Đối với các kỹ thuật sinh học phân tử có liên quan tới acid nucleic thì các ứng dụng phụ thuộc rất nhiều vào số lƣợng và chất lƣợng ADN/ARN đƣợc tách chiết. Điều mà bị ảnh hƣởng bởi số tế bào ly giải, lƣợng ADN/ARN phục hồi và sự dƣ thừa của một số chất phản ứng hoặc thuốc thử.
Thành tế bào vi khuẩn lao là một trong những thành tế bào vi sinh vật có cấu trúc phức tạp, điều mà làm cho việc phá vỡ thành tế bào trở lên khó khăn. Nhiều phƣơng pháp ly giải dựa trên việc sử dụng enzyme, sự va đập vào mẫu do tác động của sóng siêu âm tạo ra, hay do sự tác động của nhiệt độ tới tế bào…cho kết quả tách chiết ADN khá tốt nhƣng những phƣơng pháp này lại phụ thuộc khá nhiều vào loại mẫu sử dụng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp ly giải tế bào khác nhau để thu đƣợc lƣợng ADN cần thiết làm khuôn cho phản ứng PCR. Các phƣơng pháp ly giải đƣợc trình bày ở dƣới đây:
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
Phƣơng pháp 1: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung
thêm 25 µl nƣớc cất và trộn đều, sau đó đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Tiếp theo, hỗn hợp hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm và hút dịch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC.
Phƣơng pháp 2: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung
thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó hỗn hợp đƣợc làm đông ở -20oC trong 20 phút. Tiếp đó, hỗn hợp đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châm và hút dịch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC.
Phƣơng pháp 3: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung
thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châm và hút di ̣ch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4o
C.
Phƣơng pháp 4: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung
thêm 25 µl đệm TET (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA và 1% Triton X-100, pH 7,4) và trộn đều, hỗn hợp đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châ m và hút di ̣ch trong sang m ột ống eppendorf, bảo quản ở 4oC.
5 µl mẫu từ mỗi phƣơng pháp ly giải đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp ngay sau đó.