giảm đáng kể, thấp hơn 8 log cfu/g đối với

B lactis B94 và < 8.5 log cfu/g đối với L casei-01 Trong khi nếu dùng môi trường sữa

synbiotic lượng tế bào vẫn duy trì ở mức từ 8.5 - 9 log cfu/g

 Khả năng phân giải carbonhydrate

Khảo sát sự phân giải các đường tạo acid hữu cơ mạch ngắn (acid lactic, acid propionic…), đánh giá thông qua độ pH và độ acid đo được [13]

Hình 1.4 giá trị pH và độ acid của chủng L acidophilus La-5 theo thời gian bảo

quản[11]

môi trường sữa symbiotic môi trường sữa probiotic

Kết quả cho thấy nuôi trong môi trường sữa synbiotic hiệu quả hơn, phân giải

tạo các acid hữu cơ mạch ngắn nhiều hơn, tạo điều kiện cho sự phát triển L

acidophilus trong môi trường acid hơn Theo Su, Henriksson, và Mitchell (2007), cả

L casei B lactis có thể phát triển tốt trên môi trường bổ sung FOS hay Inulin Các hợp

chất prebiotic có tác dụng làm giảm độ pH, tạo ra acid lactic và acetic cao hơn Dễ dàng nhận thấy, chủng L acidophilus La-5 cho thấy tác dụng rõ rệt của việc bổ sung

prebiotic vào môi trường sữa đông, pH của môi trường sữa synbiotic là thấp hơn môi trường sữa probiotic, đồng thời đạt độ acid cũng cao hơn, nhưng độ acid này không quá thấp để gây ảnh hưởng khuẩn lactis

 Khả năng phân giải protein

Sự phân giải protein : lượng Nito hòa tan trong nước WSN và Nito phi protein NPN tăng trong suốt thời gian lưu trữ đối với môi trường probiotic và synbiotic, còn môi trường kiểm tra thì không, điều này thể hiện vai trò thực tế của enzyme

probiotic trong nỗ lực phân giải protein (Hình 1.5) ở chủng L acidophilus La-5, cho

thấy hiệu quả của việc bổ sung prebiotic, lượng protein phân giải là cao hơn hẳn trong môi trường chỉ có sữa đông probiotic.[11]

Hình 1.5 Hàm lượng N phân giải L.casei-01 (a) or L acidophilus La-5 (b)[11]

Kiểm chứng probiotic synbiotic

1.2.5 Phân loại prebiotic

1.2.5.1 Prebiotic có nguồn gốc tự nhiên

Prebiotic có thể được tìm thấy trong thành phần tự nhiên như trong sữa, mật ong, trái cây và rau quả: hành tây, rau diếp xoăn, tỏi tây, tỏi, atisô, chuối, lúa mạch đen, và cây củ hạ Phần lớn nồng độ dao động từ 0,3% đến 6% trọng lượng tươi đối với các

loài, riêng với rau diếp xoăn và cây củ hạ prebiotic chiếm khoảng 5% đến 10% trọng lượng

Măng tây, củ cải đường, tỏi, rau diếp xoăn, hành tây, lúa mì, mật ong, chuối, lúa mạch, cà chua là nguồn đặc biệt của fructooligosaccharide (Sangeetha et al, 2005; Yun, năm 1996; Ziemer & Gibson, 1998) Isomaltulose có trong mật ong, nước mía, và các sản phẩm từ mía như mật đường (Lina và cộng sự, 2002.) Xylooligosaccharide có trong măng, hoa quả, rau, sữa và mật ong (Vázquez và cộng sự, 2000.) Galactooligosaccharides được thấy tự nhiên trong sữa người và có mức nhỏ hơn trong

bò sữa (Alander et al, 2001.).[36]

1.2.5.2 Prebiotic tổng hợp

Tổng hợp prebiotic bằng cách thủy phân polysaccharide, và bằng cách tổng hợp

từ nguồn disacarite nhờ sử dụng enzyme [36]

Galactooligosaccharide được sản xuất thương mại hóa nhờ β-galactosidases xúc tác , enzyme này có hoạt động như transgalactosylation Trong quá trình sản xuất công nghiệp galactooligosaccharide, dung dịch lactose nồng độ cao - tinh sạch từ dịch whey sữa bò, là được sử dụng như cơ chất trong phản ứng này Đường galactose sẽ được chuyển đến tổng hợp mạch dài hơn vào lactose Các sản phẩm chính là các trisaccharide, cụ thể là 4’- hoặc 6’-galactosyllactose, và các oligosaccharide chuỗi dài gồm 4 hoặc nhiều hơn 4 đơn vị monosacarit (Sako và cộng sự, 1999.)

Giống như galactooligosaccharide, lactulose cũng là sản xuất từ lactose, nhưng trong trường hợp này, quá trình đồng phân hóa trong môi trường kiềm được sử dụng để chuyển đổi các đơn phân glucose của lactose thành fructose Sản phẩm lactulose tương đối đắt tiền, không chỉ vì năng suất sản phẩm thu được từ phản ứng thấp (20-30%) , mà còn do chi phí tinh sạch cao: tách galactose, axit isosacharic và các sản phẩm màu được tạo ra bởi sự thoái biến một phần lactulose (Villamiel, Corzo, Foda, Montes, & Olano, 2002)

Các quy trình công nghiệp sản xuất fructooligosaccharide có thể đi từ hai cách: một là, được sản xuất từ các đường đôi sử dụng enzym β-fructofuranosidase có hoạt động chức năng transfructosylation Tương tự như sản xuất galactooligosaccharide, nguồn nguyên liệu đầu vào yêu cầu có nồng độ cao (Park & Almeida, 1991) Theo Yun (1996) nồng độ sucrose khác nhau từ 600-850 g/l nên được sử dụng nhằm tiết kiệm chi phí bốc hơi trong quá trình chế biến cuối cùng Phương pháp thứ hai được sử dụng cho sản xuất fructooligosaccharides là thủy phân kiểm soát inulin (inulin oligofructose), chất này có thể được chiết xuất từ rễ rau diếp xoăn, (Crittenden & Playne, 1996)

