Với những thành công đã đạt đƣợc trong việc nghiên cứu, tối ƣu các điều kiện gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC và tìm ra phƣơng pháp hiệu quả nhất để ly giải thu nhận ADN vi khuẩn lao từ mẫu vaccine BCG, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm là đờm lao. Mẫu đờm lao của bệnh nhân bị bệnh lao đƣợc nhận từ Viện Quân y 103. Các mẫu đờm này đã đƣợc Viện 103 chẩn đoán bằng phƣơng pháp soi trực tiếp.
Ứng dụng các điều kiện tối ƣu thu đƣợc từ nghiên cứu trên chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mẫu đờm lao theo sơ đồ hình 3.8 nhƣ sau.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Sau khi thu đƣợc các phần dịch làm khuôn cho phản ứng PCR, ban đầu chúng tôi sử dụng ADN taq polymerase với thành phần phản ứng nhƣ đã trình bày tại bảng 2.2. Tuy nhiên, kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% không xuất hiện băng ở hầu hết các mẫu. Chính vì vậy, chúng tôi đã quyết định sử dụng ADN dream taqTM polymerase thay cho ADN taq polymerase với thành phần phản ứng nhƣ đã trình bày tại bảng 2.3. ADN dream taqTM polymerase là một Taq polymerase tăng cƣờng sự tối ƣu của phản ứng PCR chuẩn, cho phép tăng độ nhạy và sản lƣợng sản phẩm PCR trong cùng một điều kiện phản ứng so với ADN taq polymerase [38].
Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 7 mẫu bệnh lao
Giếng (-) : Đối chứng âm
Giếng M : Thang chuẩn ADN 1 kb Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 : Các mẫu số 1 đến 7
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 5 mẫu bệnh lao
Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1, 3, 5, 7, 9: Các mẫu số 8 đến 12
Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Phần dịch còn lại của các mẫu tương ứng
Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR ở hình 3.9 và 3.10 cho thấy, ở giếng của đối chứng âm ở cả hai hình không có khuôn nên không cho băng sản phẩm PCR, còn giếng đối chứng dƣơng với khuôn là ADN của MTB có băng 249 bp. Ở tất cả các mẫu đƣợc nghiên cứu ở đây thì phần dịch còn lại đều không xuất hiện băng, điều này có thể đƣợc giải thích do trong phần dịch có thể chứa nhiều chất ức chế phản ứng PCR hoặc không chứa ADN vi khuẩn lao. Trong khi đó, các mẫu từ số 1 đến mẫu số 9 đều cho băng ADN có kích thƣớc 249 bp, điều này rất phù hợp với kết quả soi trực tiếp của Viện 103 đó là các mẫu của bệnh nhân dƣơng tính với MTB. Tuy nhiên có một điều đáng lƣu ý là trong số 3 mẫu âm tính với MTB mà chúng tôi tiếp nhận từ Viện 103, mẫu số 10 cũng cho băng ADN có kích thƣớc 249 bp nhƣ với các mẫu dƣơng tính, kết quả lặp lại 4 lần là tƣơng tự. Kết quả này đƣợc
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
chúng tôi ghi nhận và có thể giải thích rằng do phƣơng pháp chúng tôi sử dụng có tính nhạy cao hơn so với phƣơng pháp soi trực tiếp của Viện 103. Và để chứng minh cho điều này thì trong những nghiên cứu trong thời gian tiếp theo, chúng tôi sẽ nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều hơn.
Sau khi thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên các mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tối ƣu thời gian ủ mẫu bệnh phẩm nhằm mục đích tiết kiệm thời gian hoàn thành quy trình. Các khoảng thời gian đƣợc thử nghiệm ở đây là 15 phút, 30 phút và 45 phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.11 dƣới đây.
Hình 3.11. Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao
Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1, 2 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 15 phút Giếng 3, 4 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 30 phút
Giếng 5,6 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 45 phút
Kết quả hình 3.11 đã chỉ ra rằng chỉ cần ủ mẫu đờm lao trong vòng 30 phút đã cho kết quả băng ADN 249 bp, điều này là rất cần thiết cho việc rút ngắn thời gian chẩn đoán bệnh.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012