Nhằm mục đích chứng minh tính đặc hiệu của phƣơng pháp đối với vi khuẩn lao chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm các quy trình 2.2.2 và 2.2.3 trong các điều kiện tối ƣu với các vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus và Pseudomonas. Vi khuẩn
Bacillus licheniformic và vi khuẩn Pseudomonas pseudoalicaligenes đƣợc nuôi trong môi trƣờng Luria Bertani với thành phần dinh dƣỡng thích hợp [26, 30]. Dung dịch chứa vi khuẩn sau đó đƣợc dùng làm mẫu thí nghiệm.
Hỗn hợp phức hệ hạt nano từ cùng với 71 µl đệm PBS pH 6,5, 2 µl EDC, 2 µl kháng thể anti-TB đƣợc ủ ở 22oC trong 30 phút. Phức hệ hạt sau khi loại bỏ dịch trong sẽ đƣợc bổ sung 25 µl mỗi mẫu thí nghiệm: dịch vaccine BCG, dịch nuôi
Bacillus licheniformic và cuối cùng là dịch Pseudomonas pseudoalicaligenes. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 45 phút, sau đó tập trung hạt từ và bổ sung 25 µl đệm TE, tiến hành ly giải 20 phút tại 100oC. Sản phẩm đƣợc tiến hành PCR và điện di trên gel agarose 2%.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Hình 3.7. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu
Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1 : Mẫu vaccine BCG
Giếng 2 : dung dịch chứa vi khuẩn Bacillus licheniformic
Giếng 3 : dung dịch chứa vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes
Nhƣ chúng ta đã biết, cả hai chủng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu khí,
B. lichenifocmic là vi khuẩn gram dƣơng còn P. pseudoalcaligenes là vi khuẩn gram âm. Đây cũng là hai chủng vi khuẩn điển hình trong nghiên cứu vi sinh vật [26, 30]. Kết quả điện di sản phẩm PCR để đánh giá độ đặc hiệu của hƣơng pháp (hình 3.7) cho thấy ở mẫu vaccine BCG xuất hiện băng rõ nét tƣơng đƣơng với đối chứng dƣơng có kích thƣớc 249 bp, trong khi đó đối chứng âm và các mẫu vi khuẩn B.
lichenifocmic và P. pseudoalcaligenes không thấy xuất hiện băng ADN. Điều này chứng tỏ phƣơng pháp có tính đặc hiệu đối với vi khuẩn lao.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012