Tiểu Luận Mẫu sinh lưỡng bội nhân tạo ở cá chép

Khái niệm mẫu sinh: - Mẫu sinh Gynogenesis là một hình thức hiếm thấy của sinh sản hữu tính, ở đây để cho trứng bắt đầu phát triển vẫn cần có sự giao phối và thụ tinh nhưng tinh trùng ch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

−−−−−−−−−−−−−−−

BÀI TIỂU LUẬN:

MẪU SINH LƯỠNG BỘI NHÂN TẠO

Ở CÁ CHÉP

Giảng viên hướng dẫn : T.S Nguyễn Hữu Đức

Nhóm học viên thực hiện : Mai Long

Phạm Thị Trang Nguyễn Thị Minh Trâm Hoàng Thị Ánh Nguyệt

Hà Nội – 2013

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1.1 Mô tả hình thái học

1.2 Đặc điểm sinh học

1.3 Đặc điểm sinh sản

II TỔNG QUAN VỀ MẪU SINH

2.1 Khái niệm mẫu sinh

2.2 Các hình thức mẫu sinh

III MẪU SINH LƯỠNG BỘI THỰC NGHIỆM Ở CÁ CHÉP

3.1 Nguyên lý

3.2 Cơ chế gây mẫu sinh lưỡng bội ở cá chép

3.3 Phân tích hậu thế mẫu sinh lưỡng bội

IV ỨNG DỤNG CỦA HÌNH THỨC MẪU SINH Ở CÁ CHÉP

4.1 Tạo các dòng đồng hợp

4.2 Xác định vốn gen

4.3 Vẽ bản đồ gen

4.4 Điều khiển giới tính

4.5 Tạo cá thể tam bội

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I TỔNG QUAN VỀ CÁ CHÉP

- Cá chép (Cyprinus carpio) là một loài cá nước ngọt phổ biến rộng khắp các vùng trên

toàn thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc

- Ở Việt Nam, cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tỉnh phía Bắc Việt Nam Cá có nhiều dạng hình như: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép

đỏ, chép lưng gù, chép thân cao, chép Bắc Kạn… là loài cá có giá trị kinh tế cao

Hình 1 Một số loài cá chép ở Việt Nam

I.1 Mô tả hình thái học:

- Cá chép có hình thoi, mình dây, dẹp bên Viền lưng con, thuôn hơn viên bụng Đầu cá thuôn, cân đối Mõm tù Có hai đôi râu: Râu mõm ngắn hơn đường kính mắt, râu góc hàm bằng hoặc lơn hơn đường kính mắt Mắt vừa phải ở hai bên, thiên về phía trên của đầu Khoảng cách giữa hai mắt rộng và lồi Miệng ở mút mõm, hướng ra phía trước, hình cung khá rộng, rạch miệng chưa tới viền mắt Hàm dưới hơi dài hơn hàm trên Môi dưới phát triển hơn môi trên Màng mang rộng gắn liền với eo Lước mang ngắn, thưa Răng hầu phía trong là răng cấm, mặt nghiền có vân rãnh rõ

- Khởi điểm của vây lưng sau khởi điểm vây bụng, gần mõm hơn tới gốc vây đuôi, gốc vây lưng dài, viền sau hơi lõm, tia đơn cuối là gai cứng rắn chắc và phía sau có răng cưa Vây ngực, vây bụng và vây hậu môn ngắn chưa tới các gốc vây sau nó Vây hậu môn viền sau lõm, tia đơn cuối hoá xương rắn chắc và phía sau có răng cưa Hậu môn

ở sát gốc vây hậu môn Vây đuôi phân thuỳ sâu, hai thuỳ hơi tầy và tương đối bằng nhau

- Vẩy tròn lớn Đường bên hoàn toàn, chạy thẳng giữa thân và cuống đuôi Gốc vây bụng có vẩy nách nhỏ dài Lưng xanh đen, hai bên thân phía dưới đường bên vàng xám, bụng trắng bạc Gốc vây lưng và vây đuôi hơi đen Vây đuôi và vây hậu môn đỏ

da cam

I.2 Đặc điểm sinh học:

- Cá chép sống ở tầng đáy cá vực nước, nơi có nhiều mùn bã hữu cơ, thức ăn đáy và cỏ nước Cá có thể sống được trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt, chịu đựng được nhiệt độ từ 0 - 400C, thích hợp ở 20 - 270C Cá có thể sống trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt Cá chép ăn tạp, thiên về ăn động vật không xương sống ở đáy Thức ăn

của cá khá đa dạng như mảnh vụn thực vật, rễ cây, các loài giáp xác (Copeporda, Decaporda, Gatstropoda), ấu trùng muỗi, ấu trùng côn trùng, thân mềm Tuỳ theo

kích cỡ cá và mùa vụ dinh dưỡng mà thành phần thức ăn có sự thay đổi nhất định Ngoài thức ăn tự nhiên có trong thuỷ vực thì cá còn ăn thức ăn nhân tạo như cám nổi

- Nó thích môi trường nước rộng với dòng nước chảy chậm cũng như có nhiều trầm tích thực vật mềm (rong, rêu) Là một loại cá sống thành bầy, chúng ưa thích tạo nhóm khoảng từ 5 cá thể trở lên Nguyên thủy, chúng sinh trưởng ở vùng ôn đới trong môi trường nước ngọt hay nước lợ với pH khoảng 7,0 - 7,5, độ cứng của nước khoảng 10,0

- 15,0 dGH và khoảng nhiệt độ lý tưởng là 3 - 24 °C

I.3 Đặc điểm sinh sản:

- Là loài cá đẻ trứng nên một con cá chép cái trưởng thành có thể đẻ tới 300.000 trứng trong một lần đẻ Cá bột bị nhiều loài cá ăn thịt khác săn bắt, chẳng hạn cá chó (Esox lucius) và cá vược miệng to (Micropterus salmoides).

- Sức sinh sản của cá lớn, khoảng 150.000 - 200.000trứng/kg cá cái Mùa vụ sinh sản kéo dài từ mùa xuân đến mùa thu nhưng tập trung nhất vào các tháng xuân - hè khoảng tháng 3 - 6 và mùa thu khoảng tháng 8 - 9 Trứng cá chép ở dạng dính.Trứng

cá sau khi đẻ bám vào thực vật thuỷ sinh Ở các sông cá thường di cư vào các bãi ven sông, vùng nhiều cỏ nước Cá thường đẻ nhiều vào ban đêm, nhất là từ nửa đêm đến lúc mặt trời mọc hoặc đẻ nhiều sau các cơn mưa rào, nước mát

II TỔNG QUAN VỀ MẪU SINH

2.1 Khái niệm mẫu sinh:

- Mẫu sinh (Gynogenesis) là một hình thức hiếm thấy của sinh sản hữu tính, ở đây để cho trứng bắt đầu phát triển vẫn cần có sự giao phối và thụ tinh nhưng tinh trùng chỉ

có vai trò hoạt hóa, kích thích trứng phát triển, nhân của tế bào sinh dục đực (hay nhân của tinh trùng) sau đó bị thoái hóa hoàn toàn và phát triển chỉ diễn ra dưới sự kiểm soát nhân của của tế bào sinh dục cái (hay nhân của tế bào trứng)

- Mẫu sinh bao gồm hai hình thức mẫu sinh tự nhiên và mẫu sinh nhân tạo (hay mẫu sinh thực nghiệm)

2.2 Các hình thức mẫu sinh:

2.2.1 Mẫu sinh tự nhiên:

- Là hình thức sinh sản bình thường thấy trong tự nhiên của một số ít loài, đặc biệt rõ

rệt là ở cá diếc bạc Carassius auratus gilbelio Bloch và một số dạng thuộc họ Poecilidae.

- Mẫu sinh tự nhiên được Hubbs phát hiện năm 1932 ở loài cá vược đẻ con Mollienesia Formosa ( hay Poecilia Formosa, họ Poecilidae).

- Hiện tượng mẫu sinh tự nhiên được nghiên cứu mạnh mẽ và chi tiết hơn bởi các nhà khoa học trường phái Xô viết những năm sau 1940

- Cơ chế của sinh sản mẫu sinh: Sau khi xâm nhập vào trứng, tinh trùng không biến đổi thành nhân nguyên đực, nó có dạng một khối chất nhiễm sắc và bị loại bỏ trong quá trình phát triển của nhân noãn thành cơ thể mới

Hình 2 Sơ đồ cơ chế mẫu sinh tự nhiên ở cá

2.2.2 Mẫu sinh nhân tạo:

a Gây tạo mẫu sinh:

 Nguyên lý: Thực hiện gây mẫu sinh nhân tạo bằng cách phá hủy cơ cấu di truyền

trong khi vẫn duy trì khả năng thụ tinh của tinh trùng, tức khả năng xâm nhập vào trứng và hoạt hóa trứng phát triển

 Cơ chế: Sử dụng tia phóng xạ: Tia X, tia Radi, tia UV… Để phá hủy vật chất di

truyền của nhân tinh trùng

- Nghiên cứu tác động của tia Rơnghen làm mất hoạt tính của tinh trùng cá chạch đã mở triển vọng sử dụng rộng rãi tia Rơnghen trong công tác mẫu sinh Trong các thí

nghiệm này, tia Rơnghen thường được sử dụng với các liều tăng dần từ 0,1 kR tới 100

kR và lấy tỷ lệ sống của phôi ở giai đoạn nở làm tiêu chuẩn đánh giá Ở liều chiếu 0,1 – 2,5 kR sự chết của phôi tỷ lệ thuận với cường độ chiếu xạ, điều đó phản ánh mức độ

hư hại của bộ máy di truyền của nhân tinh nặng dần và khi kết hợp với nhân trứng sẽ cho ra cơ thể có sức sống yếu Tuy nhiên tăng từ 3 kR trở lên, sức sống phôi lại tăng dần và đạt tới 100% do vật chất di truyền của tinh trùng bị phá hủy hoàn toàn Hiện tượng đó gọi là hiệu ứng Hertwig

- Hiệu ứng Hertwig do Hertwig phát hiện ra khi nghiên cứu ảnh hưởng của tia phóng xạ Radi lên trứng ếch Hiệu ứng được giải thích như sau: Với liều từ 3 kR cơ cấu di truyền của tinh trùng bị phá hủy hoàn toàn và phát triển được đảm bảo chỉ bằng bộ gen bình thường của trứng, do đó sức sống tốt hơn Ở liều từ 7 kR trở lên thì 100% số nhân tinh trùng bị phá hủy hoàn toàn, chúng không thể kết hợp với nhân của trứng và tham gia vào phát triển được, chỉ còn khả năng hoạt hóa trứng Cũng trong nghiên cứu này, khả năng thụ tinh của tinh trùng còn giữ nguyên cho tới liều 200 kR và cao hơn nữa

 Kết quả:

- Khi nhân tinh bị phá hủy hoàn toàn, sau thụ tinh, trứng sẽ phát triển chỉ với bộ gen đơn bội của trứng (trường hợp này gọi là mẫu sinh đơn bội) Phôi đơn bội có sức sống yếu, sau khi nở ít lâu xuất hiện nhiều dấu hiệu bệnh lý mà tập hợp lại gọi là hội chứng đơn bội như phù tim, cong vẹo cột sống… cuối cùng thì chết

- Tuy nhiên trong các phôi mẫu sinh có một tỷ lệ rất thấp các cá thể có sức sống cao, có khả năng phát triển tới giai đoạn trưởng thành Nghiên cứu tế bào học và di truyền học cho biết đó là các cơ thể mẫu sinh lưỡng bội

b Mẫu sinh lưỡng bội thực nghiệm:

 Nguyên lý:

- Để thu nhận mẫu sinh lưỡng vấn đề là phải khởi thảo ra các phương pháp lưỡng bội hóa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của trứng Bằng cách tác động nhiệt độ, choáng nóng hoặc choáng lạnh vào giai đoạn sau thụ tinh người ta có thể nâng tỷ lệ lưỡng bội lên rất nhiều

- Hiệu quả tác động phụ thuộc vào nhiệt độ, thời điểm tác động và độ dài thời gian tác động Choáng lạnh thường tác động với thời gian dài với nhiệt độ từ 0 – 50C Choáng nóng thường tác động với trong thời gian ngắn với nhiệt độ dao động từ 30 – 400C Các nghiên cứu cho thấy với các loài cá ưa nhiệt thường dùng choáng lạnh và cá ưa

lạnh thì dùng choáng nóng Hiệu quả choáng phụ thuộc vào trạng thái nhiễm sắc thể khi bắt đầu tác động

 Cơ chế:

- Sau khi rụng trứng, trứng cá ở metaphase 2 và chứa số lượng đơn bội nhiễm sắc thể Trong những phút đầu tiên sau khi thụ tinh, anaphase 2 xảy ra, và ít lâu sau cơ thể cực thứ hai xuất hiện Phân tích tế bào học đã chỉ ra rằng việc chiếu xạ tinh trùng không ảnh hưởng đến tính hợp lệ của các giai đoạn của sự phân chia phân bào giảm nhiễm thứ hai và chuyển đổi tiếp theo của khu phức hợp đơn bội cái thành nhân nguyên cái

- Quan sát tế bào học các hành vi của đầu tinh trùng được chiếu xạ trong vài phút đầu tiên sau khi thụ tinh đã chứng minh việc loại trừ các vật liệu di truyền đực trong mẫu sinh nhân tạo Đồng thời, nó đã được quan sát thấy rằng sự khác nhau của nhân nguyên đực bị bất hoạt là khác nhau trong mẫu sinh nhân tạo và trong tự nhiên Phân tích tế bào học đã chỉ ra rằng tinh trùng chiếu xạ được bảo tồn và có khả năng biến thành nhân nguyên đực trong vài phút đầu tiên sau khi thụ tinh Vì vậy trong mẫu sinh lưỡng bội nhân tạo, ở một giai đoạn phát triển nhất định, noãn chứa ba tiền nhân (2 tiền nhân cái và 1 tiền nhân nam); và trong mẫu sinh đơn bội, hai tiền nhân (một tiền nhân đực và một tiền nhân cái)

Hình 3 Sơ đồ cơ chế gây mẫu sinh thực nghiệm

 Nhược điểm của mẫu sinh lưỡng bội thực nghiệm là:

- Hậu thế mẫu sinh lưỡng bội có sự thoái hóa cận huyết

- Tỷ lệ chết cao vào lúc nở và chuyển sang kiếm ăn (cá hồi, cá đối, chép và chạch) Khi bắt đầu kiếm ăn có 50% ấu thể chép bị chết

- Tốc độ tăng trưởng chậm hơn cá bình thường

- Thường có dị tật: vẹo thân và dị dạng đầu do đó có kiểu bơi quay tròn đặc trưng

- Có các dị tật về hệ sinh dục: tiêu giảm hay hai bên to nhỏ khác nhau

- Hậu thế của cá mẫu sinh có xu hướng cho lưỡng bội cao (2 – 3.5%)

III MẪU SINH LƯỠNG BỘI THỰC NGHIỆM Ở CÁ CHÉP

III.1 Nguyên lý

- Trứng cá chép sau khi thụ tinh 5 phút bằng tinh trùng đã chiếu xạ tia cực tím và sau đó được đưa vào nước lạnh 40C trong vòng 60 phút

- Phương pháp cho hiệu quả cao của choáng nhiệt là gây choáng với các trứng mới rụng

và toàn bộ trứng đều ở trung kỳ của phân bào 2

- Kết qủa của phương pháp choáng nhiệt này cho tỷ lệ lưỡng bội tạo được là tương đối khả quan

