Phức hệ hạt sau khi gắn kết đƣợc bổ sung 25 µl vaccine BCG (10-3 mg/ml), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 45 phút. Tiếp theo tập trung từ trên giá nam châm và hút bỏ dịch BCG. Sau đó bổ sung 25 µl thể tích đệm và tiến hành các cách ly giải khác nhau để thu nhận ADN, ADN đã tách chiết đƣợc làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 2%.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Hình 3.4. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác nhau
Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1, 2, 3 : phương pháp ly giải 1, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS 6,5 và PBS 7,4
Giếng 4, 5, 6 : phương pháp ly giải 2, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS 6,5 và PBS 7,4
Giếng 7, 8, 9 : phương pháp ly giải 3, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS 6,5 và PBS 7,4
Giếng 10, 11, 12 : phương pháp ly giải 4, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS 6,5 và PBS 7,4
Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.4) cho thấy mẫu ADN tách chiết đƣợc nhân lên qua PCR xuất hiện băng có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho vi khuẩn lao, đối chứng âm không cho băng ADN nào, có nghĩa là sử dụng quy trình 2.2.2 và 2.2.3 đã cho phép thu nhận đƣợc ADN của vi khuẩn lao. Bên cạnh đó, qua hình 3.4 cũng thể hiện hiệu quả thu nhận ADN của các phƣơng pháp ở 2.2.4 là khác nhau và ngay cả trong một phƣơng pháp ly giải thì hiệu quả thu nhận ADN cũng khác nhau khi sử dụng các đệm khác nhau. Trong 4 phƣơng pháp ly giải mà chúng tôi sử dụng
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
thì phƣơng pháp 1 và phƣơng pháp ly giải 4 cho hiệu quả thấp nhất, các băng ADN nhân bản xuất hiện không rõ hoặc xuất hiện với mức độ rõ nét không cao ở cả 3 loại đệm MES pH 6,5, PBS pH 6,5; PBS pH 7,5. Trái ngƣợc với điều này, ở phƣơng pháp ly giải 2 và đặc biệt khi sử dụng đệm PBS pH 6,5 ở phƣơng pháp ly giải 3 băng ADN nhân bản xuất hiện rất rõ nét.
Theo nhiều nghiên cứu thì khi tách chiết ADN, trong đệm gần nhƣ bắt buộc phải có EDTA vì đây là chất ức chế của hầu hết các nuclease (do tạo phức càng cua với ion kim loại cần cho hoạt động của nuclease) giúp bảo vệ ADN không bị phân hủy bởi nuclease. Công trình nghiên cứu của Awua A.K. và cộng sự [11] đã khẳng định đệm TE là một đệm rất hiệu quả trong việc chuẩn bị ADN của MTB cho phản ứng PCR. Nghiên cứu cho thấy khi sử dụng phƣơng pháp bổ sung TE và ủ ở nhiệt độ 95oC trong 30 phút thì kết quả PCR đã thành công với cả 3 cặp mồi rpoB/KatG/rrs, trong khi các phƣơng pháp khác nhƣ không sử dụng TE chỉ ủ nhiệt kết quả PCR chỉ thành công với cặp mồi arpsL hoặc bổ sung TE cùng với làm lạnh ở -20oC sau đó mới ủ 95oC hoặc sử dụng TET ủ ở nhiệt độ 95oC không thành công với tất cả các cặp mồi sử dụng. Bên cạnh đó một số nghiên cứu khác nhƣ: Amita J. và cộng sự [9] đã chỉ ra rằng xử lý nhiệt là rất cần thiết để làm phá vỡ các liên kết của các phân tử phospholipid của thành tế bào vi khuẩn lao, kết quả giải phóng ADN vi khuẩn lao ra ngoài dung dịch. Trong nghiên cứu này cũng trích dẫn kết quả của Fiss và cộng sự (1992), Cormican và cộng sự (1992) khẳng định rằng xử lý nhiệt tới 100oC trong bộ đệm thích hợp giúp ly giải ADN của Mycobacterium đạt hiệu suất cao để sử dụng cho phản ứng PCR. Chính vì vậy có thể nói kết quả ly giải với các phƣơng pháp khác nhau đặc biệt là sử dụng đệm ly giải TE và hỗn hợp đƣợc ủ ở 100o
C trong 20 phút với đệm gắn kết ban đầu là PBS pH 6,5 là rất có ý nghĩa, góp phần định hƣớng trọng tâm trong nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi.