1.2.5.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng,... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật.
- Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 oC/15 phút.
- Nút đậy: Sử dụng nút cao su. Nút được nhét bông gòn không thấm nước để bụi và không khí không được đi qua. Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121 oC/15 phút.
- Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm.
- Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,... - Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy.
- Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm trong 30 phút.
Page 36
Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được.
1.2.5.2. Chọn đúng môi trường và chuẩn bịmôi trường đúng cách
Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor. Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng.
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. - Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy.
- Trong quá trình thao tác.
Bảng 10: Thời gian tối thiểu để hấp khửtrùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C.
Thểtích môi trường (ml) Thời gian tối thiểu (phút)
Page 37 50 26 100 28.5 250 31.5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 1.2.5.3. Chọn mô cấy và xửlý đúng cách
Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Khi bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn.
Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các nguyên liệu thực vật khác.
Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng. Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất. Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang khử trùng.
Page 38
- Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng. - Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút.
- Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng.
- Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng.
Bảng 11: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: tt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả Hypochlorite calcium 9-10% 5-30 Rất tốt Hypochlorite sodium 0,5-5% 5-30 Rất tốt Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt Oxy già 3-12% 5-15 Tốt
Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt
Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt
Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá