NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH  MAI THỊ PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH  MAI THỊ PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN VĂN MINH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2011 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) MAI THỊ PHƯƠNG HOA Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Đại học Nơng Lâm TP.HCM Thư ký: TS PHẠM ĐỨC TỒN Đại học Nơng Lâm TP.HCM Phản biện 1: PGS.TS BÙI VĂN LỆ Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM Phản biện 2: PGS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT Phân viện Sinh Học Tây Nguyên Ủy viên: TS BÙI MINH TRÍ Đại học Nơng Lâm TP.HCM i LÍ LỊCH CÁ NHÂN Tơi tên Mai Thị Phương Hoa sinh ngày 11 tháng 08 năm 1986 thành phố Hồ Chí Minh Con ơng Mai Văn Khải bà Hoàng Thị Hạnh Tốt nghiệp Tú tài trường Trung học phổ thơng Gia Định, quận Bình Thạnh năm 2004 Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ quy Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tháng 12/2008 Tháng 3/2009, làm việc Viện Sinh Học Nhiệt Đới chức vụ nghiên cứu viên Tháng 5/2009, ôn tập thi đầu vào cao học ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Từ tháng 10/2009, theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đến Tình trạng gia đình: độc thân Địa liên lạc: số nhà 7Kb, đường số 3, phường Cát Lái, quận Điện thoại: 0982368215 Email: phuonghoa11886@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mai Thị Phương Hoa iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình theo học trường Cám ơn PGS.TS Trần Văn Minh hết lịng giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Cảm ơn công lao to lớn cha mẹ không ngại cực khổ để nuôi khôn lớn cho ăn học tới ngày hôm Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, anh chị bạn Viện Sinh Học Nhiệt Đới giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Cám ơn anh chị lớp cao học Cơng nghệ Sinh học khóa 2009 bạn bè thân yêu chia sẻ bao khó khăn lúc thực tập Học viên thực Mai Thị Phương Hoa iv TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm lượng artemisinin nuôi cấy mô sẹo Thanh Hao (Artemisia annua L.)” tiến hành phịng nghiên cứu trọng điểm phía Nam (Viện Sinh Học Nhiệt Đới) từ tháng 8/2010 đến 9/2011 Artemisinin sesquyterpene lactone có cầu nối endoperoxide ly trích từ Artemisia annua L., có tác dụng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum kháng nhạy cảm với chloroquyne, có hiệu điều trị trường hợp kháng thuốc bệnh sốt rét ung thư Hàm lượng artemisinin Thanh Hao tự nhiên tương đối thấp (0,01 - 1%), bệnh nhân sốt rét ngày gia tăng Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác để tăng suất artemisinin tổng hợp hóa học, ứng dụng kỹ thuật di truyền kỹ thuật thực phức tạp chi phí cao Nghiên cứu ni cấy tế bào hướng cải tiến suất artemisinin dễ dàng thực với chi phí thấp Artemisinin hợp chất thứ cấp nên bị ảnh hưởng yếu tố chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, ánh sáng, đường sucrose, NH4+/NO3-, nitơ tổng số, KH2PO4 cường độ ánh sáng kết hợp với chất cảm ứng, hệ tế bào nuôi cấy ảnh hưởng đến khả tích lũy artemisinin q trình ni cấy tế bào Tất thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên lần lặp lại Qua q trình thực hiện, chúng tơi ghi nhận kết sau: - Lá Thanh Hao phát sinh mô sẹo xanh tốt Môi trường phát sinh mô sẹo môi trường LV bổ sung BA (1,0 mg/l), NAA (1,0 mg/l), sucrose (30 g/l) tỉ lệ phát sinh 100% 12 ngày Môi trường thạch LV bổ sung BA (0,5 mg/l), NAA (0,5 mg/l), casein hydroxylate (0,5 mg/l) sucrose (30 g/l) giúp cho trình tăng sinh khối tế bào tối ưu 19,36 g - Chất cảm ứng (yeast extract chitosan) ảnh hưởng đến khả tích lũy artemisinin mơ sẹo xanh Thanh Hao Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 100 mg/l YE, 100 mg/l chitosan khả tích lũy artemisinin 0,0462% trọng lượng khô tế bào v - Yeast extract chitosan bổ sung vào ngày thứ 14 đến ngày thứ 21 (trong ngày) Nồng độ yếu tố tăng khả tích lũy artemisinin mơ sẹo xanh Thanh Hao là: đường sucrose 30 g/l, NH4+/NO3- 20/40, nitơ tổng số 40 mM, KH2PO4 200 mg/l, cường độ ánh sáng 2.000 lux khả tích lũy artemisinin tăng 0,074% trọng lượng khô tế bào Thế hệ tế bào mô sẹo xanh Thanh Hao ảnh hưởng đến khả tích lũy artemisinin tế bào Thế hệ tế bào mơ sẹo Thanh Hao tích lũy artemisinin tốt hệ thứ 10 (F10), nồng độ artemisinin tích lũy 0,0762% trọng lượng khơ tế bào Nghiên cứu tiền đề cho sản xuất artemisinin từ nuôi cấy mô tế bào Thanh Hao (Artemisia annua L.) vi ABSTRACT The name of thesis: “Studying the influences of the minerals and Elicitors on the cell growth and artemisinin accumulation in callus cultures of Artemisia annua L.” This thesis was carried out at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology (Institute for Tropical Biology) from 8/2010 to 9/2011 Artemisinin, a sesquyterpene lactone containing endoperoxide brigde, from Artemisia annua L has a marked activity against chloroquyne - resistant and chloroquyne - sensitive strains of Plasmodium falciparum and has proven very effectively in treatment of cerebral malaria and cancer Artemisinin content in Artemisia annua L is very low (0,01 - 1% dry weight, DW) due to influence of climatic condition together with time of planting and harvesting of Artemisia annua L., while the demand for artemisinin is increasing along with the increasing of many people suffering from malaria There are many different approaches to enhance artemisinin production such as chemical synthesis, genetic engineering but these methods has not been unfeasible because of the high cost or complex nature of the gene regulation and expression in artemisinin biosynthetic pathway A new, cheaper and more convenient approach is studies of metabolite pathway in cell culture to improve Artemisinin production Artemisinin, a kind of secondary metabolite, may be influenced plant hormones such as BA and NAA, nutrient factors, total nitrogen (NH4+/NO3-), inorganic phosphate (KH2PO4), stress agents such as sucrose, light intensity and elicitors The generation of cell cultures affects on accumulation of artemisinin production in cell culture process as well Therefore we studied the influences of nutrients, phytohormones and elicitors on the cell growth and artemisinin accumulation in green callus cultures of Artemisia annua L These experiments were designed in randomized complete design (RCD) with three replication vii In this study, we obtained the following results: - Green callus which was inducted from leaf pieces of in vitro plantlets of Artemisia annua L on Livay (LV) medium supplemented with g/l agar, BA (1 mg/l), NAA (1 mg/l) is the best with 100% callus - induced explants in 12 days Livay (LV) medium supplemented with g/l agar, BA (0,5 mg/l), NAA (0,5 mg/l), casein hydroxylated (0,5 mg/l) and sucrose (30 g/l) enhanced highest cell biomass (19,36 g) - Elicitors (yeast extract and chitosan) affected the ability of artemisinin accumulation of green callus cultures of Artemisia annua L Optimal elicitor concentrations which enhanced artemisinin accumulation (0,0462% dry weight of cell) were 100 mg/l YE and 100 mg/l chitosan Elicitors were added on day 14 until day 21 (in continuous days), the artemisinin content in the callus and cell biomass are the highest - Optimal level of factors enhanced artemisinin accumulation of green callus cultures of Artemisia annua L.: 30 g/l sucrose, 20/40 NH4+/NO3-, 40 mM total nitrogen, 200 mg/l KH2PO4 and light intensity 2.000 lux - The generation of green callus culture of Artemisia annua L affected the ability to produce artemisinin Generation 10th (F10) of Artemisia annua L cell line produced the best artemisinin content with 0,076% dry weight of cell This study provided a potential protocol for Artemisinin production from in vitro Artemisia annua L tissue culture viii 11 3.00 61.509 20.503 1.22 0.78 12 3.00 54.252 18.084 0.30 0.78 13 3.00 46.614 15.538 2.54 0.78 14 3.00 57.090 19.030 1.03 0.78 15 3.00 63.186 21.062 1.06 0.78 16 3.00 52.008 17.336 0.34 0.78 17 3.00 50.979 16.993 1.51 0.78 18 3.00 56.850 18.950 0.95 0.78 19 3.00 58.473 19.491 2.01 0.78 20 3.00 64.716 21.572 1.09 0.78 21 3.00 47.022 15.674 1.67 0.78 22 3.00 58.977 19.659 1.77 0.78 23 3.00 59.823 19.941 0.94 0.78 24 3.00 45.714 15.238 0.96 0.78 25 3.00 30.750 10.250 0.25 0.78 -Total 75.00 1417.189 18.896 2.97 0.34 Within 1.35 Original Order Ranked Order Mean = 22.67 A Mean = 22.67 A Mean = 19.56 ABCDE Mean 10 = 22.53 A Mean = 20.95 AB Mean 20 = 21.57 AB Mean = 21.41 AB Mean = 21.56 AB Mean = 21.56 AB Mean = 21.41 AB Mean = 20.05 ABCD Mean 15 = 21.06 AB Mean = 19.50 ABCDE Mean = 20.95 AB Mean = 18.11 BCDEFG Mean 11 = 20.50 ABC Mean = 16.40 EFG Mean = 20.05 ABCD Mean 10 = 22.53 A Mean 23 = 19.94 ABCD Mean 11 = 20.50 ABC Mean 22 = 19.66 ABCDE Mean 12 = 18.08 BCDEFG Mean = 19.56 ABCDE Mean 13 = 15.54 G Mean = 19.50 ABCDE Mean 14 = 19.03 BCDEF Mean 19 = 19.49 ABCDE Mean 15 = 21.06 AB Mean 14 = 19.03 BCDEF Mean 16 = 17.34 CDEFG Mean 18 = 18.95 BCDEF Mean 17 = 16.99 DEFG Mean = 18.11 BCDEFG Mean 18 = 18.95 BCDEF Mean 12 = 18.08 BCDEFG Mean 19 = 19.49 ABCDE Mean 16 = 17.34 CDEFG Mean 20 = 21.57 AB Mean 17 = 16.99 DEFG Mean 21 = 15.67 FG Mean = 16.40 EFG Mean 22 = 19.66 ABCDE Mean 21 = 15.67 FG Mean 23 = 19.94 ABCD Mean 13 = 15.54 G Mean 24 = 15.24 G Mean 24 = 15.24 G Mean 25 = 10.25 H Mean 25 = 10.25 H Data file: chất cảm ứng đến khả tích lũy Artemisinin Chi-square = 214.780 Number of Degrees of Freedom = 24 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 24 1151.453 47.977 29644.877 0.0000 Within 50 0.081 0.002 Total 74 1151.534 103 Coefficient of Variation = 0.22% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 52.887 17.629 0.01 0.02 3.00 59.817 19.939 0.00 0.02 3.00 63.018 21.006 0.01 0.02 3.00 67.218 22.406 0.01 0.02 3.00 60.519 20.173 0.00 0.02 3.00 57.162 19.054 0.00 0.02 3.00 64.506 21.502 0.00 0.02 3.00 57.321 19.107 0.00 0.02 3.00 55.206 18.402 0.20 0.02 10 3.00 49.581 16.527 0.01 0.02 11 3.00 55.506 18.502 0.00 0.02 12 3.00 66.249 22.083 0.00 0.02 13 3.00 44.019 14.673 0.00 0.02 14 3.00 56.664 18.888 0.01 0.02 15 3.00 69.186 23.062 0.00 0.02 16 3.00 61.005 20.335 0.01 0.02 17 3.00 53.979 17.993 0.00 0.02 18 3.00 53.847 17.949 0.00 0.02 