Isomaltulose, cũng đƣợc nhắc nhƣ là palatinose, là một disacarit tự nhiên sản xuất từ sucrose , thông qua cơ chế sắp xếp lại các mối liên kết glycosidic từ (1,2)-fructoside thành (1,6)-fructoside (Lina và cộng sự, 2002.)

cho sức khỏe con người, mang đầy đủ các đặc tính của một prebiotic: kích thích tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride, chống béo phì, an toàn cho người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng … Đặc biệt, FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu

Ca, Mg, Fe…, ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bằng ion Mg2+

, Ca2+ trong cơ thể, chống loãng xương

Ở Mỹ, inulin và FOS là những sản phẩm dẫn đầu thị trường, tiếp sau đó là GOS

Ở Nhật, Công ty Meiji Seika là công ty đầu tiên sản xuất thành công sảm phẩm FOS

thương mại bằng enzyme chuyển hóa từ Asp niger và bán trên thị trường với tên

thương mại là Neosugar (1984) Gần đây hơn, công ty Cheil Food & Chemicals ở Hàn

Quốc đã thành công trong việc cố định tế bào nấm sợi Aureobasidium pullulans để sản

xuất FOS quy mô công nghiệp FOS đang dần thay thế các loại đường truyền thống như đường kính, và ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và thức ăn gia súc

FOS có nhiều trong tự nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, mận, đào, quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi… Hàm lượng FOS ở một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng 1.4

Bảng 1.4: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) [7]

(GF 2 )

Nystose (GF 3 )

Fructofuranosylnystose (GF 4 )

Tổng FOS (GF n )

1.2.6.1.2 Cấu tạo FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân tử đường sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết -2,1-glucoside Công thức tổng quát của đường FOS là GFn, trong đó n là số nhóm n = 2, 3,

4 (G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là các đường kestose (GF2), nystose (GF3) và fructofuranosylnystose (GF4) với công thức cấu tạo như hình 2.5

1-Trong đó, ketose GF2 gồm ba loại: 1-ketose [ 1F(1--D- fructofuranosyl sucrose)], neoketose [ 6G(1--D- fructofuranosyl sucrose)], 6-ketose [ 6F(1--D- fructofuranosyl sucrose)] Các fructooligosaccharide có độ polime hóa cao (GF3,

GF4…)có công thức [ 1F(1--D- fructofuranosyl)n-1 sucrose], được tạo ra bằng cách chuyển đơn vị đường fructosyl đến sucrose tạo liên kết tại vị trí -2,1 của sucrose.[26]

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của FOS [33]

1.2.6.1.3 Tính chất

 Tớnh chất vật lớ

Theo Gross, kestose là loại đường kết tinh màu trắng cú gúc quay cực []D20 là +28.50 và nhiệt độ núng chảy là 199 – 2000C Độ ngọt của kestose, nystose và fructofuranosylnystose so với sucrose lần lượt là 31%, 32% và 16% Độ ngọt tổng của

ba loại đường này (FOS) chỉ bằng 30% độ ngọt của đường sucrose [26]

Vị ngọt của FOS tương tự sucrose Đường FOS hỳt ẩm mạnh, nên khó bảo quản

ở trạng thái tinh thể trong thời gian dài Ở cùng một nồng độ, FOS có độ nhớt cao hơn

độ nhớt của sucrose Độ bền nhiệt của FOS cũng cao hơn sucrose Đường FOS bền trong dải pH 4.0- 7.0 và nhiệt độ cao tới 1400C [26]

Ở dạng lỏng, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, khụng màu hoặc màu vàng như syrup, cú mựi trỏi cõy và vị ngọt Ở dạng bột, FOS cú màu trắng đến vàng nhạt, mựi trỏi cõy và vị ngọt, FOS hũa tan trong nước [4]

Một số tác giả khi nghiên cứu về tính chất hoá lý của FOS đều đưa ra một kết luận chung là có nhiều tính chất hóa lý tương tự sucrose như độ hũa tan, độ đông đặc, nhiệt độ sôi và các thông số về quá trình kết tinh [26]

Bảng 1.5: Đặc tớnh của FOS so với một số loại đường khỏc

(Sucrose = 1)

ẩm Nhiệt độ pH

lượng đường và insulin trong máu theo thời gian sau khi ăn FOS đã cho kết quả như hình 1.8; 1.9 và [7] Kết quả cho thấy trái với sucrose, khi ăn FOS, trong cựng một khoảng thời gian, lượng đường trong máu không hề thay

đổi

Hỡnh1.8: Sự thay đổi nồng độ insulin trong mỏu [7]

Hỡnh1.9: Sự thay đổi nồng độ glucose trong mỏu [7]

- Vẫn cũn hiện diện khi đến ruột già, được lên men trong ruột già dưới tác

dụng của vi khuẩn Bifidobacterium Kết quả của quá trình là sinh ra các acid

béo mạch ngắn (SCFA) như acid acetic, acid propionic và acid butyric Các chất này sau đó được thấm vào thành ruột già hoặc chuyển lên gan, ức chế sự -gia tăng của glucose và chất béo trong máu

- Cỏc sản phẩm SCFA sinh ra giỳp cải thiện lipid, cholesterol trong mỏu ( như

cơ chế đó được trỡnh bày trong 1.1.3.3) Sự gia tăng hàm lượng acid sẽ có tác dụng giảm pH trong đường ruột, giữ gìn hoạt động trao đổi chất của các

vi sinh vật đường ruột khác ổn định, đúng quy luật, hạn chế hoặc ngăn ngừa

sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và các vi sinh vật gây thối rữa Ở mức độ cao hơn nghiên cứu còn chỉ ra rằng quá trình giảm pH trong đường ruột có tác dụng trực tiếp phòng và trị bệnh ung thư ruột thông qua việc ngăn

trừ sự phát triển của bacterium hoại sinh và ức chế hoạt lực của các enzyme

như nitroreductase, β-glucoronidase và decarboxylase Đây là những enzyme tham gia quá trình chuyển hoá nitơ tạo các sản phẩm trung gian có khả năng gây ung thư (những dẫn xuất phenol của tyrosin và tryprophan)

