Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo thông đỏ (taxus wallichiana zucc)

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo thông đỏ (taxus wallichiana zucc)

Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh ung thư bệnh gây tử vong với tỉ lệ cao Theo thống kê sở, tổ chức y tế Trung ương nước hàng năm, giới có triệu trường hợp mắc bệnh ung thư phát thêm Trong đó, trường hợp dẫn đến tử vong 65% Ở Việt Nam, năm gần đây, số người mang bệnh ung thư không ngừng tăng cao với hệ số lớn Đồng thời, tỉ lệ tử vong cao, 75% Theo báo cáo Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ, nguyên nhân tình trạng thiếu thuốc đặc trị mà điều trị phương pháp bổ trợ Ngoài việc nghiên cứu để tổng hợp dược phẩm chống ung thư năm gần giới chuyển sang sử dụng loại dược thảo để chữa bệnh cho người Mà người Việt Nam lại có truyền thống sử dụng thuốc dân gian để chữa trị, hầu hết chúng bắt nguồn từ thuốc Những thuốc mang lại ý nghĩa mặt y học kinh tế Các thuốc chiếm 30% giá trị thuốc thị trường giới Ở Việt Nam, 90% nguyên liệu phải nhập khẩu, chủ yếu sản xuất dạng thuốc thông thường, để trị bệnh thông thường Ngoài ra, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp tạo bước tiến xa khoa học thực vật Trong đó, taxol alkaloid diterpenoid thu nhận từ phận thuộc nhóm Taxus (cây thông đỏ Việt Nam), sử dụng làm thuốc trị bệnh ung thư Taxol sử dụng thành phần hầu hết lọai thuốc đặc trị cho phần lớn loại bệnh ung thư ung thư phổi, ung thư dày, ung thư ruột kết, ung thư cổ, đầu … hay khối u hắc tố ác tính khác Taxol có nhiều vỏ Taxus wallichiana Zucc (Thông Đỏ Himalaya) bị đe dọa tuyệt chủng nạn chặt phá rừng Taxus wallichiana loại thuộc Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) nhóm tăng trưởng chậm, việc thu hoạch vỏ để chiết xuất Taxol làm chết, gây thiệt hại cho nguồn tài nguyên rừng ảnh hưởng đến môi trường sinh thái quốc gia Việc nuôi cấy tế bào Taxus wallichiana để thu nhận hợp chất Taxol việc làm cần thiết giúp khai thác nguồn dược liệu quý mà không làm ảnh hưởng đến nguồn giống tự nhiên môi trường sinh thái Việt Nam, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thị trường, làm giảm giá thành sản xuất sản phẩm có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ thực vật Với lý đến thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) ” 1.2 Mục tiêu yêu cầu thí nghiệm 1.2.1 Mục tiêu Nghiên cứu tỉ lệ thành phần khoáng chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm lượng taxol tích lũy nuôi cấy mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana) 1.2.2 Yêu cầu Xác định nồng độ javel thời gian xử lý mẫu thích hợp để khả vô trùng mẫu nuôi cấy Thông Đỏ cao Xác định môi trường khoáng chất điều hòa tăng trưởng thích hợp để tạo mô sẹo Thông Đỏ Xác định môi trường khoáng chất điều hòa tăng trưởng thích hợp để tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Xác định ảnh hưởng nước dừa để tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Xác định ảnh hưởng hàm lượng đường để tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ 1.2.3 Giới hạn đề tài Do giới hạn luận văn tốt nghiệp nên tiến hành thí nghiệm xung quanh vấn đề có liên quan đến kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo Thông Đỏ Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung thực vật nhóm Taxus 2.1.1 Nguồn gốc - lịch sử Các loài thực vật thuộc nhóm Taxus (Thông Đỏ) người biết đến sử dụng hàng ngàn năm Từ lâu, người ta biết Thông Đỏ loại có độc tính cao nguy hiểm Ngày nay, nhà khoa học xác định độc tố chủ yếu hợp chất Taxine Thực vật thuộc nhóm Taxus gồm 10 loài khác phân bố nhiều vùng từ châu Mỹ, châu Âu, đến châu Á, như: Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya), Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương), Taxus baccata (Thông Đỏ Châu Âu), Taxus cuspidata (Thông Đỏ Nhật Bản), Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc), …, số loài Taxus lai tạo loài Thông Đỏ Hình 2.1 Rừng Taxus baccata Châu Âu Tại Việt Nam Taxus wallichiana Zucc sống chủ yếu Lâm Đồng, Khánh Hòa thuộc lọai đại mộc, chiều cao đến 30 mét, vỏ có màu nâu đỏ nhạt, dày, Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi nâu đậm Thân nhẵn, cành xèo rộng, mọc cách xếp thành hai dãy, mặt có màu lục, mặt vàng, dài khoảng 2,5 – cm, rộng – cm, thót dần nhọn phía đầu lá, mọc tạo thành góc 60 – 90o so với trục cành mang lá, có gân rõ mặt trên, mặt màu xanh vàng có hai dải khí khổng màu xanh nhạt xanh vàng trông rõ, cuống ngắn khoảng 0,2 cm Thông Đỏ đơn tính biệt chu Hoa Thông Đỏ gồm – 10 nhị, nhị có – túi phấn mọc nách vùng đỉnh cành thường tạo thành cụm màu vàng nhạt, hình trứng cuống ngắn Nón mọc riêng lẽ nhánh, phân bố dọc theo suốt đoạn cành Nón đực nón phân bố cành Quả Thông Đỏ có hình ô van hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc bọc vảy xếp thành lớp tạo đế, non có màu nâu sẫm, chín có màu nâu nhạt hay màu đỏ Cây Thông Đỏ sinh trưởng chậm, ưa sáng ưa ẩm lại cần bóng râm để nảy mầm phát triển năm đầu Mùa hoa từ tháng - 12 kết trái vào tháng - năm sau Hoa đực nách hình cầu màu vàng lục có cuống ngắn, nón đực gồm - 14 nhị đực Nón noãn, có hai không cuống, noãn thẳng thuộc loại đơn tính khác gốc cuối cành Hạt hình trứng, khô cứng, dài 0,6 - 0,7 cm, có lớp vỏ giả nạc mềm màu đỏ Hạt phát tán không xa, nảy mầm phát triển nơi có độ ẩm cao, có cường độ ánh sáng trung bình Tỷ lệ nảy mầm tự nhiên thấp so với số lượng hạt mang hàng năm, hạt nảy mầm sau hai năm, sau rụng Gỗ Thông Đỏ chắc, không cong vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu nước dùng làm gỗ xây dựng đồ gỗ gia dụng Vì Thông Đỏ bị khai thác bừa bãi, mức biện pháp bảo vệ nghiêm ngặt, chúng bị diệt vong tương lai không xa Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 2.1.2 Phân loại khoa học Giới Plantae Phân giới Tracheobionta Nhóm Spermatophyta Phân nhóm Coniferophyta Lớp Pinopsida Bộ Taxales Họ Taxaceae Giống Taxus Loài Taxus Wallichiana Zucc Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Hình 2.2 Đặc điểm hình thái Thông Đỏ Thực vật thuộc nhóm Taxus có 10 loài khác phân bố nhiều vùng ôn đới ẩm, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới núi cao bắc bán cầu từ châu Mỹ, châu Âu đến châu Á gồm: - Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương) - Taxus baccata (Thông Đỏ châu Âu) - Taxus cuspidate (Thông Đỏ Nhật Bản) - Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc) - Taxus globosa (Thông Đỏ Mexico) - Taxus marei (Thông Đỏ Đài Loan) - Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya) - Taxus sumatrana (Thông Đỏ Sumatra) - Taxus floridana (Thông Đỏ Florida) - Taxus Canadensis (Thông Đỏ Canada) Trong có loài khu vực Trung Đông Á – loài phía bắc Châu Mỹ loài Việt Nam T Chinensis (Thông đỏ ngắn) T Wallichiana Zucc (Thông đỏ dài) Thông Đỏ ngắn phân bố Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Việt Nam Ở Việt Nam, phân bố rãi rác số vùng núi thuộc tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Nghệ An (Quỳ Châu) độ cao: 900 – 1600 m (Vũ Văn Vụ ctv, 1996, Sách đỏ VN) Thông Đỏ dài phân bố Nepal (vùng núi Himalaya), phía bắc Mianma, Đông – Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin, Việt Nam Ở Việt Nam, loài thấy số vùng núi cao thuộc tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An – Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 đến 1600 m (Nguyễn Tiệp, 1996 2001) Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Hình 2.3 Các loại Taxus giới A.Taxus brevifoia D Taxus floridana B.Taxus baccata E Taxus chinesis C Taxus cuspidate F Taxus wallichiana Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 2.1.3 Thành phần hóa học Trong phận thuộc nhóm Taxus có nhiều hợp chất khác Cấu tử đặc trưng chung Diterpenoid Các hợp chất thường gọi chung Taxoid, Taxol đồng phân Taxoltere hai hợp chất quan trọng tạo chuyển hóa hợp chất 10-deacetybacctin III (là hợp chất trung gian quan trọng có loài thực vật nhóm Taxus) 2.2 Sơ lược Thông Đỏ Cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thuộc họ Thanh Tùng (Taxaceae), gồm chi: Taxaceae: Austrotaxus - tùng New Caledonia Pseudotaxus - thông trắng (bạch đậu sam) Taxus - tùng (thông đỏ, hồng đậu sam) Cephalotaxaceae: Amentotaxus - dẻ tùng, sam Cphalotaxus - đỉnh tùng (phỉ mũi) Torreya - phỉ Bảng 2.1 Điểm khác biệt chi Taxaceae chi Cephalotaxaceae Họ Áo hạt Độ dài hạt tưởng thành Thời gian phát triển Taxaceae Bao phủ môt phần hạt – mm – tháng Cephalotaxaceae Bao phủ toàn hạt 12 – 40 mm 18 – 20 tháng 2.2.1 Giá trị kinh tế ngành y dược Thông Đỏ loài quý có giá trị kinh tế cao Gỗ thông đỏ chắc, không cong vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu ướt, dùng làm gỗ xây dựng đồ gia dụng Lá Thông Đỏ loại thuốc dân gian dùng từ lâu đời để trị hen suyễn, viêm phế quản, chứng tiêu hóa không bình thường… (Võ Văn Chi, 2004) Đặc biệt Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) vào năm 1994, số nhà khoa học giới công bố từ thông đỏ tìm thấy hoạt chất để chữa trị bệnh ung thư Cụ thể, Taxol chiết xuất từ vỏ loài: T brevifolia, T cuspidata, T yunnanensis, T baccata T wallichiana,… có chất lượng hiệu suất cao, dùng để chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đầu, cổ có triển vọng xử lý hắc tố (melanomas) , khoảng kg Taxol/9000 kg vỏ T brevifolia, loài khác cho hiệu suất nhỏ Đặc biệt hàm lượng biến động theo điều kiện sinh thái môi trường Hiện hoá trị ung thư, hai loại thuốc trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt ung thư vú có hai dược phẩm sử dụng nhiều hiệu Taxol Taxotere Thuốc Taxol bào chế từ chất Paclitaxel thuốc Taxotere bào chế từ chất Docetaxel Hai dược chất có chung nguồn gốc dược liệu, chiết xuất từ thông đỏ (Taxus wallichiana) Thông thường kg thông đỏ chiết xuất 20 mg Taxol giá mg Taxol thị trường giới 4,87 USD Ví dụ: Để có liều thuốc trị bệnh ung thư, người ta cần khoảng 1kg taxol để có 1kg taxol, cần không 7.000kg vỏ Thông Đỏ Nghĩa để có liều thuốc trị bệnh ung thư bào chế, phải "hy sinh" khoảng sáu Thông Đỏ trưởng thành Như vậy, toàn rừng Thông Đỏ Việt Nam dùng làm nguyên liệu đủ để điều chế 10 liều thuốc chữa trị ung thư Song Thông Đỏ loài độc tiếng, gia súc ăn phải loài bị ngộ độc Thông Đỏ xếp vào nhóm thực vật Việt Nam (Trần Văn Tiến, 1999) 2.2.2 Phân bố Thông Đỏ loài thực vật hạt trần quý hiếm, loài có nhiều ứng dụng lĩnh vực y - sinh học Theo nghiên cứu nhà rừng học cho biết Thông Đỏ phân bố hẹp nước Châu Á như: Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan… Ở Việt Nam, năm 1995 Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia khảo sát vùng Pà Cò, Mai Châu, Hoà Bình gặp Thông Đỏ T chinensis (còn gọi Thông Đá, Cây Tra) bên trái núi đá vôi Riêng Lâm Đồng nhà nghiên cứu lâm sinh phát loài Thông Đỏ Himalaya (T.Wallichiana Zucc) có rải rác Page Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) nhiều nơi độ cao khoảng 1.500 m, vài địa điểm có Thông Đỏ như: khu vực giáp ranh Xuân Thọ, Xuân Trường cách Đà Lạt 17 km phát Thông Đỏ lớn nhỏ, lớn có thân đường kính gốc đạt 115 cm, ba thân có đường kính tương ứng 57 cm, 41 cm 15 cm, chiều cao khoảng 30 m Cây nhỏ có đường kính 33 cm, cao 15 m Cả mọc bên khe núi Cành thu thập giâm hom trung tâm lâm sinh Lâm Đồng có nhiều hom, hom đưa trồng trạm Mang Linh cho phù hợp với nhu cầu sinh thái loài 2.2.3 Đặc điểm hình thái Cây Thông Đỏ thuộc họ tùng (Taxaceae) Ở Việt nam, Taxus wallichiana phân bố tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng Cây Thông Đỏ thuộc loài đại mộc, mọc cao đến 30m Vỏ có màu nâu đỏ nhạt, dày, bong vảy, thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi màu nâu đậm Thân nhẵn, cành xòe rộng, cành non màu lục, gốc cành mang chồi vảy màu lục xếp lợp Lá mọc cách xếp thành hai dãy mặt có màu lục, mặt vàng Lá dài khoảng 2,5 – cm, rộng – cm, thót dần nhọn phía đầu lá, mọc tạo thành góc 60 – 90o so với trục cành mang Thông Đỏ cuống đơn tính biệt chu Hoa đơn tính khác gốc Hoa đực Thông Đỏ gồm – 10 nhị, nhị có – túi phấn mọc nách vùng đĩnh cành thường tạo thành cụm màu vàng nhạt, hình trứng cuống ngắn Hoa mọc riêng lẽ nhánh, phân bố dọc theo suốt đoạn cành Hoa đực hoa phân bố cành Quả Thông Đỏ có hình ô van hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc bọc vảy xếp thành lớp tạo đế, non có màu nâu sẫm, chín có màu nâu nhạt hay màu đỏ nhạt, mềm, nhiều nước, 2.2.4 Đặc điểm sinh trưởng Thông Đỏ loại có biên độ sinh thái hẹp, ưa bóng, thường phân bố vùng núi cao có độ dốc 300 m hay vùng cận nhiệt đới ẩm đỉnh núi Page 10 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Nghiệm thức Môi trường Thành phần 2.1 2.2 2.3 2.4 M0 (ĐC) M1 M2 MS + Suc 30 g/l + Agar 8,0 g/l M0 (ĐC) + 2,4-D mg/l M0 (ĐC) + 2,4-D mg/l 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 W0 (ĐC) W1 W2 W3 B0 (ĐC) 2.10 B1 B0 (ĐC) + 2,4-D mg/l 2.11 B2 B0 (ĐC) + 2,4-D mg/l 2.12 B3 B0 (ĐC) + 2,4-D mg/l M3 M0 (ĐC) + 2,4-D mg/l WPM + Suc 30 g/l + Agar 8,0 g/l W0 (ĐC) + 2,4-D mg/l W0 (ĐC)+ 2,4-D mg/l W0 (ĐC) + 2,4-D mg/l B5 + Suc 30 g/l + Agar 8,0 g/l 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Trong điều kiện nuôi cấy in vitro khả tự tổng hợp điều chỉnh chất điều hòa sinh trưởng thường hạn chế nên việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng kích thích trình tăng sinh tăng sinh mô sẹo xanh Thông Đỏ cần thiết Mục đích thí nghiệm 3: xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp để tăng sinh khối mô sẹo Vật liệu: sử dụng mô sẹo Thông Đỏ từ thí nghiệm (thí nghiệm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D đến phát sinh mô sẹo Thông Đỏ) Phương pháp: cân 0,5 g mô sẹo vào môi trường agar có 50 ml môi trường Tế bào Thông Đỏ chia thành cụm, nghiệm thức cấy bình Môi trường khoáng kết từ thí nghiệm có bổ sung chất ĐHST 2,4-D, NAA IAA với nồng độ thay đổi từ mg/l đến mg/l (bảng 3.3) Theo dõi khối lượng mô sẹo tươi sau tuần, khối lượng mô sẹo khô sau tuần, số tăng sinh khối mô sẹo Trọng lượng mô sẹo tươi sau tuần - trọng lượng mô sẹo ban đầu Chỉ số trăng trưởng = Trọng lượng mô sẹo ban đầu Page 31 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến tăng sinh khối mô sẹo NT 3.1 Môi trường TD0 (ĐC) 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 TD1 TD2 TD3 TA1 TA2 TA3 TI1 TI2 TI3 TB1 TB2 TB3 Thành phần Khoáng từ TN2 + Suc 30 g/l + Agar 8,0 g/l TD0 + 2,4-D mg/l TD0 + 2,4-D mg/l TD0 + 2,4-D mg/l TD0 + NAA mg/l TD0 + NAA mg/l TD0 + NAA mg/l TD0 + IAA mg/l TD0 + IAA mg/l TD0 + IAA mg/l TD0 + IBA mg/l TD0 + IBA mg/l TD0 + IBA mg/l 3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường đến tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường thích hợp tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Vật liệu: Mô sẹo Thông Đỏ từ thí nghiệm (thí nghiệm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D đến phát sinh mô sẹo Thông Đỏ) Phương pháp: cân 0,5 g mô sẹo vào 50 ml môi trường có chất cảm ứng với nồng độ xác định (từ thí nghiệm 3) Sử dụng môi trường khoáng có chất ĐHST tốt từ thí nghiệm bổ sung thêm nồng độ đường biến thiên từ 20 – 30 – 40 g/l (theo bảng 3.4) Mô sẹo chia thành cụm, nghiệm thức cấy bình Thời gian khảo sát tuần Chỉ tiêu theo dõi: khối lượng mô sẹo tươi sau tuần, khối lượng mô sẹo khô sau tuần, số tăng sinh khối mô sẹo Trọng lượng mô sẹo tươi sau tuần - trọng lượng mô sẹo ban đầu Chỉ số trăng trưởng = Trọng lượng mô sẹo ban đầu Page 32 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến tăng sinh khối mô sẹo Nghiệm thức 4.1 Môi trường TĐ1 Thành phần 20 g/l 4.2 TĐ2 30 g/l 4.3 TĐ3 40 g/l 3.3.5 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ nước dừa thích hợp tạo sinh khối mô sẹo Vật liệu: Mô sẹo Thông Đỏ từ thí nghiệm (thí nghiệm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D đến phát sinh mô sẹo Thông Đỏ) Phương pháp: cân 0,5 g mô sẹo vào 50 ml môi trường có chất cảm ứng với nồng độ xác định (từ thí nghiệm 4) Sử dụng môi trường khoáng có chất ĐHST tốt từ thí nghiệm bổ sung thêm nồng độ nước dừa biến thiên từ 10 – 15 – 20 % (theo bảng 3.5) Mô sẹo chia thành cụm, nghiệm thức cấy bình Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng mô sẹo tươi sau tuần, khối lượng mô sẹo khô sau tuần, số tăng sinh khối mô sẹo Trọng lượng mô sẹo tươi sau tuần - trọng lượng mô sẹo ban đầu Chỉ số trăng trưởng = Trọng lượng mô sẹo ban đầu Thời gian thí nghiệm: tuần Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến tăng sinh khối mô sẹo Page 33 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Nghiệm thức 5.1 Môi trường TN1 Thành phần 10 % 5.2 TN2 15 % 5.3 TN3 20 % 3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo xanh Thông Đỏ trình nhân sinh khối mô - Mục đích: xác định thời gian tăng sinh tối ưu mẫu, xây dựng đường cong sinh trưởng tế bào mô sẹo xanh Thông Đỏ - Phương pháp thực hiện: cân 0,5 g mô sẹo cho vào môi trường nuôi cấy Môi trường tốt cho trình nhân sinh khối mô sẹo Thể tích môi trường nuôi cấy 50 ml môi trường thạch Thời gian khảo sát mô sẹo theo bảng 2.6 Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối mô sẹo, hệ số tăng sinh tế bào Bảng 2.6 Đường cong sinh trưởng mô sẹo xanh Thông Đỏ trình nhân sinh khối mô Nghiệm thức 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 Thời gian (ngày) 14 21 28 35 42 49 3.4 Phương pháp xử lý số liệu thống kê Số liệu thu từ thí nghiệm phân tích thống kê phần mềm MSTATC Vẽ đồ thị phần mềm MS EXECL 2007 Page 34 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) CHƯƠNG KẾ HOẠCH THỰC HIỆN Bảng 4.1 Kế hoạch thực Kế hoạch thực Thu thập số liệu viết đề cương Viết đề cương Báo cáo đề cương Bố trí thí nghiệm Theo dõi thu thập số liệu Xử lý số liệu, viết luận văn Bảo vệ đề tài Thời gian dự kiến 01/06/2012 – 10/06/2012 10/06/2012 - 15/06/2012 18/06/2012 – 23/06/2012 25/06/2012 –10/07/2012 10/07/2012 – 10/10/2012 10/10/2012 – 25/11/2012 24/12/2012 – 29/12/2012 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Javel thời gian khử trùng đến khả vô trùng mẫu nuôi cấy Thông Đỏ Tạo nguồn mẫu có khả sống cao điều kiện tiên cho thành công việc nuôi cấy in vitro Rất khó để tạo nguồn mẫu ban đầu từ mẫu vườn Do mẫu thường xuyên tiếp xúc với tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus), phân bón dung dịch dinh dưỡng thường xuyên tưới cho Page 35 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Nguồn mẫu không khử trùng khử trùng không đưa mẫu vào môi trường vô trùng bị nhiễm khuẩn nấm khử trùng nồng độ chất khử trùng cao thời gian xử lý mẫu lâu làm ảnh hưởng đến khả tái sinh mẫu làm chết mẫu Vì thế, để tăng tỷ lệ mẫu đảm bảo chất lượng mẫu đưa vào nuôi cấy in vitro tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ Javel thời gian khử trùng đến khả vô trùng mẫu nuôi cấy Thông Đỏ Kết theo dõi trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ javel thời gian khử trùng đến mẫu Thông Đỏ NT 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 F tính CV (%) Nồng độ javel Thời gian (%) 50 50 50 50 50 100 100 100 100 100 (phút) 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) Thân 1,10e 6,67e 24,43d 51,10c 66,67b 80,00a 86,67a 87,77a 86,67a 85,57a 174,74** 7,91 1,10e 8,90e 28,87d 64,47c 75,57b 82,23ab 88,87a 91,13a 83,33a 77,77ab 174,28** 7,43 Nồng độ dung dịch khử trùng thời gian xử lý mẫu ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu sống Cùng nồng độ khử trùng thời gian xử lý khác có tỷ lệ mẫu sống khác Javel dung dịch dùng để khử trùng phổ biến, có giá thành thấp tính chất hóa học Javel đáp ứng yêu cầu: hàm lượng Clo hoạt tính nước Javel 3,5-4 g/l vừa đủ ức chế vi sinh vật, có tính sát khuẩn cao, an toàn, sử dụng nồng độ thích hợp Javel có độc tính thấp với tế bào chủ nên Javel chọn để sử dụng thí nghiệm vô mẫu Thông Đỏ Sau vô trùng mẫu tuần tiến hành thu kết tổng hợp bảng 4.1 Qua bảng số liệu cho thấy, dung dịch khử trùng nồng độ 50% thời gian xử lý 10 phút tỷ lệ mẫu sống 1,10% loại vật liệu thân lá, thời gian xử lý mẫu tăng lên 15 phút tỷ lệ mẫu Page 36 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thân sống vô trùng đạt 6,67%, mẫu sống vô trùng đạt 8,90% Ở nồng độ dung dịch khử trùng 50% thời gian xử lý mẫu cao (30 phút) tỷ lệ mẫu thân sống vô trùng tăng lên đạt 66,67% tỷ lệ mẫu sống vô trùng đạt 75,57% Khi tăng nồng độ dung dịch khử trùng thời gian xử lý lên tỷ lệ mẫu sống có xu hướng tăng lên Dung dịch khử trùng nồng độ 100% thời gian xử lý 10 phút tỷ lệ mẫu sống đạt 80,0% vật liệu thân, với vật liệu đạt 82,23% Còn với nồng độ dung dịch 100% thời gian khử trùng 20 phút cho kết khử trùng tốt loại vật liệu thân Thông Đỏ (87,77% mẫu thân sống vô trùng, 91,13% mẫu sống vô trùng), tăng thời gian khử trùng lên tỷ lệ mẫu sống vô trùng giảm mẫu bị chết tỷ lệ nhiễm thấp Tóm lại, loại vật liệu thân tăng nồng độ javel thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng Nhưng mẫu tỷ lệ mẫu sống vô trùng đạt cao so với mẫu thân Xác định nồng độ dung dịch khử trùng thời gian xử lý mẫu phù hợp yếu tố định đến thành công việc vào mẫu tạo vật liệu ban đầu cho nuôi cấy in vitro Dựa vào kết thí nghiệm nhận thấy sử dụng dung dịch khử trùng mẫu javel 100% thời gian khử trùng 20 phút phù hợp để chọn vô trùng mẫu Thông Đỏ 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2, 4-D đến phát sinh mô sẹo Thông Đỏ Trong nuôi cấy in vitro, môi trường khoáng nguồn cung cấp dinh dưỡng chủ yếu cho sinh trưởng phát triển, tác nhân quan trọng để thiết lập trình nuôi cấy thành công Mỗi loại mô có nhu cầu thành phần, nồng độ chất khác phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu tốc độ tăng trưởng hay phát sinh quan Vì giai đoạn tạo mô sẹo từ Thông Đỏ cần phải khảo sát thành phần môi trường khoáng Có nhiều loại môi trường phát triển nhiều nhà khoa học thích hợp cho nhu cầu phát triển loại mô nuôi cấy khác Trong giai đoạn tạo mô sẹo, môi trường dinh dưỡng khoáng cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng Do đó, ba loại môi trường MS – B5 – WPM có bổ sung thêm 2,4 D (0 – – – mg/l), đường 30 g/l sử dụng thí nghiệm khảo sát môi trường khoáng tạo mô sẹo Thông Đỏ Page 37 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Bảng 4.2 Ảnh hưởng môi trường khoáng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2, 4-D đến phát sinh mẫu mô sẹo Thông Đỏ NT Tổng số mẫu cấy 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 F tính CV (%) MS MS MS MS B5 B5 B5 B5 WPM WPM WPM WPM 2,4- D Thời (mg/l) phát sinh mô hình 5 gian Tỷ sẹo (ngày) 42 38 31 27 42 31 27 23 42 31 25 21 lệ mẫu Trọng lượng thành tươi (g) mô sẹo (%) 0,0b 66,67a 88,67a 88,90a 0,0b 97,77a 97,77a 95,53a 0,0b 97,77a 100,0a 100,0a 172,051** 5,54 Bảng 4.3 Ảnh hưởng môi trường khoáng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2, 4-D đến phát sinh mẫu thân mô sẹo Thông Đỏ NT 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 Môi 2,4- D Thời gian Tỷ lệ mẫu Trọng lượng trường (mg/l) phát sinh mô hình thành tươi (g) 5 sẹo (ngày) 42 40 34 28 42 36 28 23 42 35 26 mô sẹo (%) 0,00e 64,47f 77,77cd 88,90abc 0,00f 75,53de 86,67abcd 93,33a 0,00f 80,00bcd 91,10ab MS MS MS MS B5 B5 B5 B5 WPM WPM WPM Page 38 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 2.12 F