Hermanson [20] đã nghiên cứu phản ứng của EDC hình thành liên kết amide trong dung dịch nƣớc sử dụng các phân tử cacboxylate đóng góp một một nhóm hoạt hóa và athylene diamine hoặc benzylamine nhƣ một nhóm chức năng để tạo liên kết. Kết quả của họ đã chỉ ra rằng, việc hoạt hóa nhóm carboxyl xảy ra hiệu quả nhất với EDC tại pH 3,5 – 4,5 trong khi liên kết amide đƣợc hình thành hiệu quả nhất trong phạm vi pH 4,0 – 6,0. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sự thủy phân EDC xảy ra tối đa ở giá trị pH có tính acid với sự ổn định ngày càng tăng của carbodiimide trong dung dịch có pH bằng hoặc trên 6,5. Và quan trọng là khi tiến hành thí nghiệm với các chất là protein hoặc peptids thì nhóm tác giả cho thấy sự hình thành liên kết amide qua cầu nối trung gian EDC xảy ra hiệu quả nhất trong khoảng pH 4,5 – 7,5. Ngoài khoảng pH này thì sự hình thành liên kết vẫn xảy ra nhƣng với tốc độ rất chậm và hiệu quả không cao. Hai loại đệm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là đệm MES và đệm PBS.
Áp dụng nghiên cứu của tác giả trên, chúng tôi quyết định chọn 2 loại đệm với các vùng pH khác nhau để tiến hành thử nghiệm gắn kết hạt từ amine với kháng thể kháng lao qua cầu nối trung gian EDC. Đệm MES đƣợc sử dụng với ba pH khác nhau pH 4,5; pH 5,5; pH 6,5 và đệm PBS đƣợc sử dụng với hai pH khác nhau là pH 6,5 và pH 7,4.
Cùng với việc lựa chọn loại đệm với pH thích hợp, chúng tôi cũng tiến hành thí nghiệm với tỷ lệ giữa kháng thể và EDC (v/v) khác nhau nhằm mục đích xác định tỷ lệ thích hợp nhất và cho hiệu quả gắn hạt cao nhất. Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 Bảng 3.2. Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết STT Các thành phần Tổng thể tích (µl) Đệm gắn kết (µl) Kháng thể (µl) EDC (µl) 1. 74 0,5 0,5 75 2. 73,5 0,5 1,0 3. 72,5 0,5 2 4. 70,5 0,5 4 5. 73,5 1,0 0,5 6. 73 1,0 1,0 7. 72 1,0 2 8. 75 1,0 4 9. 72,5 2 0,5 10. 73 2 1,0 11. 71 2 2 12. 69 2 4
50 µl hạt NP-NH2 sau khi đƣợc rửa hai lần bằng đệm và hút bỏ dịch trong, đƣợc bổ sung các thành phần với tỷ lệ nhƣ trên. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong khoảng 30 phút. Kết quả thử nghiệm các tỷ lệ (v/v) khác nhau của thành phần tham gia phản ứng gắn kết cho chúng tôi thấy rằng tỷ lệ đệm gắn kết : kháng thể : EDC = 71 : 2 : 2 cho kết quả tốt nhất, độ ổn định và tính lặp lại cao nhất khi sử dụng với những loại đệm khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi đã quyết định chọn tỷ lệ này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Mặc dù mô hình phức gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao tại 2.2.2 và làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR tại 2.2.3 dựa trên nguyên tắc đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể có tính đặc hiệu rất cao nhƣng nhƣợc điểm của quy trình là không đánh giá đƣợc mức độ gắn kết giữa các thành phần tham gia phản ứng, chƣa xác định đƣợc loại đệm nào sẽ giúp cho việc gắn kết đạt hiệu suất cao nhất. Chính vì vậy, chúng tôi đã xây dựng quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt khi sử dụng 5 loại đệm gắn kết khác nhau là MES pH 4,5; pH 5,5; pH 6,5 và PBS pH 6,5; pH 7,4 dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Dot blot.
Hạt từ sau bƣớc “Sƣ̉ dụng hạt từ để thu nhận vi khuẩn lao từ mẫu BCG ” tại 2.2.3 đƣợc xem là đối tƣợng đánh giá. Cần lƣu ý rằng, trƣớc đó 5 quy trình sử dụng 5 loại đệm khác nhau đã đƣợc tiến hành. Hình 3.2 biểu thị các bƣớc đánh giá mức độ gắn của hạt trên các đệm khác nhau.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Một phần dịch BCG thực hiện phản ứng Dot blot nhƣ quy trình 2.2.1, kết quả của phần dịch BCG này cho thấy một lƣợng không đáng kể kháng thể gắn kết bị kéo theo dịch BCG bị loại bỏ. Trong khi đó, tất cả các dịch thu đƣợc từ quy trình trên đều đƣợc chấm lên màng và thử phản ứng màu với thuốc thử. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt
Dịch BCG: Dịch thu được sau 45 phút ủ phức hạt với vaccine BCG; Dịch S: Dịch thu được sau khi ủ phức hạt với kháng thể thứ cấp; Dịch W: Dịch thu được sau khi rửa hạt bằng đệm PBS 1x 7,4 có 0,05% Tween20; Dịch E: Dịch thu được sau khi cân bằng hạt bởi đệm AP; Dịch B: Dịch thu được sau khi hạt được thử màu bằng thuốc thử NBT/BCIP
Kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể lên hạt (hình 3.3) cho thấy rằng tất cả các đệm gắn kết đƣợc sử dụng đều có hiệu quả mặc dù mức độ gắn kết là khác nhau thể hiện ở độ đậm không giống nhau của các đốm tròn trên màng lai.
Sử dụng phần mềm Image J để đánh giá mức độ đậm hay nhạt của từng phân đoạn của mỗi loại đệm gắn kết qua đó nhận định đƣợc hiệu suất gắn kết giữa hạt nano từ với kháng thể kháng lao, chúng tôi đã có kết quả trình bày ở bảng 3.3.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Bảng 3.3. Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J
Tên phân đoạn Đệm MES pH 4,5 Đệm MES pH 5,5 Đệm MES pH 6,5 Đệm PBS pH 6,5 Đệm PBS pH 7,4 Dịch BCG 1% 1% 1% 4% 1% Dịch S 29% 26% 27% 24% 26% Dịch W 20% 20% 18% 17% 19% Dịch E 19% 16% 14% 12% 15% Dịch B 31% 37% 40% 41% 39%
Kết quả thu đƣợc (bảng 3.3) cho thấy hiệu suất gắn kết giữa hạt nano từ với kháng thể kháng lao dao động từ 31% đến 41%, trong đó cao nhất là đệm PBS pH 6,5 với 41%, tiếp theo là đệm MES pH 6,5; PBS pH 7,4; MES pH 5,5 với các tỷ lệ tƣơng ứng lần lƣợt là 40%, 39%, 37% và thấp nhất là đệm MES pH 4,5 với 31%. Qua nhiều lần lặp lại với kết quả tƣơng tự, chúng tôi quyết định sử dụng 3 loại đệm chính cho các thí nghiệm tiếp theo đó là đệm MES pH 6,5; PBS pH 6,5 và PBS pH 7,4.