[7]

Như vậy FOS có vai trò khá tích cực như sau: làm giảm làm lượng glucose, isulin và chất bộo trong mỏu Ngoài ra, cũn cú thể điều chỉnh cỏc enzym tổng hợp acid bộo

 Ảnh hưởng của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột

Tác động của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột đã được nhiều tác giả nghiên cứu Bằng thí nghiệm ngoại thể, Gross.D khi nghiên cứu hệ vi sinh vật trực tràng cho

thấy các nòi Bifidobacterium spp và Bacteroides spp có thể phát triển mạnh trong môi trường dinh dưỡng có chứa FOS, ngược lại vi sinh vật gõy bệnh Escherichia coli và

Clostridium perfringens lại bị tiêu diệt trong môi trường này Còn kết quả thí nghiệm

trên cơ thể người và động vật ở các lứa tuổi khác nhau sau khi ăn FOS cho thấy số

lượng vi sinh vật Bifidobacterium và Lactobacilli trong đại tràng tăng lên, trong khi đó

số lượng vi sinh vật Clostridium perfringens lại giảm xuống Thí nghiệm còn chỉ rõ

rằng do FOS có cấu tạo mạch thẳng ngắn nên đã tác động đến khả năng lên men của các

vi sinh vật nói trên Còn các loại fructoligosaccharides mạch nhánh hoặc inulin mạch thẳng nhưng dài thì ảnh hưởng trên rất hạn chế

 Ảnh hưởng của FOS đến bệnh sâu răng

Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn Streptococcus mutans và các liên cầu

khuẩn gây nên Các vi sinh vật trên có rất nhiều trong khoang miệng của người và động vật Khi thức ăn đưa vào, chúng sẽ lựa chọn các thành phần dinh dưỡng phù hợp để lên

men, phát triển và gây bệnh Streptococcus mutans sử dụng nguồn đường tạo thành cỏc

acid và -glucans khụng tan là nguyờn nhõn chớnh gõy sõu răng.Vì vậy nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc chứa ít chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh

Để xét ảnh hưởng của FOS đến bệnh sâu răng người ta đã thí nghiệm trên cơ thể chuột Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn FOS) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn sucrose) [7]

 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ calcium của FOS:

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng FOS có thể tăng cường sự hấp thụ calcium của tế bào Nhờ đặc tính này, FOS có thể giúp cho con người phòng và chống các bệnh

về chuyển hoá và bệnh loãng xương Quá trình thúc đẩy hấp thụ calcium của FOS xảy

ra trong ruột già Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định một cách rõ ràng nhưng có một kết luận chung là do ba yếu tố sau:

- Đường FOS trong ruột già bị các vi sinh vật sinh acid lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hoà tan của các muối calcium

- Trong ruột già vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có

chứa FOS sinh ra các acid mạch ngắn, các acid này khuyếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ calcium

- Sự dịch chuyển FOS trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất calcium-protein, nhờ đó calcium được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thụ vào máu Ngoài calcium, FOS

đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magiê Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng calcium trong xương [7]

1.2.6.1.4 Tỡnh hỡnh tổng hợp Vì FOS có sẵn trong tự nhiên, tồn tại trong các loại cây củ nên nguồn enzim tổng hợp FOS đầu tiên phải lμ từ các loại thực vật trên ( bảng 1.6 nờu một số loại thực vật

cú FOS) hoặc bằng các phương pháp hoá học, hoá lý, hoá sinh Alen vμ Bacon [5] đã phát hiện trên lá cây củ cải đường có chứa enzim xúc tác sacaroza tạo ra hai trioza thuộc nhóm fructooligosacarit lμ 1-kestoza vμ 6-kestoza Trong cây atiso chứa enzim tổng hợp

và nấm mốc cú khả năng sinh tổng hợp enzymexusc tỏc quỏ trỡnh chuyển húa sucrose

thành, với cỏc chủng Aspergillus cho hiệu quả tổng hợp FTS cao được ứng dụng nhiều

trong sản xuất FOS, Aspergillus sydowi cú thể tổng hợp đường FOS với mức polymer

húa cao: DP từ 3-13 [33], bảng 1.7 nờu ra cỏc loài vi sinh vật cú khả năng sinh tổng hợp enzym chuyển húa FOS Đã có rất nhiều nghiên cứu về lĩnh vực sản xuất đường này theo công nghệ sinh hóa Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập tuyển chọn giống để sinh tổng hợp enzyme, ứng dụng enzyme trong sản xuất FOS và nghiên cứu tinh chế FOS

Crinum longifolium Bhatia và cs (1959)

Helianthus tuberosus (atisụ Jerusalem) Edelman và Dickerson (1966);

Scott và cs (1966); Praznik và cs (1990)

Lactuca sativa L (rau diếp) Chandorkar và Collins (1972)

Lycoris radiata (hạt cõy đơn tử diệp) Nagamatsu và cs (1990)

Taraxacum officinale (cõy bồ cụng anh) Chandorkar và Collins (1972)

Aspergillus japonicus Duan và cs (1994)

Aspergillus niger Hidaka và cs (1988, 1989); Bealing và

Bacon (1953)

Aspergillus oryzae Pazur (1952); Kida và cs (1988); Bealing

và Bacon (1953)

Aspergillus phoenicis Balken và cs (1991)

Aspergillus sydowi Muramatsu và cs (1988);

Claviceps purpurea Dickerson (1972); Arcamone và cs (1970)

Fusarium oxysporum Gupta và cs (1982); Maruyama và cs

(1979); Patel và cs (1994)

Penicillium frequentans Usami và cs (1991)

Penicillium spinulosum Bealing và Bacon (1953)

Phytophthora parasitica Hankin và Meintype (1977)

Scopulariopsis brevicaulis Takeda và cs (1994)

Saccharomyces cerevisiae Straathof và cs (1986)

[7]

 Nghiên cứu sinh tổng hợp FOS từ enzyme FTS

Bằng nghiên cứu của mình Hidaka đã tìm ra nhiều chủng vi sinh vật thuộc các

loài như Aspegillus awamori, Saccharomices cerivisiae, Aspegillus niger… có khả

năng tổng hợp FTS Thông qua quá trình phân lập, tuyển chọn theo hoạt lực chuyển hoá và tỷ lệ hoạt tính chuyển hoá với hoạt tính thuỷ phân (UT/UH), tác giả đã khẳng

định nấm mốc Asp niger là nguồn vi sinh vật tốt nhất cho lên men tổng hợp FTS

Phương phỏp lờn men FTS: bằng cỏch lờn men chỡm hiếu khớ với một số chủng nấm, và cỏc thụng số của quỏ trỡnh lờn men như độ thoỏng khớ, khuấy đảo, pH và nhiệt

độ cần được xỏc định cho từng loại vi sinh vật Điều kiện chung cho tổng hợp FTS thụng qua nuụi cấy vi sinh vật trong mụi trường đó được nghiờn cứu kĩ Vớ dụ như sucrose là nguồn carbon tốt nhất cho sự phỏt triển sinh khối và hoạt động của enzyme

pH cần duy trỡ lớn hơn 5.5 và nhiệt độ tối ưu cho tế bào sinh trưởng là khoảng 300C Ở

Aureobasidium sp., enzyme nội bào sau đú được tiết ra ngoài mụi trường Hoạt động

của enzyme nội bào được kớch thớch mạnh khi tăng nồng độ ion Mg2+ Khi hàm lượng sucrose trong mụi trường bị giới hạn, FOS sẽ được sử dụng làm nguồn cung cấp carbon Sau 6h nuụi cấy với 20% sucrose, khoảng 55% (w/w) FOS được tạo thành Tế bào vi sinh vật sau đú được loại ra khỏi canh trường bằng cỏch ly tõm và enzyme được chiết tỏch nhờ lysozyme hoặc cú thể cố định số tế bào vi sinh vật chứa enzyme đú và đưa vào sản xuất FOS [26]

Một đặc điểm chung cho tất cả các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, hầu hết FTS trong các vi sinh vật tìm được chủ yếu là enzyme nội bào và luôn chứa đồng thời

cả hai hoạt tính là thuỷ phân và chuyển hoá Tỷ lệ hoạt lực của hai hoạt tính trên thay

đổi phụ thuộc vào chủng loại giống và điều kiện lên men, điều kiện phản ứng… [7]

1.2.6.1.5 Enzyme fructotransferase (FTS)- hoạt tớnh và cố định FTS FTS là tờn gọi chung cho cỏc enzyme cú hoạt tớnh xỳc tỏc quỏ trỡnh chuyển dịch gốc fructose Quỏ trỡnh trờn cú thể xảy ra theo hai cỏch là cắt khụng gắn và cắt rồi gắn Khả năng xỳc tỏc cắt khụng gắn của enzyme là hoạt tớnh thủy phõn (viết tắt là UH), cũn khả năng cắt rồi gắn là hoạt tớnh chuyển húa (viết tắt là UT)

Nhiều nhà nghiờn cứu vẫn gọi tờn loại enzyme dựng sản xuất FOS là fructofuranosidase, một loại enzyme thuộc nhúm thủy phõn kớ hiệu EC.3.2.1.26 Nguyờn nhõn cú thể là do hoạt tớnh chuyển gốc fructose ban đầu được phỏt hiện ở enzyme invertase khi tiến hành thớ nghiệm với mẫu cú nồng độ sucrose cao Trong khi

-D-đú số khỏc lại gọi enzyme này là fructosyltransferase, kớ hiệu EC.2.4.1.9, nhằm phõn biệt với cỏc enzyme thuộc nhúm enzyme thủy phõn khỏc [26]

Phụ thuộc vào vị trớ gắn cỏc gốc fructose lờn chất nhận, enzyme này được phõn

ra nhiều loại với cỏc tờn gọi khỏc nhau như: 6G-fructosyltransferase (6G-FT), 6Ffructosyltransferase (6F-FT) và 1F-fructosyltransferase (1F-FT) Cỏc enzyme trờn xỳc tỏc lờn phõn tử sucrose tạo cỏc FOS cú phõn tử lượng như nhau nhưng khụng giống nhau về cấu trỳc phõn tử Ba enzyme 6G-FT , 6F-FT và 1F-FT xỳc tỏc gắn vào phõn tử đường ở cỏc vị trớ khỏc nhau tạo ra cỏc đường tương ứng

-Cỏc FTS cú nguồn gốc từ thực vật chỉ cú hoạt tớnh UT, nhưng mang tớnh đặc hiệu

cơ chất tương đối (gắn gốc fructose vào phõn tử đường sucrose khỏc ở nhiều vị trớ khỏc nhau) Khỏc với enzyme tổng hợp từ vi sinh vật, FTS trong thực vật cú phõn tử nhỏ hơn

và trong phõn tử khụng chứa nhúm glucoside Nhiệt độ thớch hợp cho hoạt động của chỳng là 300

C – 450C [7]

Trong khi đú FTS cú nguồn gốc từ vi sinh vật lại cú cả hai loại hoạt tớnh UT và

UH nhưng hoạt tớnh gắn lại cú tớnh đặc hiệu cơ chất gần như tuyệt đối Enzyme FTS cú nguồn gốc khỏc nhau cũng khỏc nhau về cấu tạo húa học FTS tổng hợp từ vi sinh vật là những enzyme đa cấu tử, cú phõn tử lượng cao (>10.000 Da), trong phõn tử cú chứa cỏc nhúm glucoside Nhiệt độ hoạt động tối thớch của enzyme này là 500

