Tiểu luận tìm hiểu về về độc tố Ochratoxin

LỜI MỞ ĐẦU Như ta đều biết ,con người là sinh vật dị dưỡng nên các nhu cầu về dinh dưỡng của mình thường được thỏa mãn bằng các thực phẩm từ nguồn động vật và thực vật.Việc chọn lựa n

LỜI MỞ ĐẦU

Như ta đều biết ,con người là sinh vật dị dưỡng nên các nhu cầu về dinh dưỡng của mình thường được thỏa mãn bằng các thực phẩm từ nguồn động vật và thực vật.Việc chọn lựa những loài động vật và thực vật làm thức ăn xuất phát từ khả năng từ khả năng cung cấp bởi một môi trường sinh thái xác định cùng là cách chế biến tương hợp đã tạo nên nét văn hóa ẩm thực cho các cư dân ở từng vùng khác nhau Tiêu chuẩn cho sự lựa chọn này ,ngoài chất lượng cảm quan ,khả năng cung cấp và bảo quản thì sự vắng mặt các độc tính được coi là yếu tố quyết định Trong quá trình này ,những sản phẩm tuy có lợi ích nào đó về mặt dinh dưỡng nhưng hàm chứa một độc tính nội tại cao thì thường bị loại khỏi bộ sưu tập thực phẩm của con người Thực ra bên cạnh các chất dinh dưỡng ,một số thực phẩm thường dùng luôn chứa những chất không có giá trị dinh dưỡng hoặc thậm chí có những chất gây nguy hiểm cho cơ thể

Trong đời sống hàng ngày ,con người luôn đối đầu với nhiều hợp chất tự nhiên hoặc nhân tạo Trong những điều kiện nhất định ,sự đối mặt này có thể là nguyên nhân dẫn đến những hậu quả tai hại cho sức khỏe : từ những rối loạn sinh học tối thiểu đến những bệnh nguy hiểm Do vậy con người luôn mong muốn hiểu biết chất độc và phòng ngừa được các hiệu ứng độc

Ở đây nhóm em tìm hiểu chi tiết về độc tố Ochratoxin Theo Tổ chức Nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer), trong thực phẩm , độc tố Ochratoxin có thể gây ung thư cho người mà trong quá trình chế biến cũng không thể loại bỏ hoàn toàn được

MỤC LỤC

I/ TỔNG QUAN

1 Giới thiệu chung 3

2 Độc tố ochratoxin 4

2.1 Sơ lược 4

2.2 Cấu trúc 4

2.3 Nấm mốc tổng hợp OTA 5

2.4 Độc tính 5

II/ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1 Phân tích vi sinh vật 7

2 Cơ sở khoa học 7

2.1 Phạm vi áp dụng 8

2.2 Nguyên tắc 8

2.3 Thuốc thử 8

2.4 Chuẩn bị dung dịch gốc OTA 9

2.5 Dung dịch chuẩn OTA 9

2.6 Dung dịch hiệu chuẩn OTA 9

2.7 Cách tiến hành 9

2.7.1 Khái quát 10

2.7.2 Chuẩn bị mẫu thử 10

2.7.3 Chiết OTA ra khỏi mẫu 10

2.7.4 Điều kiện vận hành HPLC 10

2.7.5 Đường chuẩn 11

2.8 Định tính 11

2.8.1 Nhận biết 11

2.8.2 Xác định 11

2.8.3 Khẳng định 12

2.9 Định lượng 12

3 Phương pháp Kit Veratox 13

3.1 Mục đích sử dụng 13

3.2 Thử nghiệm 13

3.3 Phương pháp 13

3.4 Thông số kĩ thuật 13

3.5 Các vật liệu khuyến cáo 14

3.6 Những vật liệu Neogen không cung cấp 14

III/ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP 1 Hạn chế 14

2 Biện pháp 15

Hình 1 Nấm mốc Fusarium

I / TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ OCHRATOXIN:

