Nuôi cấy in -vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Nuôi cấy in -vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 2 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2 DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU 5 DANH SÁCH CÁC HÌNH 6 LỜI MỞ ĐẦU 7 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1. GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH 8 1.1.1. Vị trí phân loại: 8 1.1.2. Đặc điểm hình thái: 9 1.1.3. Đặc điểm sinh thái: 10 1.1.4. Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh: 12 1.2. Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 23 1.2.1. Cơ sở khoa học: 24 1.2.2. Các kỹ thuật nuôi cấy 26 1.2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 31 1.2.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 35 1.2.6. Các ứng dụng: 38 1.2.7. Các bước trong nhân giống in – vitro: 39 1.2.8. Ưu – nhược điểm của phương pháp nhân giống in – vitro: 42 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 44 2.1. Nuôi cấy mô sẹo và rễ bất định sâm Ngọc Linh 44 2.1.1. Vật liệu: 44 2.1.1. Môi trường: 44 Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 3 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ: 44 2.1.3. Hóa chất: 44 2.1.4. Qui trình thực hiện 45 2.1.5. Điều kiện nuôi cấy: 45 2.2. Nuôi cấy sinh khối và tạo vi củ sâm Ngọc Linh. 46 2.2.1. Nguyên liệu: 46 2.2.2 Môi trường: 46 2.2.3 Thiết bị và dụng cụ: 46 2.2.4 Hóa chất: 46 2.2.5 Qui trình thực hiện: 46 2.2.6 Điều kiện nuôi cấy: 47 2.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 48 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 D lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định của mẫu cấy 49 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH và Gamborg (B5) 52 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH, B5 55 CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 3.1 Kết luận 57 3.2 Kiến nghị: 58 PHỤ LỤC 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 4 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzylaminopurine NAA α-naphthaleneacetic acid MS Murashige và Skoog SH Schenk và Hildebrandt G5 Gamborg MT Môi trường TDZ N – phenyl – 1,2,3 – thidiazol – 5 yl urea 2,4D Dichlophenolxyl acetic acid Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 5 DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm) Error! Bookmark not defined. Bảng 2: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp. trồng trọt: Error! Bookmark not defined. Bảng 3: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol: Error! Bookmark not defined. Bảng 4: Acid Oleanolic: Error! Bookmark not defined. Bảng 5: Ocotillol: Error! Bookmark not defined. Bảng 6: Các axid béo được tìm thấy: Error! Bookmark not defined. Bảng 7: Thành phần acid amin chủ yếu: Error! Bookmark not defined. Bảng 8: Các nguyên tố vi lượng: Error! Bookmark not defined. Bảng 9: Tác dụng dược lý của nhân sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined. Bảng 10: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121 0 C. Error! Bookmark not defined. Bảng 11: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Error! Bookmark not defined. Bảng 12: Ảnh hường của auxin2,4 - D lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Error! Bookmark not defined. Bảng 13: ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định invitro của Sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH và B5 Error! Bookmark not defined. Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 6 Bảng 14: ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định invitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH, B5 Error! Bookmark not defined. DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined. Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Error! Bookmark not defined. Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50 năm tuổi Error! Bookmark not defined. Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu năm Error! Bookmark not defined. Hình 5: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại Error! Bookmark not defined. Hình 6: Nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined. Hình 7:Rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined. Hình 8: Quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định của sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis) sau 2 tháng nuôi cấy. Error! Bookmark not defined. Hình 9: Sâm Ngọc Linh trên môi trường B5 có bổ sung 7 mg/l NAA sau 30 ngày nuôi cấy. Error! Bookmark not defined. Hình 10: rễ bất định hình thành sau 1 tháng nuôi cấy Error! Bookmark not defined. Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 7 LỜI MỞ ĐẦU Là một vị thuốc bổ đứng hàng đầu trong các vị thuốc bổ, từ xa xưa sâm chỉ được dùng cho các ông hoàng bà chúa, những người lắm tiền nhiều của bởi sự quý hiếm, khó trồng, lâu thu hoạch. Nhưng ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học, từ một số tế bào gốc bằng công nghệ sinh khối tế bào, đã thành công trong việc nuối cấy tế bào sâm Ngọc Linh với số lượng lớn. Cây sâm Ngọc Linh (có tên khoa học là Panax vietnamensis, hay sâm K5, sâm Việt Nam) được Đoàn điều tra dược liệu Khu V do Dược sĩ Đào Kim Long phát hiện lần đầu vào năm 1973 tại huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum). Đây cũng là loài nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới. Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên phân bố chủ yếu chung quanh vùng núi Ngọc Linh (thuộc huyện Trà My, Quảng Nam và Đăk Tô, Kon Tum) ở độ cao 1.500m trở lên. Loại cây này sinh trưởng chậm, phải từ 6 năm trở lên mới có thể sử dụng. Hiện nay, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, tăng sức lực. Khi dùng cho bệnh nhân, phục hồi sức khỏe, bệnh nhân ăn ngon, tăng sức đề kháng đối với những yếu tố độc hại (tăng khả năng chịu các tác nhân stress vật lý, hóa học, sinh học). Để cung cấp nguồn sâm Ngọc Linh cho ngành công nghiệp dược phẩm, bên cạnh việc đầu tư quy hoạch, trồng và bảo tồn sâm Ngọc Linh, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sự ứng dụng của công nghệ sinh học được coi như là một phương pháp tối ưu giúp cải thiện việc nhân giống sâm và tạo ra nguồn vật liệu thô dùng trong y học và các lĩnh vực khác của đời sống. Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trong nuôi trồng sâm in vitro bao Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 8 gồm nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, tái sinh cây và chuyển gen. Phương pháp này có nhiều ưu điểm so với phương pháp truyền thống như quá trình nuôi cấy để thu cây con và sản phẩm thứ cấp không phụ thuộc điều kiện ngoại cảnh (khí hậu, sâu bệnh,…), có thể điều chỉnh được quá trình sản xuất, sản phẩm thu được có hiệu suất cao và chất lượng ổn định hơn. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH 1.1.1. Vị trí phân loại: Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A. Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý. Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên Phân loại sâm Ngọc Linh. - Giới: Plantae - Ngành: Magnoliophyta - Bộ: Apiales Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 9 - Họ: Cam Tùng (Araliaceae) - Chi: Panax - Loài: Panax - Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush - Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng). - Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng. Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh 1.1.2. Đặc điểm hình thái: Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 10 Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường. Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ. Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy. Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt. Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9. Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 11 Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên 1.1.3. Đặc điểm sinh thái: Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0 C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt. Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm. Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973. Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107 o 50’ – 108 o 7’ kinh tuyến Đông và từ 15 o 0’ – 15 o 10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. [...]... Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50 năm tuổi Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu Page 19 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh năm Những nghiên cứu về dược lý lâm sàng của nhân sâm Ngọc Linh được thực hiện tại những đơn vị dưới đây: - Vi n nghiên cứu sức khỏe người cao tuổi, Giáo sư Phạm Khuê và cộng sự - Quân y vi n 175 Thành phố Hồ Chí Minh, Giáo sư Đỗ Đình Luận và cộng sự - Vi n điều... sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non  Chức năng chủ yếu của các cytokinin: - Kích thích phân chia tế bào - Tạo và nhân callus - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô Page 32 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh. .. 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải - 1934: Kogl xác định vai trò của IAA - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan - 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công Page 25 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh - 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật - 1964: Guha và Maheshwari.. .Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh 1.1.4 Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh: 1.1.4.1 Hợp chất saponin: Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Vi t Nam cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các... 5.19 7 Serin 5.12 5.19 8 Acid glutamic 2.05 6.49 9 Prolin 3.07 15.58 10 Glycin 4.10 5.19 11 Alanin - 5.19 12 Cystin 1.53 Vết 13 Valin 0.51 1.29 14 Methionin 0.51 Vết 15 Isoleucin 1.02 2.59 16 Leucin 1.02 5.19 Page 16 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh 17 Tyrosin 0.51 6.49 18 Phenylanin 0.51 6.49 1.1.4.5 Các nguyên tố vi lượng Bảng 8: Các nguyên tố vi lượng: STT Nguyên tố vi lượng Hàm... hoặc một mô của - Nhân cây invitro - Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến cây soma,… 1.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh Page 27 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành... 2000m so với mặt biển hình 6: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại Người ta đã nghiên cứu vi c đưa cây nhân sâm Ngọc Linh về Đà Lạt, về Sapa nhưng sản phẩm cây mọc ở đây hầu như không còn đủ hoạt chất chữa bệnh Vi c di thực nhân sâm Ngọc Linh đến các vùng núi lân cận có thấy cây mọc bình thường nhưng sau 2 Page 22 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh năm theo dõi thì hầu hết không đủ hoạt... thành rễ bất định - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) Page 33 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn - Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và. .. men,…) và agar  Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS Page 30 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Cơ sở cho vi c xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Thành phần môi trường nuôi. .. vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh Page 21 Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh - Năm 2003: Vi n Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây Mục đích của dự án là quy . Error! Bookmark not defined. Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 6 Bảng 14: ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định invitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường. 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50 năm tuổi Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 20 năm Những nghiên cứu về dược lý lâm sàng của. có nhiều nghiên cứu trong nuôi trồng sâm in vitro bao Nuôi cấy in- vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh Page 8 gồm nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, tái sinh cây và chuyển gen. Phương pháp