C – 600C, rộng hơn

so với enzyme từ thực vật, pH thớch hợp là 5 - 6.5 và nồng độ sucrose từ 700-850g/l

[26]

Một số chất ức chế và xỳc tỏc hoạt động chuyển húa của FTS cũng được nghiờn

cứu Ở loài cõy Agave americana, FTS được xỳc tỏc bởi cỏc ion Ca2+, Mg2+, Co và Li+

và bị ức chế bởi Ag+, Pb, Hg, Al3+ và Sn Trong khi đú, enzyme sản xuất bởi loài nấm

sợi Aureobasidium sp bị ức chế bởi Hg, Cu và Pb [26]

FTS là loại enzyme đặc hiệu, nú chỉ cú thể tỏc dụng xỳc tỏc phõn cắt và gắn kết gốc fructose trong phõn tử sucrose hoặc cỏc dẫn xuất của sucrose để tạo thành FOS Cũn ở trong dung dịch chỉ cú fructose và glucose thỡ enzyme này khụng cú khả năng xỳc tỏc tạo FOS

Cơ chế chung cho phản ứng chuyển húa gốc fructose như sau:

GF + fructosyltransferase  F – fructosyltransferase + G F-fructosyltransferase + GF  GF2 + fructosyltransferase

Hỡnh 1.10 cho thấy cơ chế xỳc tỏc phản ứng tạo cỏc FOS từ sucrose của

fructosyltransferase thu từ A.pullulans

Hỡnh 1.10: Cơ chế chuyển húa tạo FOS từ sucrose của FTS A.pullulans [26]

G, GF, GF2, GF3, GF4 lần lượt là glucose, sucrose, 1-kestose, nystose, 1Ffructofuranosylnystose

-Quỏ trỡnh tổng hợp này, cần hai loại enzyme tổng hợp riờng biệt: để tổng hợp trisaccharide (GF2) nhờ đến hoạt động của sucrose: sucrose 1F- Fructosyltransferase (SST); sau đú oligosaccharide (GFn) tổng hợp được cần đến enzyme fructan: fructan 1F- Fructosyltransferase (FFT)

 Hoạt tớnh enzyme FTS

Hidaka và các cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu khả năng công nghiệp hoá sản xuất FOS từ đường kính nhờ enzym fructosyltransferase Ông cũng là người đã

đưa ra phương pháp xác định hoạt lực fructosyltransferase (FTS) và đại lượng biểu thị mối liên quan giữa hoạt lực FTS và hiệu suất chuyển hoá sucrose thành FOS (tỷ lệ hoạt tính chuyển hoá với hoạt tính thuỷ phân U

Một đơn vị hoạt tớnh tổng hợp (UT) được định nghĩa là lượng enzyme cần xỳc tỏc cho sinh ra 1M glucose trong một phỳt tại những điều kiện phản ứng xỏc định

Một đơn vị hoạt tớnh thủy phõn (UH) được định nghĩa là lượng enzyme cần xỳc tỏc cho sinh ra 1M fructose tại những điều kiện phản ứng xỏc định

Tỉ lệ T/H cũng là hiệu suất chuyển húa sucrose thành FOS sẽ biểu thị được khả năng sinh tổng hợp của enzyme cú trong mụi trường phản ứng

Tiến hành xỏc đinh hoạt tớnh enzyme và hiệu suất chuyển húa như sau:

- Trộn 90 L cơ chất sucrose và 100L dịch trớch enzyme thu được từ

Aspergillus BT18 đem ủ hỗn hợp phản ứng xảy ra ở 45oC trong 15 phỳt, sau

đú đun núng lờn 100 oC khoảng 5 phỳt thỡ dừng phản ứng

- Tạo một hỗn hợp: trộn 1mL dung dịch glucose với 22mg ATP, trộn hỗn hợp tiếp với 13mL nước, kốm bốn đơn vị hexokinase và hai đơn vị glucose-6-phosphate dehydrogenase

- Lấy 950L hỗn hợp trờn thờm 50L dịch phản ứng dừng ở bước 1 ủ ở 37 oC trong 20 phỳt đặt trong tụi, đem đi đo quang phổ ở bước song OD595, lượng glucose sinh ra (G1) được xỏc định

- Thờm vào 0.1 U enzyme phosphoglucose isomerase sau đú ủ ở 37 oC trong

20 phỳt đặt trong tối, đo OD595 lần nữa và xỏc định nồng độ glucose (G2)

- Nồng độ fructose trong mẫu được xỏc định bằng hiệu số G2-G1, hiệu suất chuyển húa của enzyme FTS được xỏc định bởi cụng thức G1/ (G2-G1)

 FTS nội bào và ngoại bào:

Enzyme là loại protein được tạo thành bờn trong tế bào, cỏc enzyme này thường khụng cú khả năng di chuyển qua màng sinh học nờn phần lớn chỳng tồn tại trong tế bào Những enzyme nội bào này muốn thu nhận phải phỏ vỡ tế bào bằng nhiều phương phỏp[4]

- Phương phỏp cơ học: nghiền bi, nghiền cú chất trợ nghiền

- Phương phỏp vật lớ: dựng song siờu õm

- Phương phỏp húa hoc: dựng dung mụi butyric, aceton, ethanol…

Một số enzyme được tỏch khỏi tế bào, để thực hiờn nhiệm vụ chuyển húa cơ chất, thực hiện cỏc phả ứng ngoài tế bào Những enzyme này cú khả năng hũa tan trong mụi trường nước, được gọi là những enzyme ngoại bào[20]

Xu hướng gần đõy gia tăng sử dụng prebiotic đặc biệt là FOS trong ngành cụng nghệ thực phẩm đó thỳc đẩy cỏc nghiờn cứu về cỏc enzyme và chủng vi sinh vật tổng hợp FOS Enzyme FTS ngoại bào được nghiờn cứu gần đõy cú nguồn gốc từ nấm men

và một số chủng vi khuẩn

Theo Maugeri và Hernalsteens và cs (2007), nấm men cú trong hoa và quả thuộc rừng nhiệt đới Brazil, cú khả năng tạo enzyme ngoại bào cú hoạt tớnh tổng hợp fructose

cao Một trong số những chủng tiềm năng này là Rhodoturula spp (LEB- V10)

Enzyme này khụng cú hoạt tớnh thuy phõn, nhưng thay vào đú cú thể hoạt động được trong nền cơ chất sucrose nồng độ 50%(w/w)

Inulinase từ Kluyveromyces marxianus được nghiờn cứu bởi Santos và

Maugeri, 2007 Enzyme ngoại này cú khả năng sản xuất chuyờn biệt 1-F fructooligosacchride

Một chủng khỏc là Schnniomyces occidentalis được mụ tả dựng tổng hợp

6-ketose ( nghiờn cứu bởi Alvaro- Benito và cs, 2007), chủng này tạo enzyme cú hoạt động chớnh là thủy phõn sucrose

Chủng vi khuẩn Bacillus macerans cú thể sản xuất FTS, dịch trớch enzyme thụ

cú thể tổng hợp chọn lọc GF5, GF6, trong khi đú enzyme này nếu đem tinh sạch chỉ tổng hợp chủ yếu 1-ketose và nytose như những enzyme FTS khỏc ( Park và cs, 2001)

- Xử lý sinh khối: Sinh khối thu được sau lên men được rửa sạch bằng nước cất

vμ dung dịch đệm Mcllvaine (muối photphat natri - axit citric) 0,1 M pH5

- Phá vỡ tế bμo : Sử dụng 3 phương pháp lμ nghiền bi, đồng hoá siêu tốc vμ siêu

âm Cả 3 phương pháp trên đều dùng dung dịch đệm Mcllvaine (muối phốt phát natri- axit citric) 0,1M pH= 5 [6]

- Sau khi phá vỡ tế bμo, dung dịch được ngâm 3 giờ ở nhiệt độ 40C Cuối cùng enzim thô được tách ra từ dung dịch bằng cách lọc chân không, hoặc li tâm lạnh Enzyme thô sau đó được đem phân tích hoạt lực Quá trình tuyển chọn giống sẽ căn cứ vμo hoạt lực của enzim

 Cố định tế bào – phương phỏp hiệu quả để sản xuất FOS

Nghiờn cứu enzyme nội bào từ nấm mốc Aspergillus, thấy hầu hết chỳng cú

một đặc điểm chung là nguồn enzyme nội bào cú hoạt lực chuyển húa và tỉ lệ hoạt tớnh chuyển húa với hoạt tớnh thủy phõn cao hơn nhiều so với enzyme FTS ngoại bào [7]

Từ đõy, để phỏt huy được hiệu quả sử dụng nguồn enzyme nội bào này nờn tiến hành

cố định tế bào Aspergillus lờn chất mang

Nghiờn cứu của K-J Duan nhằm cố định Aspergillus japonicus bằng cỏch bẫy

vào mạng gluten và ứng dụng vào sản xuất FOS từ sucrose nhờ enzyme fructofuranosidase nội bào Gluten được nhận thấy là vật liệu thớch hợp để cố định sợi nấm cựng với enzyme sản xuất FOS Gluten là một dạng polymer tự nhiờn, và là phụ phẩm của cụng nghiệp sản xuất bột mỡ Sử dụng gluten cú cỏc ưu điểm như nú là chất

-cú thể phõn giải được, rẻ tiền, khụng độc và là nguồn nguyờn liệu -cú sẵn[9]

Quỏ trỡnh cố định tế bào được thực hiện: Bột gluten (10g, Sigma) được hũa tan trong 200ml dung dịch NaOH 0.05N Sau khi ly tõm loại những phần khụng tan, phần

dd gluten cũn lại được điều chỉnh với HCl 0.1N Khi pH giảm cũn 11, tiếp tục thờm 5ml dung dịch tinh bột đó bị oxy húa vào (22%, w/v), và sau đú pH được giảm tiếp xuống 6 Sau khi đó làm lắng gluten dạng keo và loại bỏ những phần nổi lờn trờn bề

mặt, phần keo lắng được trộn đều với sợi nấm đó nghiền nhỏ của A.japonicus Phần gel

này sau đú được làm khụ ở dạng những sợi tế bào được cố định với đường kớnh 0.25cm Sau cựng cắt gel khụ thành những mảnh nhỏ cú kớch thước 0.25cm x 0.4 cm và trữ ở 40C trước khi đem sử dụng

Sử dụng tế bào cố định này cho sản xuất fructooligosacchride theo mẻ: bổ sung 1g (hoặc 1 lượng cụ thể nào đú) mảnh tế bào cố định vào 100 ml dung dịch đường sucrose (40%, w/v) để sản xuất FOS ở 370C dưới chế độ lắc 125v/p đặt trong bể nước Quỏ trỡnh sản xuất FOSs được kiểm soỏt bằng cỏch đo hàm lượng FOS tạo thành trong dung dịch

Kết quả thu được: với hiệu quả cố định tế bào A.japonicus, sucrose nhanh chóng

biến đổi thành glucose và 1-kestose (GF2) theo tiến trình phản ứng Sau 4 giờ hàm lượng 1-kestose tạo ra đạt giá trị cao nhất 1-kestose sau đó được chuyển hóa thành nystose (GF3) Tổng lượng FOS, mà chủ yếu là 1-kestose và nystose, đạt đến giá trị cực đại là khoảng 61% lượng đường trong hỗn hợp sau 5h phản ứng

1.2.6.1.6 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ

Một quy trình sản xuất FOS với quy mô công nghiệp gồm những bước sau:

- Cung cấp nguyên liệu thô chứa sucrose Nguồn sucrose từ mía đường được cung cấp bởi Candico® (Belgium) được xem là sucrose hữu cơ, thường được cung cấp dưới dạng tinh thể rắn

- Phối trộn với enzyme để tạo thành một hỗn hợp Enzyme sử dụng có hoạt tính endo-inulinase (EC 3.2.1.7) và hoạt tính fructosyltransferase (FTS) (EC 3.2.1.26) hoặc chỉ cần có hoạt tính của FTS và sử dụng ở thể tự do Chế phẩm enzyme có hoạt tính endo-inulinase là endo-inulinase Novoenzyme 960 và có hoạt tính FTS là Pectinex Ultra SP-L cả hai chế phẩm này đều được cung cấp bởi Novozymes

- Việc phối trộn sẽ dừng lại khi hàm lượng FOS đạt ít nhất 45 wt.% của tổng lượng carbohydrate trong hỗn hợp Nhiệt độ cho quá trình này là từ 400

C cho đến 750C Lượng sucrose được xử lý nằm trong khoảng từ 500 đến 500.000

kg trong một ngày Trong giai đoạn này nước sẽ được cộng vào để giúp cho hỗn hợp chịu đựng được với chế độ xử lý nhiệt UHT Sử dụng UHT để bảo đảm không có vi sinh vật gây bệnh tồn tại trong hỗn hợp, đặc biệt là

Staphilicoccus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfrigens, Clostridium botulinum, Salmonella và Listeria Vi sinh vật gây hại này được thử phản ứng

màu bằng cách nuôi trên môi trường VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) sau 24h ở 370C Thời gian phối trộn tốt nhất nằm trong khoảng từ 12 đến 36 giờ Thời gian phản ứng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm đôi lúc cần bổ sung thêm lượng enzyme

- Có thể bất hoạt enzyme hoặc không

- Kiểm tra thành phần FOS thu được nhờ kỹ thuật HPLC (sắc ký lỏng cao áp) Qua ba bước: tiệt trùng (UHT), Lọc màng để đảm bảo điều kiện tiệt trùng và gia nhiệt giữa từ 850C tới điểm sôi của hỗn hợp FOS

 Sản xuất FOS cao độ từ sucrose bằng cố định tế bào[38]

Những phỏt triển gần đõy trong ngành cụng nghệ enzyme đó cú thể sản xuất ra FOS ở quy mụ lớn Trờn thực tế, cú thể sản xuất FOS nhờ enzyme tổng hợp theo hai hướng: thứ nhất dựng hệ thống enzyme tự do, và thứ hai là dựng enzyme hay tế bào VSV cố định

Nhưng trong phạm vi nghiờn cứu, sẽ trỡnh bày quy trỡnh cụng nghệ tổng hợp FOS nhờ cố định tế bào (sử dụng FTS và bổ sung thờm GOD) Enzyme FTS tốt nhất là

sản phẩm từ cỏc chủng nấm sợi A.niger, A.japonicus, Aureobasidium pullulan

Quy trỡnh cụng nghệ tổng hợp FOS được trỡnh bày chi tiết bờn dưới hỡnh 1.11[38]

Thuyết minh quy trỡnh:

 Sản xuất enzyme:

Cỏc chủng nấm sản xuất FTS được nuụi trong mụi trường hiếu khớ, cỏc điều kiện lờn men như nhiệt độ, pH, sự khuấy đảo… cũn tựy thuộc ào từng chủng nấm Thành phần dinh dưỡng chứa sucrose là nguồn cacbon tốt nhất cho cả sự phỏt triển của tế bào

và hoạt động sản xuất enzyme Nhiệt độ tối ưu cho sự phỏt triển thường khoảng 30oC

và pH trờn 5

Sử dụng mụi trường lỏng tối ưu cho nuụi cấy A.oryzae bổ sung sucrose và dịch

trớch nấm men (đó được mụ tả bởi Rao và cộng sự, 2005); giỳp sản xuất enzyme dễ hơn

và cú chi phớ thấp

 Cố định tế bào: được tiến hành theo những nguyờn tắc nờu trong phần cố định tế bào mục 1.1.6.1.5

 Bổ sung enzim glucooxydaza (GOD) sản xuất FOS cao độ:

Đặc tính của enzim GOD

Các nghiên cứu về cấu tạo vμ đặc tính của enzim GOD đã được A Crueger vμ W.Crueger thực hiện năm 1990 Các tác giả đã kết luận enzim GOD lμ hợp chất glucoprotein, có phân tử lượng khoảng 155 X 103 DA GOD chứa 2 phân tử FAD vμ 16% khối lượng phân tử lμ hydratcacbon ( mannoza, galactoza vμ glucosamine dưới dạng N-acetyl) Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia xúc tác vμ cấu tạo của nó cho tới nay cũng chưa được nghiên cứu rõ rμng

Hình 1.11 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ ở quy mô công nghiệp[38]

Sản xuất enzyme

FOS 90%

FOS≥95%

Cố định tế bào

 Enzim GOD sinh tổng hợp từ A niger có cấu tạo bởi 583 axit amin Điểm

đẳng điện của enzim nμy lμ pH 4.2 [19] Enzim GOD có tính đặc hiệu rất cao, chỉ cần một thay đổi nhỏ trong cấu trúc thì hoạt lực oxy hóa của enzim đã

khác hẳn nhau, ví dụ gốc glucoza trong phân tử enzim ở dạng β - D glucoza

có hoạt tính oxy hóa mạnh hơn α - D glucoza 157 lần [27] Enzim GOD còn

có một đặc tính quan trọng lμ rất an toμn về mặt thực phẩm

Cơ chế xúc tác của enzim GOD

Hỡnh 1.12 Quỏ trỡnh oxy húa glucose dưới tỏc dụng của enzyme GOD [7]

Theo phương trình phản ứng ta thấy, đầu tiên glucoza dưới tác dụng của enzim GOD bị oxy hoá tạo thμnh β-D-glucolacton, sau đó tự phân thμnh axit gluconic Sự tạo thμnh axit gluconic sẽ lμm giảm pH của môi trường, nên trong quá trình phản ứng phải

đồng thời bổ sung kiềm để điều chỉnh pH (phương pháp potentionmetric)

 Cơ chất

Sucrose là nguồn cơ chất tự nhiờn cho FTS Ảnh hưởng của nồng độ sucrose được nghiờn cứu để hạn chế tối thiểu phản ứng thủy phõn Năng suất tối đa sản xuất FOS đạt được khi nồng độ nguồn sucrose ban đầu là 55 Brix

Ngoài ra, cũng cú nghiờn cứu cho thấy nồng độ cao của syro sucrose thực phẩm thương mại (60-70 Brix) nờn được sử dụng cho cả quy trỡnh sản xuất FOS liờn tục hay

theo mẻ Nồng độ syro sucrose cao có lợi, làm hoạt động của nước thấp, tránh phản ứng thủy phân; như vậy sẽ tốt cho tổng hợp FOS

FOS thực phẩm được sản xuất từ đường sucrose thực phẩm tinh khiết Trong sản xuất theo mẻ sử dụng enzyme tự do đã được Shin và cộng sự mô tả: sản xuất được 166g/l FOS từ 360 g/l đường

 Tổng hợp FOS

Vì tổng hợp FOS từ hệ enzyme tự do nên quy mô sản xuất là theo mẻ Nếu có sử dụng enzyme hoặc tế bào cố định việc sản xuất FOS có thể thực hiện lên men liên tục

Lên men theo mẻ:

Enzyme FTS được tạo dịch treo trong syro sucrose cao độ (55- 70 Brix) và ủ ở

55 - 60oC trong 20- 25h có khuấy động nhẹ Tuy nhiên, sản xuất theo mẻ dùng enzyme vẫn có những nhược điểm: enzyme dễ bị phá hủy hoặc bị hao hụt theo dòng sản phẩm, sản phẩm có lẫn enzyme làm quá trình tinh sạch tốn kém hơn Kết quả là phải mất một chi phí cao cho sản xuất một đơn vị sản lượng FOS Với sự tiến bộ của kĩ thuật, dùng phương pháp sản xuất liên tục có nhiều ưu điểm hơn và kinh tế hơn

Trong quy trình sản xuất FOS bởi FTS có vấn đề chính là ngoài sản phẩm FOS sinh ra còn có glucose và lượng sucrose dư Tại bước sản xuất cuối cùng, thu được lượng tối đa là 55 – 60% FOS trong tổng số chất khô Vài tác giả đã tập trung nghiên cứu phương pháp tạo FOS nồng độ cao Vì vậy việc bổ sung GOD được thực hiện, GOD sẽ chuyển glucose thành acid gluconic, nồng độ glucose sẽ giảm đi trong quá trình tổng hợp FOS; nhờ vậy nồng độ FOS tăng lên đến 90% ( Jung và cs.,1993)

 Tinh sạch sản phẩm FOS:

FOS 90% muốn đạt nồng độ cao hơn nữa ta dùng phương pháp phân tách sắc kí Gần đây, Vankova và cs., 2008, đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình phân tách tinh sạch FOS Một chất trao đổi cation phân tách saccharide (AmberliteTM 1320 Ca, Rhom Has company, France) dựa trên khung poly (styrene- divinylbenzene) với nhóm chức năng –(SO3) 2Ca2+ đã được sử dụng nhờ phương pháp tinh sạch này mà dịch FOS sau sắc kí chỉ chứa ít hơn 5% lượng monosaccharide và disaccharide Làm tăng năng suất FOS lên hơn 90%

 Cô đặc:

Làm bay hơi sản phẩm phản ứng được thực hiện bởi quy trình truyền thống cô đặc sucrose, tạo syrup khô tinh khiết Hệ thống lọc cũng được sử dụng để làm cô đặc sản phẩm

 Tiệt trùng

Có thể dùng tia cực tím hoặc lọc tiệt trùng Để tránh tạo màu ảnh hưởng sản phẩm, việc lọc nhiệt độ cao không được đề xuất Hiện nay kỹ thuật tiệt trùng UHT vẫn

đảm bảo chất lượng cảm quan và tiệt trùng hiệu quả UHT tuy tiệt trùng ở nhiệt độ cao nhưng chỉ trong thời gian ngắn

1.2.6.2 Inulin

1.2.6.2.1 Nguồn gốc

Inulin được chiết tách từ thực vật trong tự nhiên thuộc họ Composithae ví dụ

như rau diếp xoăn, ở dạng không phân nhánh thường được tách chiết từ rễ Loại inulin này có đơn phân là glucose, fructose, sucrose Mức độ polymer hoá (DP) của inulin từ rau diếp xoăn từ 2 đến 60 với giá trị polymer hoá trung bình (DPav) là 12 Sở dĩ có chỉ

số polymer hoá trung bình vì inulin có nguồn gốc thực vật thường là một hỗn hợp có mức độ polymer hoá khác nhau, ví dụ có 10% inulin từ rau diếp xoăn có chỉ số DP từ 2(F2) đến 5(GF4) [29]

1.2.6.2.2 Cấu tạo Inulin có công thức cấu tạo: C6nH10n+2O5n+1

Hình 1.13: Cấu trúc hoá học của inulin[29]

Inulin là một polymer mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân là fructose, các monomer này liên kết với nhau bằng liên kết -(2-1) glycosidic, và mạch polymer thường tận cùng bằng gốc glucose [29]

Inulin tận cùng bằng gốc glucose được gọi là

alpha-D-glucopyranosyl-[beta-D-fructofuranosyl] (n-1) -D-fructofuranosides (GpyFn)