1.2.2.1. Nuôi cấy phôi
Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển.
Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết quả tốt hơn. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên.
Page 27
- Nhân giống cây trồng. - Thử sức sống của phôi hạt.
- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa.
- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi.
1.2.2.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.
Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này.
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:
- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây.
- Nhân cây invitro.
- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,…
Page 28
Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus. Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non.
Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ thì bổ sung auxin.
Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong: - Tạo cây sạch virus.
- Nhân giống invitro.
- Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
1.2.2.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội.
Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo.
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Tần số
Page 29
phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để: - Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử. - Chọn các dòng đột biến.
1.2.2.5. Nuôi cấy tế bào đơn
Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme. Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối.
Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích: - Chọn dòng tế bào.
- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau.
- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp.
1.2.2.6. Nuôi cấy protoplast
Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế
Page 30
bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường).
Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo ra cây lai soma.
- Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào.
1.2.3. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau: - Muối khoáng đa lượng.
- Muối khoáng vi lượng
- Vitamin.
- Nguồn carbon.
- Chất điều hòa sinh trưởng.
- Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) và agar.
Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS.
Page 31
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.
Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH.