Nguyên tắc của phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch (Dot blot) là dựa
trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể sơ cấp sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ SƠ CẤP – KHÁNG THỂ THỨ CẤP đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thƣờng. Nồng độ của protein cũng nhƣ của dịch nuôi tế bào có thể đƣợc định lƣợng không hoàn toàn thông qua sử dụng phƣơng pháp Dot blot.
Quy trình tiến hành :
- Màng đƣợc cắt với kích thƣớc thích hợp, các ô vuông trên màng đƣợc kẻ bằng bút chì có kích thƣớc 1x1 cm. Sau đó màng đƣợc ngâm trong methanol khoảng 3 – 4 phút, rửa methanol bằng nƣớc cất, để trên giấy thấm và mẫu đƣợc chấm lên bề mặt đƣợc đánh dấu của màng.
- Đầu côn đƣợc dùng để lấy và chấm 2µ mỗi mẫu lên bề mặt màng tại trung tâm của ô kẻ. Dung dịch mẫu thẩm thấu xuống màng thƣờng có đƣờng kính 3 – 4 mm.
- Màng sau khi sấy khô sẽ đƣợc cố định bởi dung dịch BSA 5% trong PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Màng đƣợc rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 để loại bỏ BSA thừa. Màng sau đó đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa 3 lần trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn enzyme photphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20.
- Tiếp đó, cân bằng màng bằng đệm AP (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9,5).
- Các vết chấm đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p-nitro blue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm AP.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012