III.2 Cơ chế gây mẫu sinh lưỡng bội ở cá chép

- Ở cuối giai đoạn phân bào giảm nhiễm lần 2, do có choáng nhiệt, thể cực thứ hai tạo nên không tách hẳn khỏi trứng, hai cụm thể nhiễm sắc vẫn liên hệ với nhau qua các tơ của thoi vô sắc, sau đó hai cụm thể nhiễm sắc dần dần kéo lại gần nhau và hình thành một nguyên nhân cái và chìm sâu dần vào tế bào chất của trứng Như vậy, sự lưỡng bội hóa ở đây là do sự kết hợp nhân đơn bội của trứng với nhân đơn bội của thể cực thứ hai

Hình 4 Sơ đồ cơ chế gây mẫu sinh lưỡng bội

- Phân tích tế bào học quá trình thụ tinh cho biết là sau khi xâm nhập vào trứng, nhân tinh trùng đã chiếu xạ cũng hình thành nên nhân nguyên đực, nhưng các thể nhiễm sắc đực hư hại bị loại bỏ hết Trung tử do tinh trùng đưa vào đảm bảo cho việc hình thành thoi phân chia phân cắt thứ nhất, trong thoi này chỉ có thể nhiễm sắc của trứng, tức là

từ con mẹ

III.3 Phân tích hậu thế mẫu sinh lưỡng bội

- Các phân tích của cơ chế lưỡng bội hóa theo mẫu sinh nhân tạo đã chứng minh rằng, nếu cơ thể cái là dị hợp tử, sự phân ly giữa các cơ thể cái mẫu sinh lưỡng bội là tất yếu Nó được liên kết với sự phân ly ngẫu nhiên của các nhiễm sắc tương đồng trong việc phân chia phân bào giảm nhiễm đầu tiên Với một cơ chế như vậy nếu sự lưỡng bội hóa hoàn toàn đồng hợp tử mẫu sinh lưỡng bội có thể được dự kiến sẽ là một kết quả của sự thống nhất của hai bộ nhiễm sắc thể giống hệt nhau của

- Các thí nghiệm về cá chép đã hoàn toàn xác nhận sự phân ly các thế hệ sau mẫu sinh Thế hệ sau của mẫu sinh được thu thập từ cá chép cái có 4 kiểu hình do 6 kiểu gen

quy định Vảy toàn thân ( và ), vảy đốm (), vảy sọc ( và ) và trần (không vảy ) Kiểu gen không có sức sống bị chết.

- Một câu hỏi đặt ra là: Làm thế nào để có thể thống nhất giữa thể cực thứ hai và nhóm telophasic cái, sau đó tách ra trong sự phân chia phân bào thứ hai của quá trình phân

bào giảm nhiễm, kết quả là tạo ra sự xuất hiện của cơ thể dị hợp tử? Nguyên nhân của hiện tượng này có thể xảy ra nhất là qua trao đổi chéo của hai nhiễm sắc tử chị em không bivalent, đã diễn ra trong sự phân chia phân bào giảm nhiễm đầu tiên Trong trường hợp này, trong các locus trong đó trao đổi diễn ra, mỗi gen tương đồng trở nên

dị hợp tử, và thay vì ban đầu và , cả hai gen tương đồng trở thành Trong trường hợp

có sự khác nhau của các tương đồng trong việc phân chia đầu tiên của phân bào giảm nhiễm, các nhóm tương tự của và là phân biệt, trong lần thứ hai, các nhiễm sắc tử với loci N và n được tách biệt Trong trường hợp của mẫu sinh lưỡng bội nhân tạo, loci N

và n được tổ hợp lại và phục hồi các trạng thái dị hợp tử xảy ra Nó là khá rõ ràng rằng đó là một tái tổ hợp liên quan đến tất cả các locus theo trao đổi chéo Các dị hợp

tử của gen S đã được chứng minh sau khi lai giữa cá thể cái mẫu sinh có kiểu hình vảy sọc với cá thể đực có kiểu hình vảy đốm Nếu cá thể mẫu sinh cái đồng hợp tử gen S,

có thể cho ra các thế hệ sau thu được cá thể dị hợp tử bằng cách lai với cá thể đực có kiểu hình vảy sọc hoặc vảy đốm Tuy nhiên, ở cá chép bốn kiểu gen, đó là bằng chứng của dị hợp tử của gen S ở cá thể mẫu sinh cái