tính CV (%) WPM 21 97,77a 31,590** 19,08 Kết thí nghiệm (bảng 4.1 bảng 4.2) cho thấy tất loại môi trường nồng độ 2,4- D thí nghiệm tỷ lệ tạo sẹo thời gian xuất mô sẹo mẫu tốt mẫu thân Vì khẳng định Thông Đỏ phận có khả tạo mô sẹo tốt Trên môi trường nuôi cấy phát sinh mô sẹo Thông Đỏ cho thấy khác biệt nghiệm thức tuần khảo sát Mẫu cấy nuôi điều kiện che tối hoàn toàn, sau tuần nhận thấy mẫu bắt đầu cong lên, mô sẹo xuất trước tiên vị trí vết thương gân lan rộng dần khắp bề mặt Sau tuần nuôi cấy mô sẹo phát triển với tốc độ chậm Từ tuần thứ trở mô sẹo phát triển nhanh, gia tăng kích thước có khác biệt rõ rệt nghiệm thức Trên ba loại môi trường sử dụng để vô mẫu Thông Đỏ môi trường WPM có bổ sung 2,4-D 5mg/l cho thấy thời gian mẫu phát sinh mô sẹo sớm 21 ngày Page 39 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Bảng 4.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến tăng sinh khối mô sẹo NT 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 F tính CV (%) Môi Chất điều hòa Khối lượng Khối lượng Khối lượng trường sinh trưởng mô sẹo ban mô sẹo tươi mô sẹo khô 2,4-D (0 mg/l) 2,4-D (1 mg/l) 2,4-D (3 mg/l) 2,4-D (5 mg/l) NAA (0 mg/l) NAA (1 mg/l) NAA (3 mg/l) NAA (5 mg/l) IBA (0 mg/l) IBA (1 mg/l) IBA (3 mg/l) IBA (5 mg/l) đầu (g) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 (g) 0,63ª 0,84ª 2,73ª 2,38ª 0,65ª 2,26ª 2,25ª 1,97ª 0,64ª 1,32ª 1,19ª 1,05ª 88,289** 9,6 (g) 0,10ª 0,14ª 0,46ª 0,40ª 0,09ª 0,42ª 0,44ª 0,34ª 0,08ª 0,38ª 0,24ª 0,19ª 38,351** 15,25 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 Page 40 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường đến tăng sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Bảng 4.10 Ảnh hưởng nồng độ đường đến tăng sinh khối mô sẹo NT Khối lượng mô Khối sẹo ban đầu (g) lượng Khối lượng Chỉ số tăng mô sẹo tươi mô sẹo khô sinh khối mô sau tuần (g) sau tuần (g) sẹo TĐ1 TĐ2 TĐ3 Page 41 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Page 42 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 4.5 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến tăng sinh khối mô sẹo thông đỏ Bảng 4.11 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến tăng sinh khối mô sẹo NT 5.1 5.2 5.3 F tính CV (%) Nồng độ nước Khối lượng mô Khối dừa (%) sẹo ban đầu (g) 10 15 20 0,5 0,5 0,5 lượng Khối lượng mô sẹo tươi mô sẹo khô sau tuần (g) 1,35 1,02 1,64 1,552ns 32,47 sau tuần (g) Page 43 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 3.2.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng trình nhân sinh khối mô sẹo Thông Đỏ Để trì phát triển ổn định chọn lọc dòng tế bào phù hợp với mục tiêu nghiên cứu đòi hỏi phải tiến hành cấy chuyền mô sẹo nhiều lần Khi cấy chuyền mô sẹo môi trường có agar phát triển tế bào trải qua giai đoạn: tế bào chuẩn bị phân chia, tế bào phân chia cực đại, tế bào tăng sinh tuyến tính phân chia chậm gia tăng kích thước, tế bào tăng trường chậm cuối tế bào cân số lượng Xây dựng đường cong sinh trưởng giúp xác định thời điểm thích hợp cho việc cấy chuyền mô sẹo, nâng cao hiệu tăng sinh khối mô sẹo Tiến hành khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo Thông Đỏ môi trường……………… Thời gian ghi nhận kết sinh khối mô sẹo: - - 14 - 21 - 28 ngày Page 44 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Võ Văn Chi, 2002 Từ điển thực vật công dụng Nhà xuất khoa học tự nhiên Trần Văn Định, 2005 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thông đỏ Luận văn thạc sĩ trường đại học Nông Lâm thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thượng Hiền, 1995 Thực vật đặc sản rừng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trần Văn Minh, 2000 Công nghệ sinh học thực vật Giáo trình đại học Trần Văn Minh, 2004 Giáo Trình Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Bộ khoa học, công nghệ mội trường,1996 