1 Giới thiệu chung :

Mycotoxin là các hợp chất trao đổi bậc hai có độc tính do một số vi nấm tổng hợp nên trong các điều kiện xác định Thuật ngữ mycotoxin thường được áp dụng hạn chế cho các độc tố nấm mốc ngoại bào có độc tính đối với động vật máu nóng

Sự nhiễm nấm mốc trên nông sản thực phẩm gây mất mát ,tiêu hao nguyên liệu/ sản phẩm trong suốt dây chuyền sản xuất ra sản phẩm Đặc biệt nghiêm trọng hơn ,sự nhiễm nấm mốc có khả năng tổng hợp mycotoxin ở các nông sàn – thực phẩm làm nhiễm độc chuỗi thực phẩm và gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe vật nuôi ,người tiêu dùng Theo đánh giá của FAO năm 1996 ,hàng năm có hơn 25% nông sản

bị nhiễm nấm mốc Hiện nay các báo cáo cho thấy không chỉ một loại mà đồng thời nhiều loại mycotoxin như aflatoxin B,fumonisin hay ochratoxin cùng được phát hiện trên một nông sản thực phẩm

Mycotoxin có thể gây độc ở các cấp độ khác

nhau : cấp tính hay trường diễn Sự nhiễm độc cấp

tính do mycotoxin gây nên rất nhiều đợt dịch bệnh

và kèm theo tỉ lệ tử vong rất cao Trong chiến

tranh thế giới thứ hai ,do tình trạng đói kém ,người

Nga buộc phải ăn gạo còn sót lại trên đồng ruộng

.Hàng ngàn người đã bị nhiễm độc ,có làng hoàn

toàn bị xóa sổ do nhiễm độc tố T-2 của nấm mốc

Fusarium sporotrichioides phát triển trên các hạt

lúa ướt trên ruộng

Bên cạnh sự nhiễm độc cấp tính ,mycotoxin

còn gây nên các bệnh lý rất khác nhau do ăn phải

thức ăn có độc tố trong một thời gian dài Tùy vào

bản chất của từng loại ,mycotoxin có thể gây độc cho các hệ thống khác nhau của cơ thể như gan ,thận ,hệ thần kinh ,hệ tiêu hóa của động vật tiêu thụ các sản phẩm nhiễm các độc tố nấm mốc

Nhiều mycotoxin như aflatoxin ,ochratoxin,funomisin có thể là các chất gây biến dị ,gây hội chứng ung thư và quái thai Ngoài ra, mycotoxin còn có thể gây ra sự mất cân bằng trong chuyển hóa thức ăn và giảm tỉ lệ sinh sản của vật nuôi Bên cạnh

đó ,các dẫn xuất của mycotoxin thường độc đối với hệ thần kinh và do vậy gây tổn hại hệ thống cơ và gây rất nhiều hội chứng khác như bệnh ngoài da ,chứng tăng sừng hóa ,tác động gây động đực ,sẩy thai Ngoài các tác động trực tiếp ,mycotoxin còn có khả năng gây các hội chứng gián tiếp như ức chế vitamin,ăn không ngon miệng ,hoặc biến đổi các chất khác thành các chất độc Tuy nhiên,bệnh do mycotoxin gây nên không có tính di truyền ,không lây nhiễm ,không gây nhiễm trùng

Do đặc tính các mycotoxin là khác nhau ,và có thể do các nấm mốc khác nhau tổng hợp nên ,không có một lý thuyết chung cho các mycotoxin về khả năng

nhiễm ,độc tính ,khả năng loại trừ ,phương pháp phân tích …Vì thế Ochratoxin là một

độc tố điển hình của mycotoxin

2 Độc tố ochratoxin :

Sơ lược :