- Dữ liệu thu được đã bác bỏ giả định trước đó rằng mẫu sinh thế hệ sau thu được bằng cách gây mẫu sinh nhân tạo hoàn toàn đồng hợp tử Nó đã được quan sát thấy trong các dạng tương đồng vượt qua giới hạn xảy ra trong sự phân chia phân bào giảm nhiễm đầu tiên

IV ỨNG DỤNG CỦA HÌNH THỨC MẪU SINH Ở CÁ CHÉP

IV.1 Tạo các dòng đồng hợp

Hình 5 Các kiểu vảy của cá chép

a Vảy toàn ( và )

b Vảy đốm ( )

c Vảy sọc ( và )

d Vảy trần hay không vảy ( )

- Mẫu sinh lưỡng bội có triển vọng ứng dụng trong việc tạo các dòng đồng hợp để phục

vụ cho công tác lại tạo

- Bằng cách lai cận thân qua nhiều thế hệ (7 – 8 thế hệ) có thể đạt độ đồng hợp cần thiết Đối với loài chậm thành thục thì công việc này đòi hỏi một thời gian rất dài

- Theo cơ chế tế bào học thì ngay thế hệ thứ nhất của mẫu sinh lưỡng bội đã đạt được

độ đồng hợp 100% Tuy nhiên hiện tượng trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc tử đã tạo

ra một tỷ lệ dị hợp tử nhỏ và đồng thời làm giảm độ đồng hợp đi

- Phương pháp mẫu sinh lưỡng bội cho phép thu nhận các dòng đồng hợp với hệ số cận phối tới 0,6 – 0,7 và chỉ cần 2 – 3 thế hệ mẫu sinh là đạt đến mức độ cận phối lý tưởng

- Ngay trong thế hệ mẫu sinh đầu tiên đã có sự đa dạng di truyền và quá trình chọn lọc

có thể giúp ta có được các dòng mong muốn cần thiết, loại bỏ được hàng loạt các alen lặn có hại

- Có thể tạo được các dòng đồng hợp đực thông qua biến đổi giới tính các cá thể cái mẫu sinh thực nghiệm bằng một số loại hormon: MT (17α – Methyl Testosterone), ET (17 Ethynyl Testosterone) hoặc bằng hình thức phụ sinh

- Phụ sinh (Androgenesis) là sự phát triển của trứng có qua thụ tinh nhưng không có sự hòa hợp vật chất di truyền của nhân đực và nhân cái mà khi nhân đực xâm nhập vào trứng thì nhân nguyên cái bị thoái hóa và tiêu biến, chỉ có nhân nguyên đực phát triển tạo cơ thể mới

IV.2 Xác định vốn gen

- Do hai nhiễm sắc thể trong cặp tương đồng là hoàn toàn giống nhau nên tất cả các gen lặn đều biểu hiện ngay mà không cần phải tiến hành lai phân tích Điều này giúp chúng ta rất nhiều trong công tác đánh giá vốn gen trong các điều kiện ngoại cảnh khác nhau

IV.3 Vẽ bản đồ gen

- Trong các thế hệ sau của mẫu sinh mọi trường hợp trao đổi chéo đều được phát hiện ngay Tần số trào đổi chéo tỷ lệ với khoảng cách từ gen tới tâm động do đó ta có thể xác định được vị trí tương đối của chúng trên nhiễm sắc thể

IV.4 Điều khiển giới tính

- Mẫu sinh lưỡng bội còn là phương pháp điều khiển giới tính có hiệu quả trong việc tạo ra các cá thể toàn cái Các con mẫu sinh lưỡng bội là toàn bộ là cá thể cái