19 3.00 67.470 22.490 0.01 0.02 20 3.00 60.783 20.261 0.00 0.02 21 3.00 43.002 14.334 0.00 0.02 22 3.00 64.974 21.658 0.01 0.02 23 3.00 56.823 18.941 0.00 0.02 24 3.00 44.019 14.673 0.00 0.02 25 3.00 10.029 3.343 0.00 0.02 -Total 75.00 1394.790 18.597 3.94 0.46 Within 0.04 Original Order Ranked Order Mean 15 = 23.06 A Mean = 17.63 O Mean 19 = 22.49 B Mean = 19.94 I Mean = 22.41 B Mean = 21.01 F Mean = 22.41 B Mean 12 = 22.08 C Mean 22 = 21.66 D Mean = 20.17 H Mean = 19.05 J Mean = 21.50 E Mean = 21.50 E Mean = 21.01 F Mean = 19.11 J Mean 16 = 20.34 G Mean = 18.40 M Mean 20 = 20.26 GH Mean = 20.17 H Mean 10 = 16.53 P Mean 11 = 18.50 L Mean = 19.94 I Mean 12 = 22.08 C Mean = 19.11 J Mean 13 = 14.67 Q Mean = 19.05 J Mean 14 = 18.89 K Mean 23 = 18.94 K Mean 15 = 23.06 A Mean 14 = 18.89 K Mean 16 = 20.34 G Mean 11 = 18.50 L Mean 17 = 17.99 N Mean = 18.40 M Mean 17 = 17.99 N Mean 18 = 17.95 N Mean 18 = 17.95 N Mean 19 = 22.49 B Mean 20 = 20.26 GH Mean = 17.63 O Mean 21 = 14.33 R Mean 10 = 16.53 F Mean 24 = 14.67 Q Mean 22 = 21.66 D 104 Mean 23 = 18.94 K Mean 13 = 14.67 Q Mean 21 = 14.33 R Mean 24 = 14.67 Q Mean 25 = 3.340 S Mean 25 = 3.340 S 3.2 Ảnh hưởng thời gian bổ sung chất cảm ứng Data: thời gian bổ sung chất cảm ứng – trọng lượng tươi Chi-square = 4.572 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.334 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 124.555 31.139 39.656 0.0000 Within 10 7.852 0.785 Total 14 132.407 Coefficient of Variation = 5.68% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 32.043 10.681 0.68 0.51 3.00 41.757 13.919 0.42 0.51 3.00 52.569 17.523 0.52 0.51 3.00 53.703 17.901 1.64 0.51 3.00 53.838 17.946 0.57 0.51 -Total 15.00 233.910 15.594 3.08 0.79 Within 0.89 Original Order Ranked Order Mean = 10.68 C Mean = 17.95 A Mean = 13.92 B Mean = 17.90 A Mean = 17.52 A Mean = 17.52 A Mean = 17.90 A Mean = 13.92 B Mean = 17.95 A Mean = 10.68 C Data: thời gian bổ sung chất cảm ứng – art/gDW (ppm) Chi-square = 17.516 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.002 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 156.064 39.016 48.430 0.0000 Within 10 8.056 0.806 Total 14 164.120 Coefficient of Variation = 4.60% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 43.002 14.334 1.00 0.52 3.00 52.887 17.629 1.00 0.52 3.00 69.186 23.062 1.01 0.52 3.00 67.347 22.449 1.00 0.52 3.00 60.519 20.173 0.00 0.52 105 -Total 15.00 292.941 19.529 3.42 0.88 Within 0.90 Original Order Ranked Order Mean = 14.33 D Mean = 23.06 A Mean = 17.63 C Mean = 22.45 AB Mean = 23.06 A Mean = 20.17 B Mean = 22.45 AB Mean = 17.63 C Mean = 20.17 B Mean = 14.33 D 3.3 Khảo sát ảnh hưởng đường sucrose đến tích lũy artemisinin Data file: nồng độ đường – trọng lượng tươi Chi-square = 9.052 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 471.779 94.356 144.588 0.0000 Within 12 7.831 0.653 Total 17 479.610 Coefficient of Variation = 6.45% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 9.267 3.089 0.15 0.47 3.00 25.254 8.418 0.92 0.47 3.00 42.012 14.004 0.50 0.47 3.00 51.681 17.227 1.57 0.47 3.00 49.212 16.404 0.40 0.47 3.00 47.973 15.991 0.42 0.47 -Total 18.00 225.399 12.522 5.31 1.25 Within 0.81 Original Order Ranked Order Mean = 3.090 D Mean = 17.23 A Mean = 8.420 C Mean = 16.40 A Mean = 14.00 B Mean = 15.99 AB Mean = 17.23 A Mean = 14.00 B Mean = 16.40 A Mean = 8.420 C Mean = 15.99 AB Mean = 3.090 D Data file: đường - hàm lượng art Chi-square = 12.582 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 146.189 29.238 38.457 0.0000 Within 12 9.123 0.760 Total 17 155.312 Coefficient of Variation = 4.28% 106 Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 46.788 15.596 0.60 0.50 3.00 52.488 17.496 0.50 0.50 3.00 68.652 22.884 0.88 0.50 3.00 69.186 23.062 0.06 0.50 3.00 67.089 22.363 0.36 0.50 3.00 62.234 20.745 1.74 0.50 -Total 18.00 366.437 20.358 3.02 0.71 Within 0.87 Original Order Ranked Order Mean = 15.60 B Mean = 23.06 A Mean = 17.50 B Mean = 22.88 A Mean = 22.88 A Mean = 22.36 A Mean = 23.06 A Mean = 20.75 A Mean = 22.36 A Mean = 17.50 B Mean = 20.75 A Mean = 15.60 B 3.3 Khảo sát ảnh hưởng NH4+/NO3- đến khả tích lũy artemisinin Data file: NH4+/NO3- - trọng lượng tươi Chi-square = 17.792 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.007 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 91.786 15.298 63.878 0.0000 Within 14 3.353 0.239 Total 20 95.139 Coefficient of Variation = 3.36% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 36.072 12.024 0.02 0.28 3.00 46.272 15.424 0.42 0.28 3.00 52.848 17.616 0.62 0.28 3.00 46.575 15.525 0.52 0.28 3.00 44.532 14.844 0.84 0.28 3.00 46.071 15.357 0.36 0.28 3.00 33.102 11.034 0.03 0.28 -Total 21.00 305.472 14.546 2.18 0.48 Within 0.49 Original Order Ranked Order Mean = 12.02 C Mean = 17.62 A Mean = 15.42 B Mean = 15.53 B Mean = 17.62 A Mean = 15.42 B Mean = 15.53 B Mean = 15.36 B Mean = 14.84 B Mean = 14.84 B Mean = 15.36 B Mean = 12.02 C Mean = 11.03 C Mean = 11.03 C 107 Data file: NH4+/NO3- - artemisinin Chi-square = 41.975 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 77.396 12.899 330.891 0.0000 Within 14 0.546 0.039 Total 20 77.942 Coefficient of Variation = 1.09% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 54.498 18.166 0.01 0.11 3.00 54.807 18.269 0.01 0.11 3.00 61.611 20.537 0.10 0.11 3.00 61.317 20.439 0.01 0.11 3.00 49.581 16.527 0.03 0.11 3.00 55.506 18.502 0.50 0.11 3.00 44.019 14.673 0.10 0.11 -Total 21.00 381.339 18.159 1.97 0.43 Within 0.20 Original Order Ranked Order Mean = 18.17 B Mean = 20.54 A Mean = 18.27 B Mean = 20.44 A Mean = 20.54 A Mean = 18.50 B Mean = 20.44 A Mean = 18.27 B Mean = 16.53 C Mean = 18.17 B Mean = 18.50 B Mean = 16.53 C Mean = 14.67 D Mean = 14.67 D 3.4 Khảo sát ảnh hưởng Nitơ tổng số đến khả tích lũy artemisinin Data file: Nitơ TONG SO – trọng lượng tươi Chi-square = 4.878 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.438 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 135.039 27.008 120.881 0.0000 Within 12 2.681 0.223 Total 17 137.720 Coefficient of Variation = 2.93% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 34.581 11.527 0.53 0.27 3.00 39.723 13.241 0.24 0.27 3.00 51.522 17.174 0.17 0.27 3.00 56.187 18.729 0.73 0.27 3.00 54.462 18.154 0.26 0.27 108 3.00 54.033 18.011 0.61 0.27 -Total 18.00 290.508 16.139 2.85 0.67 Within 0.47 Original Order Ranked Order Mean = 11.53 D Mean = 18.73 A Mean = 13.24 C Mean = 18.15 AB Mean = 17.17 B Mean = 18.01 AB Mean = 18.73 A Mean = 17.17 B Mean = 18.15 AB Mean = 13.24 C Mean = 18.01 AB Mean = 11.53 D Data file: Nitơ TONG SO - artemisinin Chi-square = 19.868 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 541.507 108.301 47515.041 0.0000 Within 12 0.027 0.002 Total 17 541.535 Coefficient of Variation = 0.22% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 39.099 13.033 0.03 0.03 3.00 74.724 24.908 0.10 0.03 3.00 84.723 28.241 0.04 0.03 3.00 83.424 27.808 0.01 0.03 3.00 62.487 20.829 0.03 0.03 3.00 53.397 17.799 0.00 0.03 -Total 18.00 397.854 22.103 5.64 1.33 Within 0.05 Original Order Ranked Order Mean = 13.03 F Mean = 28.24 A Mean = 24.91 C Mean = 27.81 B Mean = 28.24 A Mean = 24.91 C Mean = 27.81 B Mean = 20.83 D Mean = 20.83 D Mean = 17.80 E Mean = 17.80 E Mean = 13.03 F 3.5 Khảo sát ảnh hưởng KH2PO4 đến khả tích lũy artemisinin Data file: KH2PO4 – trọng lượng tươi Chi-square = 24.736 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 65.887 13.177 46.655 0.0000 Within 12 3.389 0.282 Total 17 69.276 Coefficient of Variation = 3.53% 109 Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 42.408 14.136 0.14 0.31 3.00 45.045 15.015 0.01 0.31 3.00 54.066 18.022 0.02 0.31 3.00 47.982 15.994 0.99 0.31 3.00 46.347 15.449 0.45 0.31 3.00 35.091 11.697 0.70 0.31 -Total 18.00 270.939 15.052 2.02 0.48 Within 0.53 Original Order Ranked Order Mean = 14.14 C Mean = 18.02 A Mean = 15.02 BC Mean = 15.99 B Mean = 18.02 A Mean = 15.45 BC Mean = 15.99 B Mean = 15.02 BC Mean = 15.45 BC Mean = 14.14 C Mean = 11.70 D Mean = 11.70 D Data file: KH2PO4- artemisinin Chi-square = 6.565 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.146 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1515.188 303.038 659.726 0.0000 Within 12 5.512 0.459 Total 17 1520.700 Coefficient of Variation = 3.16% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 44.748 14.916 0.92 0.39 3.00 56.424 18.808 0.81 0.39 3.00 87.591 29.197 0.20 0.39 3.00 110.988 36.996 1.00 0.39 3.00 58.293 19.431 0.43 0.39 3.00 27.654 9.218 0.22 0.39 -Total 18.00 385.698 21.428 9.46 2.23 Within 0.68 Original Order Ranked Order Mean = 14.92 D Mean = 37.00 A Mean = 18.81 C Mean = 29.20 B Mean = 29.20 B Mean = 19.43 C Mean = 37.00 A Mean = 18.81 C Mean = 19.43 C Mean = 14.92 D Mean = 9.220 E Mean = 9.220 E 3.6 Khảo sát ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến khả tích lũy artemisinin Data file: cường độ ánh sáng – trọng lượng tươi Chi-square = 4.414 Number of Degrees of Freedom = 110 Approximate significance = 0.522 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 82.687 16.537 99.986 0.0000 Within 12 1.985 0.165 Total 17 84.672 Coefficient of Variation = 2.48% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 42.255 14.085 0.09 0.23 3.00 42.012 14.004 0.50 0.23 3.00 46.683 15.561 0.56 0.23 3.00 49.212 16.404 0.40 0.23 3.00 57.255 19.085 0.38 0.23 3.00 57.972 19.324 0.32 0.23 -Total 18.00 295.389 16.410 2.23 0.53 Within 0.41 Original Order Ranked Order Mean = 14.09 C Mean = 19.32 A Mean = 14.00 C Mean = 19.09 A Mean = 15.56 B Mean = 16.40 B Mean = 16.40 B Mean = 15.56 B Mean = 19.09 A Mean = 14.09 C Mean = 19.32 A Mean = 14.00 C Data file: ánh sáng - artemisinin Chi-square = 28.717 Number of Degrees of Freedom = A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2328.959 465.792 10867.129 0.0000 Within 12 0.514 0.043 Total 17 2329.474 Coefficient of Variation = 1.08% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 14.748 4.916 0.02 0.12 3.00 27.654 9.218 0.22 0.12 3.00 39.885 13.295 0.01 0.12 3.00 62.487 20.829 0.03 0.12 3.00 110.295 36.765 0.07 0.12 3.00 91.356 30.452 0.45 0.12 -Total 18.00 346.425 19.246 11.71 2.76 Within 0.21 111 Mean Mean Mean Mean Mean Mean Original = = = = = = Order 4.920 9.220 13.30 20.83 36.77 30.45 C A D F E B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 36.77 = 30.45 = 20.83 = 13.30 = 9.220 = 4.920 A B C D E F 3.7 Ảnh hưởng yếu tố chất cảm ứng đến thời gian tích lũy artemisinin Data: trọng lương tươi Chi-square = 3.529 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.474 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 3.740 0.935 2.086 0.1576 Within 10 4.481 0.448 Total 14 8.221 Coefficient of Variation = 4.17% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 3.00 46.251 15.417 0.42 0.39 3.00 46.470 15.490 0.99 0.39 3.00 49.590 16.530 0.53 0.39 3.00 49.689 16.563 0.86 0.39 3.00 48.741 16.247 0.25 0.39 -Total 15.00 240.741 16.049 0.77 0.20 Within 0.67 Original Order Ranked Order Mean = 15.42 A Mean = 16.56 A Mean = 15.49 A Mean = 16.53 A Mean = 16.53 A Mean = 16.25 A Mean = 16.56 A Mean = 15.49 A Mean = 16.25 A Mean = 15.42 A Data: hàm lượng art Chi-square = 11.635 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.020 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2175.332 543.833 406.477 0.0000 Within 10 13.379 1.338 Total 14 2188.712 Coefficient of Variation = 5.69% 112 Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 10.029 3.343 0.34 0.67 3.00 40.335 13.445 0.45 0.67 3.00 91.356 30.452 2.45 0.67 3.00 110.988 36.996 0.50 0.67 3.00 52.020 17.340 0.34 0.67 -Total 15.00 304.728 20.315 12.50 3.23 Within 1.16 Original Order Ranked Order Mean = 3.340 E Mean = 37.00 A Mean = 13.45 D Mean = 30.45 B Mean = 30.45 B Mean = 17.34 C Mean = 37.00 A Mean = 13.45 D Mean = 17.34 C Mean = 3.340 E 3.8 Ảnh hưởng hệ đến thời gian tích lũy artemisinin Data: hệ - trọng lượng tươi Chi-square = 2.953 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.775 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 116.596 23.319 53.360 0.0000 Within 12 5.244 0.437 Total 17 121.840 Coefficient of Variation = 4.12% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 32.019 10.673 0.67 0.38 3.00 52.569 17.523 1.02 0.38 3.00 53.043 17.681 0.68 0.38 3.00 52.590 17.530 0.53 0.38 3.00 52.689 17.563 0.56 0.38 3.00 45.741 15.247 0.25 0.38 -Total 18.00 288.651 16.036 2.68 0.63 Within 0.66 Original Order Ranked Order Mean = 10.67 C Mean = 17.68 A Mean = 17.52 A Mean = 17.56 A Mean = 17.68 A Mean = 17.53 A Mean = 17.53 A Mean = 17.52 A Mean = 17.56 A Mean = 15.25 B Mean = 15.25 B Mean = 10.67 C Data type: hệ - art Chi-square = 15.881 Number of Degrees of Freedom = 113 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1714.199 342.840 723.907 0.0000 Within 12 5.683 0.474 Total 17 1719.882 Coefficient of Variation = 2.66% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 30.105 10.035 0.03 0.40 3.00 63.672 21.224 1.22 0.40 3.00 84.723 28.241 0.67 0.40 3.00 114.294 38.098 0.90 0.40 3.00 110.295 36.765 0.24 0.40 3.00 62.544 20.848 0.15 0.40 -Total 18.00 465.633 25.868 10.06 2.37 Within 0.69 Original Order Ranked Order Mean = 10.04 D Mean = 38.10 A Mean = 21.22 C Mean = 36.77 A Mean = 28.24 B Mean = 28.24 B Mean = 38.10 A Mean = 21.22 C Mean = 36.77 A Mean = 20.85 C Mean = 20.85 C Mean = 10.04 D 114 KẾT QUẢ CHẠY MẪU MÔ HPLC THÁNG 8/2011 (khối lượng chiết 1g, thể tích cuối chạy máy 10 ml) Tên mẫu Trọng lượng Hàm lượng Hàm lượng Mô tả chi tiết tươi (g) (ppm) art/DW khô (%) B1 22,670 17,629 ĐC, không bổ sung L10 0,035 B2 19,939 19,939 Y50 0,040 B3 21,007 21,007 Y100 0,042 Yeast extract B4 21,407 21,502 Y150 0,043 B5 20,173 20,173 Y200 0,041 B6 20,054 19,054 C50 0,038 B7 19,502 22,407 C100 0,043 Chitosan B8 18,107 19,107 C150 0,045 B9 16,403 18,403 C200 0,037 B10 22,527 16,527 C50 0,033 B11 20,503 18,503 C100 0,037 Y0 B12 18,084 22,084 C150 0,044 B13 14,673 14,673 C200 0,029 B14 18,889 18,889 C50 0,038 B15 21,062 23,062 C100 0,046 Y50 B16 17,336 20,336 C150 0,041 B17 16,993 17,993 C200 0,036 B18 18,95 17,949 C50 0,035 B19 19,491 22,491 C100 0,045 Y100 B20 20,062 20,262 C150 0,041 B21 14,334 14,334 C200 0,029 B22 19,659 21,659 C50 0,043 B23 19,941 18,941 C100 0,038 Y150 B24 14,673 14,673 C150 0,029 B25 10,250 3,343 C 200 0,007 Ngày 10,681 14,334 0,029 Ngày bổ sung YE Chitosan Ngày 13,919 17,629 0,035 100 mg/l YE Ngày 14 17,523 23,062 0,046 100 mg/l Chitosan Ngày 21 17,901 22,449 0,045 Ngày 28 17,946 20,173 0,041 S0 3,089 Lượng đường sucrose bổ sung 15,596 0,031 vào nghiệm thức tương ứng S10 8,418 17,496 0,035 với nồng độ (g/l) S20 14,004 22,884 0,046 115 S30 S40 S50 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 ĐC D10 D20 D30 D40 D50 K0 K100 K150 K200 K250 K300 I0 I500 I1000 I1500 I2000 I2500 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 45 51 52 54 55 56 17,227 16,404 15,991 12,024 15,424 17,616 15,525 14,844 15,357 11,034 11,527 13,241 17,174 18,729 18,154 18,011 14,136 15,015 18,022 15,994 15,449 11,697 14,085 14,004 15,561 16,404 19,085 19,324 15,417 15,490 16,530 16,563 16,247 17,830 18,393 23,740 21,600 18,292 16,239 23,062 22,363 20,745 18,166 18,269 20,537 20,439 16,527 18,503 14,673 13,033 24,908 28,241 27,808 20,829 17,799 14,916 18,808 29,197 36,996 19,431 9,218 4,916 9,218 13,295 20,829 36,765 30,452 3,343 13,445 30,452 36,996 17,34 24,908 19,197 15,827 19,431 17,745 19,965 0,046 0,045 0,042 0,036 0,037 0,041 0,041 0,033 0,037 0,029 0,026 0,050 0,057 0,056 0,040 0,036 0,030 0,038 0,058 0,074 0,039 0,018 0,010 0,018 0,027 0,042 0,074 0,061 0,007 0,027 0,061 0,075 0,035 0,050 0,038 0,063 0,039 0,035 0,040 116 Lượng NH4+/NO3- bổ sung vào nghiệm thức tương ứng với nồng độ (mg/l) Ảnh hưởng Nitơ tổng số (mM) đến khả tích lũy artemisinin Lượng bổ sung vào nghiệm thức tương ứng với nồng độ Ảnh hưởng KH2PO4 (mg/l) đến khả tích lũy Artemisinin Ảnh hưởng ánh sáng đến khả tích lũy artemisinin Mẫu vàng - xanh Kết hợp đầy đủ yếu tố bổ sung vào ngày thứ 14 Thu nhận theo ngày sau bổ sung Ngày 14 bổ sung chất cảm ứng ĐC - không bổ sung chất cảm ứng Mẫu đối chứng Kiểm tra mẫu 57 58 59 60 61 62 63 65 66 67 68 69 70 71 72 73 15,596 16,395 18,405 17,496 17,395 17,573 17,523 17,709 10,673 17,394 17,681 17,530 17,563 15,247 17,398 19,352 18,225 22,449 20,350 20,848 17,629 18,941 21,224 19,850 10,035 21,224 28,241 38,098 36,765 20,848 20,202 20,263 0,036 0,045 0,041 0,042 0,035 0,038 0,085 0,040 0,042 0,042 0,113 0,152 0,147 0,083 0,041 0,042 117 Kiểm tra mẫu Mẫu NH4+/NO3- 20/40 Mẫu hệ F1 Mẫu hệ F3 Mẫu hệ F5 Mẫu hệ F10 Mẫu hệ F15 Mẫu hệ F20 Mẫu hệ F21 Mẫu hệ F21 ... Minh Tháng 12/2011 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) MAI THỊ PHƯƠNG HOA Hội... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH  MAI THỊ PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH. .. artemisinin nuôi cấy tế bào mô sẹo Thanh Hao (Artemisia annua L.)? ?? Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tỉ lệ thành phần khoáng chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm lượng artemisinin tích lũy ni cấy mơ sẹo xanh