Độc tố Ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia,

cà phê và cả trong các sản phẩm có nguồn gốc

động vật do đã bị lây nhiễm trước Ochratoxin được

tạo ra từ nấm Aspergillus (ví dụ: A ochraceus) và

một vài loài Penicillium Độc tố nấm mốc thuộc

nhóm này gọi là Ochratoxin A (= OTA hay OA) Có

các phức hợp khác trong nhóm này, nhưng chúng ít

độc hơn Nấm Aspergillus ochraceus (tạo ra độc tố

OTA) thích hợp trong điều kiện khí hậu nóng, trong

khi nấm Penicillium verrucosum tạo ra độc tố OTA

trong vùng khí hậu ôn đới Ví dụ A ochraceus được

tìm thấy ở Brazil, Chile, Egypt, Senegal, Tunisia,

India và Indonesia Penicillium verrucosum được

quan sát thấy ở Canada, Mỹ, Châu Âu, và Nam Mỹ

(theo nguồn FAO)

Hình 2 Độc tố nấm mốc ochratoxin

Các nghiên cứu của Pháp và Châu Âu mới đây cho thấy rằng các mẫu thực phẩm chứa OTA ở nồng độ ít nhất vượt quá 10 ppb,lớn hơn 10 lần ngưỡng an toàn .Mới đây ,nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp cho thấy rằng trong số 450 mẫu rượu nho của Châu Âu ,vang đỏ được phát hiện nhiễm OTA nhiều hơn so với vang trắng hay vang hồng Ngoài ra sự nhiễm OTA phụ thuộc rất nhiều vào xuất xứ địa lí của nguyên liệu

2.2 Cấu trúc :

Ochratoxin là một độc tố rất phổ biến bên cạnh các mycotoxin khác như aflatoxin là các ochratoxin A,B,và C và các dẫn xuất của chúng Về cấu tạo hóa học OTA là hợp chất của izocoumarin liên kết với một nhóm L-phenylalanin.Độc tính của các ochratoxin khác nhau liên quan tới việc nhóm hydroxyl phenol được tách ra khó hay dễ

– C – C – N – C –

H COOH

H H H O

OH

Cl

O

O

CH3

Ochratoxin A

Cấu trúc hóa học OTA 2.3.Nấm mốc tổng hợp OTA :

Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp OTA còn chưa được xác định .Nhưng các nghiên cứu về OTA cho tới nay cho thấy rằng các chủng nấm mốc có thể rất khác nhau trên các đối tượng khác nhau ,và thuộc vào các giống nấm mốc phổ

biến Aspergillus và Penicillium Ví dụ: các chủng gặp rất phổ biến trên lương thực và thực phẩm như Aspergillus carbonarius và Aspergillus ochraceus Các nghiên cứu đã

chỉ ra rằng ,sự phát triển của các nấm mốc sinh OTA khác nhau và việc hình thành OTA từ chúng phụ thuộc rất khác nhau vào nhiệt độ ,độ ẩm ,hoạt độ nước của sản phẩm ,bản chất sản phẩm Các chủng sinh OTA rất khác nhau theo khu vực địa lí ,khí hậu và bản chất của sản phẩm bị nhiễm Hơn thế nữa ,các chủng tổng hợp OTA cũng

có thể tổng hợp đồng thời nhiều loại mycotoxin như axit penicilic hoặc citrinin

2.4 Độc tính :

Trong số các ochratoxin , ochratoxin A ( OTA) có tính độc cao nhất Đây là hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, hòa tan hạn chế trong nước

– C – C – N – C –

H COOH

H H H O

OH

H

O

O

CH3

Ochratoxin B

– C – C – N – C –

H COOH

H H H O

OH

O

O

CH3

Ochratoxin C

2.4.1 Đối với các loại ngũ cốc :

Ngay từ khi gieo trồng, tất cả các loại ngũ cốc đều bị nhiễm nấm mốc Loại

nấm mốc này có tên là Fusarium Trong quá trình thu hoạch và lưu giữ tại kho, ngũ cốc lại có nguy cơ cao bị nhiễm một loại nấm mốc có tên là Aspergillus … Chính những loại nấm mốc này sẽ tạo nên những độc tố nấm mốc( như ochratoxin)

Độc tố nấm mốc là sản phẩm phụ của

quá trình trao đổi chất tự nhiên của nấm mốc và

gây nên một số bệnh cho gia súc cũng như con

người Độc tố nấm mốc có tính bền vững ở nhiệt

độ cao, đến 340oC mà không bị phân hủy Hầu

hết các loại nguyên liệu thức ăn gia súc đều là

các loại hạt cốc đã mang sẵn nấm mốc và các

loại độc tố, quá trình chế biến nhiệt cũng không

làm ảnh hưởng đến sự tồn tại của các loại độc tố

nấm mốc này, đây chính là nguyên nhân làm gia

súc mắc bệnh và gây nên những thiệt hại không

nhỏ

Hình 3 Độc tố nấm mốc ở ngũ cốc 2.4.2 Tác động đối với vật nuôi :

OTA là độc tố nấm mốc liên quan tới bệnh thận cấp tính của lợn, gây quái thai cho chuột, và phôi gà LD 50 cuả OTA là 20mg/kg đối với chuột và 3,6mg/kg đối với gà con 10 ngày tuổi

* Trên heo, OTA gây tổn thương thận Thực ra, OTA thu hút các protein

huyết tương bao quanh nó, tạo ra một hợp chất khá bền vững Hợp chất này được tìm thấy ở thịt heo và các sản phẩm từ thịt OTA cũng ảnh hưởng đến sự sinh sản của heo nọc Nó được truyền qua nhau thai, và có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bào thai Hiện tượng chết hàng loạt ở heo con mới sinh đôi khi một phần là do với nhiễm độc tố OTA

Stoev và cộng tác viên quan sát thấy độc tố ochratoxin A có trong thức ăn

sẽ làm tăng độ nhạy cảm của heo đối với bệnh thương hàn Thí nghiệm được thực hiện

trên 18 con heo, có sự bộc phát tức thời do S choleraesuis trên toàn bộ số heo cho ăn

với khẩu phần có chứa 3 ppm ochratoxin A và trên 1/3 số heo cho ăn với khẩu phần 1ppm ochratoxin Trong cùng thí nghiệm, không có heo nào bị mắc bệnh ở lô đối chứng Sự xuất hiện tức thời của bệnh thương hàn có thể giải thích rằng nếu quan sát bằng mắt thường thì tất cả heo ở các trại đều khoẻ mạnh, nhưng thực tế thì mọi cá thể

heo đều có nhiễm S cholerasuis Trong một thí nghiệm khác, tất cả các heo đều được tiêm vaccin chống lại S choleraesuis (nguyên nhân gây bệnh hồng lị) Tuy nhiên, độc

tố nấm mốc lại gây bùng phát bệnh do ảnh hưởng của Serpulina hyodysenteriae và

Campylobacter coli (Stoev và cộng sự, 2000) Một số tác giả khác (Muller và cộng sự,

1999; Verma và Mathew, 1998; Baudrimont và cộng sự, 1994) đã trình bày về một số

ảnh hưởng khác của Ochratoxin A trên sự miễn dịch của thú: làm giảm tế bào lympho (tế bào miễn dịch), tăng apoptotic thực bào (làm chết các bạch cầu trung tính và đại thực bào), tăng lượng bạch cầu ưa acid (tế bào có liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch), làm tăng lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa bazơ và làm giảm sự thực bào (khả năng tiêu diệt vi khuẩn của cơ thể thú)

* Ở gà: chậm phát triển, khả năng trao đổi giống giảm, sản lượng và chất lượng trứng giảm, tiêu chảy

2.4.3 Tác động đối với cơ thể người :

Đối với người, OTA gây chứng bệnh suy thận vùng Bancang ở người

.Những trường hợp nhiễm độc OTA cấp tính có thể bị tử vong Từ 1993, Cơ quan nghiên cứu Quốc tế về ung thư đã xếp OTA vào các hợp chất nhóm 2B là nhóm các hợp chất có thể gây ung thư OTA còn bị nghi ngờ là chất có thể gây nhiễm độc thần kinh

Các khuyến cáo cho rằng ngưỡng hấp thu hàng ngày cho phép đối với

OTA là 1,2 - 1,4 mg/kg/ngày Ngưỡng qui định cho OTA trong một số sản phẩm như nước quả hoặc vang nho được khuyến cáo là 0,2 – 1mg/ kg

II / PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH :

1 Phân tích vi sinh vật :

Để phân lập các nấm mốc nhiễm trên thực phẩm, phương pháp phân lập trực tiếp hiệu quả hơn phương pháp gián tiếp đối với các sản phẩm dạng hạt Hạt ngũ cốc được đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau khi đã được làm sạch trong dung dịch tẩy clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn trên bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc Đối với các sản phẩm dạng bột, có thể tiến hành đồng hóa hoặc lắc mẫu trong các dung môi thích hợp và sử dụng kĩ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm trên sản phẩm

Vấn đề cơ bản khi phân tách nấm mốc nhiễm trên sản phẩm là sự phát triển rất nhanh chóng của 1 số loài nấm như Mucor, Rhizopus và các loài Zygomycetes làm cho việc phát hiện hoặc định lượng các nấm mốc khác rất khó khăn Có thể sử dụng các môi trường nghèo như Potato Dextro agar hoặc môi trường có chứa chất ức chế một số nấm mốc như dicloran, hoặc sử dụng các môi trường chọn lọc để ức chế một số nấm mốc có khả năng sinh hệ sợi nhanh chóng như Rhizopus

2 Theo cơ sở khoa học :

Các ochratoxin phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm.Do vậy có thể phân tách OTA bằng TLC, bằng HPLC, phát hiện mẫu dưới tia UV

Theo TCVN 7595-07 thì có 2 phương pháp xác định ochratoxin A trong ngũ

cốc và sản phẩm ngũ cốc bằng phương pháp sắc kí lỏng :

+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng sillicagel

+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng bicacbonat

Ở đây nhóm em tìm hiểu về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng sillicagel

2.1 Phạm vi áp dụng :

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định ochratoxin A với các hàm lượng lớn hơn 0,4 µg/kg Phương pháp này đã được đánh giá thành công trong hai nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725 : 1986, thực hiện trên bột mì có chứa hàm lượng ochratoxin A từ 0,4µg/kg đến 1,2 µg/kg

Nguyên tắc :

Sau khi đã axit hóa bằng axit clohydric và nồng độ ion được tăng bằng cách

bổ sung magie clorua, dùng toluene để chiết ochratoxin A (OTA ) Làm sạch dịch chiết trên một cột nhỏ sillicagel và xác định OTA bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC ( High-Performance Liquid Chromatography ) trên cột pha đảo, nhận dạng

và sửa đổi bằng huỳnh quang Kết quả được xác minh lại bằng dẫn xuất với bo triflorua trong dung dịch metanol nếu cần

 Chú ý : OTA gây độc đến gan, thận và có thể gây ung thư Phải tuân thủ

các yêu cầu phòng ngừa về an toàn thích hợp khi xử lí các hợp chất như thế

và đặc biệt là tránh xử lí chúng dưới dạng khô vì bản chất tĩnh điện học có thể dẫn đến sự phân tán và hít phải Các dụng cụ thủy tinh có thể khử nhiễm bằng dung dịch natri hypoclorit 4%

2.3 Thuốc thử :

Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử được công nhận đạt chất lượng tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước loại 1 của TCVN

4851 (ISO 3696 ), trừ khi có qui định khác Dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC

2.3.1 Natri sunfat, dạng khan

2.3.2 Axit acetic băng, ( CH3COOH)≈ 98%

2.3.3 Dung dịch HCl = 2 mol/l

2.3.4 Dung dịch MgCl2 = 0,4 mol/l

2.3.5 Axetonitril

2.3.6 Toluen

2.3.7 n-Hexan

2.3.8 Diclorometan

2.3.9 Axeton

2.3.10 Metanol

2.3.11 Bo triflorua

2.3.12 Ochratoxin A, dạng tinh thể hoặc dưới dạng viên nang

2.4.Chuẩn bị dung dịch gốc OTA :

Hòa tan 1mg ochratoxin (tinh thể ) hoặc lượng chứa trong một viên nang (nếu OTA thu được dưới dạng màng mỏng) vào trong hỗn hợp dung môi I ( gồm : toluen và axit acetic băng với các phần tương ứng là 99 + 1 theo các phần thể tích )

để có được dung dịch chứa khoảng từ 20 µg/ml đến 30 µg/ml OTA

2.5.Dung dịch chuẩn OTA :

Cho bay hơi dưới dòng khí nito cho đến khô : 1 ml dung dịch chuẩn gốc hoặc một phần tương đương với một lượng chính xác 100 µg OTA đến khô, rồi dùng pha động ( trộn 99 phần thể tích axetonitril với 99 phần thể tích nước và 2 phần thể tích axit acetic băng và khử khí dung dịch này trước khi sử dụng ) để pha loãng đến 100 ml

Dung dịch này có thể bảo quản ở 4oC trong tủ lạnh Cần kiểm tra tính ổn định của dung dịch

2.6 Dung dịch hiệu chuẩn OTA :

Dùng pipet lấy các dung tích thích hợp của dung dịch chuẩn OTA, ví dụ : 1ml ; 2,5ml; 4ml và 5ml cho vào bình định mức 100ml và dùng pha động để pha loãng đến vạch mức

Nồng độ OTA trong các dung dịch hiệu chuẩn cần nằm trong dãy 0,2 ng đến 1,0 ng trong 20 µl thể tích bơm

2.7 Cách tiến hành :

2.7.1 Khái quát :

Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày Nếu một số mẫu được chuẩn bị cùng một lúc thì toàn bộ các mẫu đó cần được phân tích cùng một thời điểm trong suốt cả đêm bằng cách sử dụng bộ bơm mẫu tự động

2.7.2 Chuẩn bị mẫu thử :

Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm nghiền nhỏ mẫu cho đến khi lọt qua sàng và trộn kĩ Đối với bột mì có cỡ hạt tối đa là 250 µm thì không cần thiết phải nghiền

2.7.3 Chiết OTA ra khỏi mẫu :

- Cân 20g ( mo ) mẫu đã chuẩn bị chính xác đến 0,1g cho vào ống li tâm Tiếp theo , cho 30 ml dung dịch axit clohydric, 50 ml dung dịch MgCl2 , dùng đũa thủy tinh để khuấy và thêm 100 ml toluen ( V1)

- Lắc trong 60 phút và sau đó cho li tâm huyền phù Thời gian li tâm phụ thuộc vào hiệu quả của máy li tâm, việc làm lạnh tránh thất thoát toluen Lấy ra 50

ml (V2) ra khỏi lớp toluen phía trên và nạp vào cột pha rắn loại nhỏ sử dụng một lần

đã được chuẩn bị và cột này được nối với xiranh làm nơi chứa dung môi

- Rửa cột hai lần, mỗi lần bằng 10 ml n-hexan và rửa tiếp 2 lần, mỗi lần bằng

10 ml hỗn hợp dung môi II ( axeton và toluen với các phần tương ứng là 5 + 95 ) Tiếp theo, rửa bằng 5 ml toluen Loại bỏ tất cả nước rửa

- Rửa giải OTA bằng 2 phần hỗn hợp dung môi III ( toluen và axit acetic băng với các phần tương ứng là 90 + 10 ) mỗi phần 15 ml cho vào bình quả lê 50 ml Cho bay hơi dịch rửa giải dưới áp suất giảm cho đến khô, chú ý không để nhiệt độ vượt quá 40oC Lấy phần cặn ra, dùng pipet hút 1 ml (V3 ) pha động cho vào bình hình quả lê và lọc qua bộ lọc màng, vào lọ

2.7.4 Điều kiện vận hành HPLC :

Sử dụng cột tách HPLC pha đảo phân tích thì cài đặt như sau :

+ Tốc độ dòng : 1 ml/ phút