Sách đỏ Việt Nam: phần thực vật Nhà xuất kỹ thuật 484 trang Dương Công Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên, 2007 Nuôi cấy tế bào tái tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào Thông Đỏ Hymalaya Tạp chí công nghệ sinh học 5(2): 243 – 253 Tài liệu internet http://tin180.com/xahoi/chinh-tri-xa-hoi/20091025/thuan-hoa-thong-do-thanh-caytrong-nong-nghiep.html http://www.vista.gov.vn/ 10 http://www.hcmbiotech.com.vn 11 http://www.khoahoc.com.vn/ 12 http://vi.wikipedia.org/ 13 http://d.violet.vn/uploads/resources/49/40391/preview.swf 14 http://huaf.edu.vn/diendan/viewtopic.php?f=115&t=1164 15 http://d3.violet.vn/uploads/previews/558/991148/preview.swf Page 45 [...]... các mô khác  Sự hình thành chồi từ mô sẹo Page 19 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi: các chất sinh trưởng đưa vào môi trường, chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo, các chất có chứa sẵn trong các mẫu nuôi cấy Khả năng hình thành. .. hiện nay Phần lớn các nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy tế bào cây Thông Đỏ để thu nhận Taxol cùng các hợp chất liên quan đều được thực hiện trên các loài Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya), Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương), Page 12 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Taxus... khuấy và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Wang và ctv, 1999) Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở Page 20 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc). .. đặc Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của các cơ quan của khối mô Khả năng chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mô sẹo cứng Nguyên nhân Page 17 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) có thể do tế bào mô sẹo mất đi khả năng tổng hợp một số chất thiết yếu cho sự... Giang và ctv (2011), đã nghiên cứu “sự hình thành mô sẹo, phôi và cây con ở cây mỏ quạ (Dischidia rafflesia Wall.) invitro” Kết quả nghiên cứu đã đạt được sự hình thành mô sẹo từ đoạn thân non của cây mỏ quạ với tỷ lệ 100% sau Page 24 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 30 ngày nuôi cấy. .. trưởng = Trọng lượng mô sẹo ban đầu Page 32 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối mô sẹo Nghiệm thức 4.1 Môi trường TĐ1 Thành phần 20 g/l 4.2 TĐ2 30 g/l 4.3 TĐ3 40 g/l 3.3.5 Thí nghiệm 5: khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước... tuần Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến sự tăng sinh khối mô sẹo Page 33 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Nghiệm thức 5.1 Môi trường TN1 Thành phần 10 % 5.2 TN2 15 % 5.3 TN3 20 % 3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát đường cong sinh trưởng của mô sẹo xanh Thông Đỏ trong quá trình... Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) 2.4 Nuôi cấy mô sẹo 2.4.1 Khái niệm Đây là bước đầu tiên trong nhiều phòng nuôi cấy mô Việc nhân số lượng lớn mô sẹo từ mẫu cấy đầu tiên là cần thiết Mẫu cấy đầu tiên có thể lấy từ cây con vô trùng trong ống nghiệm hay từ thân, rễ, lá của cây bên ngoài... khối tế bào soma cao nhất (5,07 g) Nghiên cứu nhân sinh khối trên môi trường lỏng (WPM Page 25 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc) +Cw + Vitamin B1 (5 mg/l) +Glycin (5 mg/l) +Sucrose (30 g/l) ) khi bổ sung TDZ (1 mg/l) thì khả năng tăng sinh cao nhất với mật độ tế bào 1410x10 3 tế bào/ ml... mẫu và mỗi nghiệm thức cấy 3 bình Thí nghiệm được che tối hoàn toàn Thời gian khảo sát 6 – 8 tuần Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: tổng số mẫu hình thành mô sẹo, thời gian phát sinh mô sẹo (ngày), đặc điểm mô sẹo Bảng 3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng và 2,4-D đến sự phát sinh mô sẹo Page 30 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế