Phân lập vi khuẩn khử Sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Thị Hải PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ SULPHATE SRB ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI AXIT TỪ HOẠT ĐỘNG KHAI THÁC KHOÁNG

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Hải

PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ SULPHATE (SRB) ĐỂ ỨNG DỤNG

TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI AXIT TỪ HOẠT ĐỘNG

KHAI THÁC KHOÁNG SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Hải

PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ SULPHATE (SRB) ĐỂ ỨNG DỤNG

TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI AXIT TỪ HOẠT ĐỘNG

KHAI THÁC KHOÁNG SẢN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐINH THÚY HẰNG

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 AMD (Acid Mine Drainage) và các vấn đề môi trường liên quan………….2

1.1.1 Sự hình thành AMD……… 2

1.1.2 Ảnh hưởng của AMD tới môi trường ……… 5

1.1.2.1 Ô nhiễm nguồn nước do AMD……… 5

1.1.2.2 Ô nhiễm đất do AMD………6

1.1.2.3 Tình trạng ô nhiễm do AMD ở Việt Nam ………8

1.1.2.4 Hiện trạng quản lý và xử lý AMD ở Việt Nam……… 11

1.2 Xử lý AMD………12

1.2.1 Xử lý AMD bằng phương pháp hóa học……… 12

1.2.2 Xử lý AMD bằng phương pháp sinh học………13

1.2.2.1 Cơ sở khoa học của công nghệ……… 13

1.2.2.2 Một số quy trình công nghệ xử lý AMD nhờ SRB………14

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình xử lý AMD bằng SRB 16

1.3 Đặc tính sinh học của SRB 18

1.3.1 Phân bố của SRB trong tự nhiên 19

1.3.2 Đa dạng về di truyền của SRB 20

1.3.3 Đặc điểm sinh lý của SRB 22

1.3.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của SRB 22

1.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của SRB 23

1.3.3.3 Cạnh tranh của SRB với các nhóm vi khuẩn khác trong môi

trường 24

Chương 2 – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên vật liệu……….26

2.1.1 Các mẫu nước thải……… 26

2.1.2 Hóa chất……… 26

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ……….26

2.2 Phương pháp nghiên cứu……….27

2.2.1 Làm giàu và phân lập SRB……….27

2.2.2 Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu ……… 29

2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết 30

2.2.4 Phương pháp điện di biến tính DGGE 32

2.2.5 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 34

2.2.6 Phân tích hóa học 35

2.2.6.1 Định lượng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin 35

2.2.6.2 Định lượng sulfate………36

2.2.6.3 Xác định nồng độ sulfide……… 37

2.2.7 Thiết kế mô hình xử lý AMD………37

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………39

3.1 Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ các mẫu nước thải 39

3.2 Vị trí phân loại của ba chủng SRB dựa trên trình tự gen 16S rDNA…….42

3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập……… 44

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường………45

3.3.2 Ảnh hưởng của pH trong môi trường……….…46

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy……… 48

3.3.4 Chất cho điện tử và chất nhận điện tử……….48

3.4 Thử nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm 50

3.4.1 Xử lý AMD trong điều kiện bổ sung methanol (10 mM) làm cơ chất 51

3.4.2 Xử lý AMD trong điều kiện bổ sung nước thải giàu hữu cơ làm cơ chất 52

3.4.3 Biến động về thành phần quần xã vi sinh vật trong quá trình xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm 52

KẾT LUẬN 55

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 71

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMD Acid Mine Drainage

BSA Bovin serum albumin

DNA Deoxyribonucleic acid

CI Chloroform-isoamyl alcohol

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành khai thác khoáng sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế, đóng góp tới 5,6% GDP (Bùi Công Quang, 2011) Tuy nhiên, hậu quả suy thoái môi trường cũng gia tăng nghiêm trọng, đặc biệt ở các vùng mỏ khai thác than, quặng và vật liệu xây dựng

Nước thải axit (AMD) được coi là một trong các mối đe dọa lớn nhất của hoạt động khai thác khoáng sản tới môi trường AMD có ảnh hưởng lâu dài đối với các nguồn nước sông, suối, cũng như sự sống của các sinh vật (động, thực vật và con người) liên quan đến những nguồn nước này Do ảnh hưởng của AMD, nước tại nhiều dòng sông, suối quanh khu vực khai thác có pH bằng 4 hoặc thấp hơn, hòa tan nhiều kim loại nặng như sắt, đồng, nhôm, cadmium, arsen, chì, thủy ngân…Các kim loại này, đặc biệt là sắt, có thể phủ lên đáy sông, suối một lớp bùn màu đỏ cam được gọi là “hạt vàng” và có thể được vận chuyển đi xa theo dòng nước, làm ô nhiễm những dòng sông, suối, và nguồn nước ngầm ở hạ lưu Đối với cuộc sống ở nước, AMD có thể ngay lập tức làm chết các động thực vật thủy sinh hoặc gây ảnh hưởng tới sinh trưởng, tập tính, hoặc khả năng sinh sản của chúng

Do ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường, AMD cần phải được kiểm soát

và xử lý Từ lâu vi khuẩn khử sulfate (SRB) đã được biết đến với ứng dụng trong xử

lý AMD một cách hiệu quả Tuy công nghệ xử lý AMD bằng SRB đã được triển khai thành công ở nhiều nước trên thế giới nhưng ở Việt Nam lại chưa được nghiên cứu và áp dụng Trong nghiên cứu của luận văn thạc sỹ này, chúng tôi tiến hành làm giàu và phân lập SRB từ các nguồn khác nhau và thử nghiệm sử dụng chúng để xử

lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm Các kết quả thu được sẽ cung cấp cơ sở cho việc nghiên cứu ứng dụng thực tế công nghệ này ở Việt Nam

và màu vàng của ion sắt bị oxy hóa (Watzlaf và cs, 2003) (hình 1.1)

Hình 1.1 AMD từ khu khai thác quặng kim loại ở Việt Nam

Quá trình oxy hóa khoáng sulfide kể trên (phản ứng 1.1) xảy ra bởi tác động của các yếu tố thiên nhiên, tuy nhiên được tăng tốc mạnh qua các hoạt động khai thác khoáng sản (tạo điều kiện cho quặng nằm trong lòng đất được tiếp xúc với oxy), do vậy sinh ra lượng lớn AMD, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường trong khu vực khai thác mỏ (Stumm, Morgan,1996)

FeS2 + 7/2O2 +H2O → Fe 2+

+ 2SO42- + 2H+ (1.1) Khi oxy hoà tan có mặt đủ, Fe2+ sẽ bị oxy hóa thành Fe3+ (phản ứng 1.2)

Fe2+ + 1/4O2 + H+ → Fe3+

+ 1/2H2O (1.2)

Tuy nhiên, ở pH > 3,5, Fe3+ không hòa tan mà kết tủa ở dạng hydroxit sắt III (Fe(OH)3) Quá trình này cũng giải phóng H+ và tiếp tục làm giảm pH (phản ứng 1.3) (Brown và cs, 2002)

Fe3+ + 3H2O → Fe(OH)3+ 3H+ (1.3) Bên cạnh đó, ở pH thấp (< 3,5), Fe3+ hòa tan có thể đóng vai trò như một tác nhân oxy hóa, tiếp tục oxy hóa pyrite và giải phóng axit (phản ứng 1.4)

FeS2 + 14Fe3+ + 8H2O → 15Fe2+ + 2SO42 + 16H+ (1.4)

Quá trình này tự duy trì lâu dài do Fe2+

được sinh ra dễ dàng bị oxy hóa trở lại thành Fe3+ và tiếp tục tham gia phản ứng (Younger và cs, 2002) So với oxy hòa tan, Fe3+ oxy hóa pyrite thậm chí với tốc độ cao hơn, do vậy tốc độ của quá trình oxy Fe2+ thành Fe3+ (phản ứng 1.2) có ảnh hưởng quan trọng đối với quá trình oxy hóa quặng pyrite (Singer, Stumm, 1970)

Fe2+ có thể được oxy hóa theo con đường hóa học hay sinh học, tùy thuộc vào điều kiện môi trường Ở pH gần trung tính, oxy hóa Fe2+ chủ yếu diễn ra theo con đường hóa học, tuy nhiên ở pH 2 – 4 thì quá trình sinh học chiếm ưu thế nhờ

các vi khuẩn oxy hóa sắt (như Thiobacillus ferrooxidans) xúc tác phản ứng 1.2

(Brown và cs, 2002) Các vi khuẩn này có thể đẩy nhanh tốc độ oxy hóa Fe2+ gấp

106 lần so với quá trình hóa học (Singer, Stumm, 1970), vì vậy chúng đóng vai trò chính trong việc tạo AMD tại mỏ (Brown và cs, 2002; Younger và cs, 2002)

Các sulfide kim loại khác pyrite như sphalerite (ZnS) và galena (PbS) khi bị oxy hóa sẽ không sinh ra axit (phản ứng 1.5, 1.6), nhưng có thể giải phóng các ion kim loại vào môi trường (Younger và cs, 2002)

ZnS + 2O2 → Zn2+ + SO42- (1.5) PbS + 2O2 → Pb2+

trường axit có thể giải phóng ion nhôm (phản ứng 1.7, 1.8), sau đó tiếp tục sinh axit

từ phản ứng thủy phân và kết tủa (phản ứng 1.9) (Watzlaf và cs, 2003)

KAlSi3O8 + H+ + 29H2O → 2H4SiO4 + Al2SiO5(OH)4 (1.7)

Al2SiO5(OH)4 + 6H+ → 2Al3+ + 2H4SiO4 + H2O (1.8)

Al3+ + 3H2O → Al(OH)3 + 3H+ (1.9) Như vậy AMD có hai điểm đặc trưng nhất là pH thấp và hàm lượng ion kim loại nặng cao Dưới đây là thành phần hóa học của một số AMD từ các loại mỏ đại diện

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của AMD (Tất cả nồng độ tính bằng mg/l)

(Mỹ)

Mỏ kim loại Surthing

(Montana)

Mỏ đồng và lưu huỳnh Leviathan

(California)

Mỏ đồng – niken Nickel Rim

1.1.2 Ảnh hưởng của AMD tới môi trường

1.1.2.1 Ô nhiễm nguồn nước do AMD

AMD được coi là một trong các mối đe dọa lớn nhất của hoạt động khai thác khoáng sản tới môi trường, đặc biệt là môi trường nước AMD có ảnh hưởng lâu dài đối với các nguồn nước sông, suối, cũng như cuộc sống của các sinh vật (động, thực vật và con người) liên quan đến những nguồn nước này

Nước bị ô nhiễm AMD có thể có pH thấp từ 2 đến 4,5, gây độc với hầu hết các dạng sinh vật sống dưới nước (Hill, 1974) Nếu như sự sinh trưởng và sinh sản

ở cá diễn ra an toàn ở pH trong khoảng 5,5 – 10,5 (tối ưu ở 6,5) thì quá trình này bị

ức chế rõ rệt ở pH thấp (dưới 4,5), nhiều khả năng do liên quan tới sự trao đổi canxi

và tổng hợp protein trong cơ thể (Fromm, 1980) Howells và cs (1983) đã chứng minh ảnh hưởng của sự tương tác giữa pH, canxi, và nhôm đối với sự tồn tại và sinh sản của cá Điều kiện pH thấp làm thay đổi màng của mang cá hoặc làm thay đổi chất nhầy của mang dẫn tới chết vì thiếu oxy Cá hồi lớn lên ở nơi ấp trứng có thể chịu được pH 5.0, nhưng thấp hơn mức này thì hằng số điện phân nội môi và cơ chế thẩm thấu bị giảm (Fromm, 1980) Cooper và Wagner (1973) khi tiến hành nghiên cứu ở sông Pennsylvania đã cho thấy ô nhiễm do AMD có ảnh hưởng nghiêm trọng đến các loài cá ở đây Theo nghiên cứu này, số lượng loài cá giảm rõ rệt khi pH trong môi trường nước giảm, cụ thể là 68 loài được tìm thấy ở pH > 6,4, 38 loài ở

pH 5,6 – 6,4, và chỉ có 10 loài ở pH  5,5 Một số nghiên cứu khác đã công bố hoàn toàn không tìm thấy cá ở 90% sông suối có pH 4,5 và axit tổng số là 15 mg/l (Farag

và cs, 2003) Ngoài cá, các sinh vật khác như côn trùng, tảo cũng giảm rõ rệt về số lượng loài và số lượng cá thể khi pH trong môi trường giảm do AMD (Warner, 1971)

Môi trường nước có hàm lượng kim loại nặng và ion H+ cao làm suy hô hấp cấp tính và mãn tính ở cá khi tiếp xúc trực tiếp qua mang, hoặc gián tiếp qua ăn các chất cặn và thức ăn bị ô nhiễm Các hydroxit sắt có trong AMD kết tủa trên bề mặt của lớp trầm tích sông suối làm phá hủy môi trường sống, qua đó làm giảm số lượng các động vật không xương ở đáy, là nguồn thức ăn cho cá Menendez (1978)

đã công bố nghiên cứu về sự suy giảm của các loài động vật, thực vật đáy ở phía tây sông Virginia do ảnh hưởng nặng nề của AMD từ công nghiệp khai thác mỏ trong vùng

1.1.2.2 Ô nhiễm đất do AMD

Hoạt động khai thác mỏ và khai thác đá gây phá hủy nhiều vùng đất qua hàng trăm năm, trong đó nhiều vùng không có khả năng phục hồi (Duffield và cs, 2000) Không chỉ hoạt động khai thác mỏ trong quá khứ với công nghệ thô sơ mà cả hoạt động khai thác hiện tại đều được coi là căn nguyên của tình trạng ô nhiễm kim loại nặng tại nhiều vùng đất Các kim loại nặng được tìm thấy trong đất axit bị ô nhiễm

do AMD chủ yếu là Cu, Cd, Fe, Pb, và Zn (Rodríguez và cs, 2009) Các kim loại này tích lũy trong lớp đất bề mặt tạo ra môi trường không thuận lợi cho hệ sinh thái tại đây (Boularbah và cs, 2006), theo đó các lớp đất này bị phá hủy đáng kể, dễ bị xói mòn bởi mưa lũ vì thiếu gắn kết nhờ hệ thực vật Hậu quả tiếp theo là các vùng đất ô nhiễm này trở thành nguồn ô nhiễm nguy hiểm do các dòng chảy bề mặt và dòng chảy ngầm ở vị trí hạ lưu (Vega và cs, 2006) Ảnh hưởng của AMD tới hệ sinh thái của động thực vật cũng được quan sát thấy ở các vùng đất ngập nước (Stephenson và cs, 1995)

Nhiều sự kiện liên quan đến vấn đề ô nhiễm do AMD xảy ra trên thế giới, cũng như thiệt hại về kinh tế và môi trường đã được các tổ chức quốc tế thống kê và công bố (EPA, 1995), dưới đây là một số sự kiện và số liệu thống kê về vấn đề này

Bảng 1.2 Một số sự kiện liên quan đến ô nhiễm do AMD trên thế giới

1989 Mỹ Trên 5000 cá hồi bị chết ở sông Clark

Fork (Montana) do nước mưa kéo theo AMD từ khu vực khai mỏ

2000 Mỹ Lượng chất độc thải ra của hoạt động

khai thác kim loại chiếm 47 % tổng lượng chất độc của tất cả các ngành công nghiệp

US EPA, 2004a

Mỹ Mỹ dự đoán tiêu tốn khoảng 7 – 24 tỷ

USD để xử lý nước thải của 156 mỏ khai thác đá cứng

US EPA, 2004a

Mỹ Trung tâm chính sách Mỹ ước tính

tiêu tốn khoảng 32 – 72 tỷ USD để tái tạo 363000 vùng đất mỏ bị bỏ hoang

US EPA, 2004b

1.1.2.3 Tình trạng ô nhiễm do AMD ở Việt Nam

Điều kiện địa chất Việt Nam phức tạp tạo nên một nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú, đa dạng nhưng cũng manh mún Theo thống kê, trên lãnh thổ Việt Nam

đã phát hiện được trên 50 trong số 66 loại khoáng sản phổ biến nhất trong vỏ trái đất với khoảng hơn 5000 mỏ và điểm quặng (Hồ Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010) Các khoáng sản được khai thác chủ yếu là than, quặng sắt, titan, đồng; đá cát sỏi làm vật liệu xây dựng; nguyên liệu hoá chất, công nghiệp như apatit, pyrite (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Các mỏ khoáng sản chủ yếu đang đƣợc khai thác tại Việt Nam (Hồ

Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010)

Khoáng sản Số mỏ đang khai

được đầu tư cho công nghệ và có truyền thống về tập trung khai thác than mạnh nhất trong cả nước nhưng hoạt động khai thác tại đây luôn có những diễn biến phức tạp, gây tác động xấu đến nhiều lĩnh vực kinh tế, xã hội và môi trường (Hồ Sỹ Giao

và Mai Thế Toản, 2010)

Theo báo cáo Đánh giá môi trường chiến lược Quy hoạch phát triển ngành than đến năm 2020, có xét đến năm 2030, các mối nguy hại do ô nhiễm nước thải từ các mỏ than thuộc Tập đoàn Công nghiệp than và Khoáng sản đã được đặt ra ở mức báo động

Dựa trên số liệu kê khai nộp phí bảo vệ môi trường đối với nước thải công nghiệp của các đơn vị thuộc ngành than, tổng lượng nước thải từ mỏ năm 2009 là 38.914.075 m3 Tuy nhiên con số này chưa thể phản ánh đầy đủ thực trạng vì chưa thể tính được lượng nước rửa trôi từ các bãi thải mỏ Ngoài ra, lượng và thành phần nước thải từ mỏ lại dao động, phụ thuộc vào sản lượng khai thác than từng năm, trong đó độ pH dao động từ 3,1 đến 6,5, hàm lượng chất rắn lơ lửng cao hơn ngưỡng cho phép từ 1,7 đến 2,4 lần Nước thải từ mỏ ở Quảng Ninh đã và đang gây

ra nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thống sông, suối, hồ vùng ven biển tại đây như gây bồi lấp, làm mất nguồn thủy sinh, suy giảm chất lượng nước Hơn thế nữa,

ô nhiễm tại vùng mỏ mang tính tích lũy, cộng với tác động của nạn khai thác than trái phép trong thời gian dài, dẫn đến tình trạng mất kiểm soát, thậm chí một số hồ thủy lợi vùng Đông Triều đã bị chua hóa, ảnh hưởng đến chất lượng nước phục vụ nông nghiệp (Hồ Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010)

Kết quả phân tích nước thải năm 2010 tại một số khai trường trên địa bàn các tỉnh Quảng Ninh, Thái Nguyên, Lạng Sơn cho thấy nước thải từ các mỏ thường có màu đậm, độ pH thấp Nước thải tại các khu khai thác mỏ Cọc Sáu, Cao Sơn, Mông Dương, Mạo Khê, Vàng Danh…đều có hàm lượng chất lơ lửng cao hơn qui chuẩn nhiều lần Đặc biệt, hầu như nước thải tại các mỏ than đều bị ô nhiễm Mn, vượt quá qui chuẩn cho phép

Ảnh hưởng từ nước thải mỏ đã làm suy giảm chất lượng nước mặt tại các điểm sông, suối, hồ trong khu vực lân cận các mỏ than, trong đó nước tại Quảng Ninh có dấu hiệu ô nhiễm nặng hơn ở Thái Nguyên và Lạng Sơn Ngoài ra, hoạt động khai thác than từ thời thuộc địa với công nghệ cũ, khai thác than trái phép và khai thác than lộ thiên còn làm hạ thấp tầng chứa nước ngầm, làm suy giảm trữ lượng nước ngầm và có nguy cơ bị axit hóa Nước ở các mỏ than thường có hàm lượng các ion kim loại nặng, á kim, các hợp chất hữu cơ, các nguyên tố phóng xạ… cao hơn so với nước mặt và nước biển khu vực đối chứng và cao hơn TCVN từ 1-3 lần, đặc biệt là khu vực từ Quảng Yên đến Cửa Ông (Hồ Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010)

Tại Nghệ An, việc khai thác, đào bới và đổ thải tại các mỏ thiếc, đá quý đã làm cho các khe Bản Sỏi, Khe Mồng, Tổng Huống (là nguồn cấp nước cho nông nghiệp của khu vực) bị xói lở bờ, bồi lấp dòng chảy, đổi dòng, giảm khả năng tưới

từ đó gây ra giảm vụ, giảm năng suất cây trồng Khe Nậm Tôn bị đục và bị ô nhiễm trên chiều dài hơn 20 km, diện tích lên đến 280 ha Khai thác đá quý ở Quỳ Châu đã làm một số suối và công trình thủy lợi bị phá hủy, các hố khai thác sâu là nơi tích tụ chất thải làm ô nhiễm nguồn nước (Hồ Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010)

Vùng ven biển Nam Trung bộ, ô nhiễm phóng xạ do khai thác mỏ sa khoáng titan (còn gọi là cát đen) đã được ghi nhận Quặng này được khai thác theo công nghệ đào cát và làm giàu quặng bằng nước, hậu quả là hàng trăm nghìn tấn cát bị đào xói mỗi năm, theo đó khối lượng cát thải, chất thải khổng lồ bị san ủi ra môi trường xung quanh, nước từ quá trình tuyển khoáng cho chảy trực tiếp ra biển, mà không qua xử lý Trong quặng ilmenit, zircon có các khoáng vật chứa phóng xạ, nhất là khoáng vật monazit, có hàm lượng phóng xạ cao, rất nguy hiểm cho sức khỏe con người Sự ô nhiễm phóng xạ nước biển lân cận mỏ sa khoáng chắc chắn ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe người dân trong vùng, vì cá và muối đều có thể tích tụ các chất phóng xạ trong nước biển thải ra từ khai trường, xưởng tuyển của mỏ (Hồ Sỹ Giao và Mai Thế Toản, 2010)

1.1.2.4 Hiện trạng quản lý và xử lý AMD ở Việt Nam

Ở nước ta, việc khai thác tài nguyên thiên nhiên chủ yếu được thực hiện với các công nghệ và nguồn nhân lực chất lượng thấp, cùng với bất cập trong quản lý tài nguyên, môi trường nên đã dẫn đến hệ quả là tài nguyên thiên nhiên đang bị khai thác quá mức, và môi trường ở những nơi khai thác bị ô nhiễm, suy thoái nặng

Tuyển quặng than chiếm tỷ trọng lớn trong ngành khai thác khoáng sản ở Việt Nam Hàng năm, hoạt động khai thác và chế biến than tạo ra một lượng lớn chất thải rắn là quặng đuôi, trong thành phần có chứa các hóa chất tuyển khoáng và nhiều kim loại khác Quặng đuôi cùng với nước thải thông thường được thu gom tại các hồ chứa, tuy nhiên nhiều hồ có chất lượng kém hoặc bảo trì không tốt nên vật liệu thải thoát ra ngoài gây ô nhiễm đất và nước xung quanh (Nguyễn Danh Sơn, 2011)

Đá thải, quặng đuôi chứa nhiều sulfur có thể gây ra hiện tượng dòng thải axít (AMD) Điển hình là AMD thường được hình thành ở các đường vào mỏ bị bỏ hoang hay điểm tập trung quặng đuôi và đá thải Do chưa có hệ thống quan trắc và kiểm toán chất thải tại các mỏ than nên chưa có số liệu chính xác về khối lượng các chất thải rắn cũng như nước thải AMD từ trước tới nay Tuy nhiên, sự tích tụ nhiều năm với sự tác động tiêu cực lâu dài đối với môi trường của loại chất thải này cần được lưu ý và sớm có giải pháp xử lý (Nguyễn Danh Sơn, 2011)

Đối với các khoáng sản được khai thác quy mô nhỏ, vấn đề môi trường tương tự từ chất thải, nhất là nước thải cũng ở mức báo động Do các mỏ nhỏ thường nằm ở vùng xa và công tác quản lý còn nhiều bất cập nên ở hầu hết các nơi khai thác khoáng sản sau khi kết thúc khai thác (đóng cửa mỏ) thì việc phục hồi môi trường cho những vùng đất bị ảnh hưởng từ việc khai thác mỏ thường không được thực hiện và để lại những hệ quả xấu cho môi trường sinh thái (Nguyễn Danh Sơn, 2011)

Nhìn chung, chất thải rắn tồn đọng, lưu cữu hàng chục năm từ việc tuyển quặng là hiện trạng ở Quảng Ninh và hầu hết các địa phương có khai thác khoáng

sản Công nghệ khai thác lạc hậu, trong khi công nghệ tái sử dụng, xử lý lại hầu như vắng bóng dẫn đến hệ số phát thải chất thải rắn trong khai thác khoáng sản ngày càng lớn Đối với nước thải, tuy có những quy định về xử lý gắn với trả phí bảo vệ môi trường, nhưng sự bất cập trong thực thi các quy định cũng đã làm cho bức tranh

ô nhiễm môi trường do nước thải từ khai thác khoáng sản ngày càng nặng nề (Nguyễn Danh Sơn, 2011)

1.2 Xử lý AMD

1.2.1 Xử lý AMD bằng phương pháp hóa học

Các chất hóa học thường được sử dụng để xử lý AMD gồm CaCO3, Ca(OH)2,

Na2CO3, NaOH và NH3 Đặc điểm và hiệu quả xử lý khi sử dụng các tác nhân trung hòa này được thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Các biện pháp hóa học trong xử lý AMD (Skousen và cs, 1996) Hóa chất

30 % Do hiệu quả trung hòa thấp (độ hòa

tan thấp) và sự hình thành lớp Fe(OH)3 bên ngoài nên khả năng ứng dụng bị hạn chế

Ca(OH)2 Tương đối rẻ (100

USD / tấn)

90 % Mặc dù xử lý hiệu quả nhưng có

nhược điểm là tạo lượng bùn lớn

Na2CO3 Giá thành cao gấp

3 lần Ca(OH)2 (320 USD / tấn)

60 % Chỉ xử lý hiệu quả dòng chảy

AMD nhỏ, nồng độ axít và kim loại thấp

NaOH Giá thành rất cao

(880 USD / tấn)

100 % Thường được sử dụng để xử lý ở

nơi có dòng chảy thấp, nồng độ axit cao NaOH làm tăng pH nhanh nhưng chi phí lớn và nguy hiểm

khi sử dụng

NH3 Giá thành cao

(680 USD / tấn)

100 % Xử lý hiệu quả AMD có nồng độ

sắt (II) cao và chứa mangan Sử dụng NH3 chi phí thấp hơn NaOH

và có những lợi thế tương tự, nhưng nhược điểm lớn nhất là gây độc cho sinh vật nên thường không được phép sử dụng ở hầu hết các quốc gia

Tuy phương pháp hóa học được sử dụng từ lâu và có hiệu quả nhanh chóng nhưng

tốn kém và không an toàn, thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp (Skousen

và cs, 1996)

1.2.2 Xử lý AMD bằng phương pháp sinh học

1.2.2.1 Cơ sở khoa học của công nghệ

Đặc điểm của AMD là có pH thấp, nồng độ sulfate và kim loại cao vượt mức cho phép nhiều lần và mục đích của các công nghệ xử lý AMD là nhằm giải quyết ba yếu tố này Vi khuẩn khử sulfate (SRB) là các vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa hydro hay các hợp chất hữu cơ

và tận thu năng lượng cho mục đích sinh trưởng (phản ứng 1.10)

2CH2O + SO42 + H+ H2S + 2HCO3 (1.10) Các sản phẩm trao đổi chất của SRB (H2S và 2HCO3) có tác dụng trong việc

xử lý AMD, trong đó sulfide hòa tan sẽ tạo phản ứng kết tủa với một số kim loại trong AMD đồng thời tăng pH (phản ứng 1.11), các ion bicarbonate thì làm tăng pH

và tính kiềm của nước thải

H2S + Me2+ MeS + 2H+ (1.11)

Phản ứng của các kim loại trong môi trường có sulfide khác nhau, tuy nhiên phần lớn các kim loại chính của AMD được loại khỏi nước thải dưới dạng kết tủa của sulfide kim loại (bảng 1.5)

Bảng 1.5 Phản ứng của kim loại trong môi trường có sulfide

Cd, Cu, Fe, Pb, Mer, Ni, Zn Tủa ở dạng sulfide (Doshi, 2006)

As, Ath, Mo Tạo thành các phức hợp với

sulfide

(Figueroa, 2005)

Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Cd,

Mer, Pb

Có thể bị loại khỏi nước thải nhờ

cơ chế đồng kết tủa với các muối sulfide kim loại khác

(Figueroa, 2005)

U (VI) Có thể bị khử thành U(IV) ít tan

trong nước hơn (nhờ SRB)

S2 và kết tủa ở dạng sulfide) (Cabrera và cs, 2006)

1.2.2.2 Một số quy trình công nghệ xử lý AMD nhờ SRB

Công nghệ xử lý AMD sử dụng SRB là phương pháp thụ động, lợi dụng những quá trình chuyển hóa sinh học vào mục đích loại bỏ chất ô nhiễm Ưu thế của công nghệ

là chi phí thấp, không đòi hỏi theo dõi thường xuyên, có thể triển khai ở những vùng xa, sử dụng những vật liệu thải hoặc tái chế Tuy nhiên công nghệ cũng có một số yếu điểm, trong đó nổi bật nhất là tính không ổn định đối với lưu lượng thải lớn và đậm đặc, có thể bị ảnh hưởng của thời tiết, đòi hỏi quy trình bảo trì bảo

dưỡng thường xuyên, và yêu cầu về diện tích khá lớn Tuy nhiên, xét về tổng thể công nghệ xử lý AMD sử dụng SRB vẫn được đánh giá là công nghệ hữu hiệu, có hiệu quả cao về kinh tế (Doshi, 2006) Một số quy trình công nghệ được sử dụng rộng rãi trong xử lý AMD từ các mỏ khai thác khoáng sản được liệt kê ở bảng 1.6

Bảng 1.6 Một số quy trình công nghệ xử lý AMD

Bãi lọc kỵ khí (anaerobic wetlands) (Brenner, 2001; USDA, EPA, 2000)

Nước chảy dưới bề mặt bãi lọc được cách ly

với không khí bằng cột nước hoặc vật liệu che

trên bề mặt

Tăng pH, khử sulfate, tủa sulfide kim loại, sử dụng thực vật thủy sinh để hấp phụ hoặc hấp thu kim loại

Hệ thống tạo kiềm liên tục (successive alkalinity producing systems, SAPS)

(Kepler, McCleary, 1994; Zipper, Jage, 2001)

Hệ thống dòng chảy đứng qua lớp đá vôi và

cơ chất hữu cơ

Tăng pH, khử sulfate, kết tủa kim loại

Bể phản ứng khử sulfate (sulfate-reducing bioreactor) (Gusek, 2002)

Nước thải được thu gom và chảy qua bể kỵ

khí chứa chất hữu cơ và vi khuẩn SRB

Tăng pH, khử sulfate, tủa kim loại

Màng lọc thẩm thấu (permeable reactive barriers)

Bổ sung hóa chất (Chaney và cs, 2000)

Bổ sung các chất hỗ trợ xử lý vào nguồn

AMD hoặc nơi thu gom

Tăng pH, khử sulfate và tủa kim loại, hấp phụ, tạo phức, phủ xanh

Tuy nhiên, từ nhiều năm kinh nghiệm triển khai công nghệ, các chuyên gia

đã cho thấy quy trình bể phản ứng khử sulfate có nhiều ưu điểm hơn so với các quy trình công nghệ còn lại, cụ thể là:

 Bể phản ứng sinh học khử sulfate có thể làm giảm nồng độ các kim loại hòa tan và axit trong khoảng thời gian vài năm, ngay cả ở điều kiện nồng độ nhôm cao Đối với công nghệ SAPS, nồng độ nhôm cao dẫn tới sự hình thành gipsit (hydroxit nhôm) gây tắc nghẽn các đường dẫn, gây cản trở hệ thống dòng chảy đứng (Rose và cs, 2001; Brookens và cs, 2000) Tương tự,

ở công nghệ màng lọc thẩm thấu, sự thay đổi cơ chất có thể làm bít màng Công nghệ bổ sung hóa chất ít được sử dụng và hiệu quả lâu dài chưa được biết đến

 Tận dụng được một số dạng chất thải hữu cơ như phoi bào, mùn cưa, cỏ khô, rơm, phân ủ, phân động vật, các chất thải hàng ngày, bùn được xử lý một phần, rỉ đường,

 Phục hồi nhanh các biến đổi về dòng chảy và thay đổi thời tiết Hiệu suất của

bể phản ứng và hóa học của nước không bị ảnh hưởng khi dòng chảy biến đổi Ảnh hưởng của dòng chảy cao có thể được khắc phục bằng cách dùng van ở bể phản ứng hoặc xả vào các ao để dự trữ nước (Nordwick và cs, 2006) Trong khi đó sự thay đổi của dòng chảy và thời tiết có ảnh hưởng rất lớn đối với quy trình SAPS hay hệ thống màng lọc thẩm thấu

 Có thể tận dụng các mỏ dưới lòng đất bị bỏ hoang để xây dựng bể phản ứng khử sulfate

 Bể phản ứng khử sulfate có khả năng duy trì điều kiện khử tốt hơn các quy trình khác, như SAPS (Rose và cs, 2001) hay bãi lọc kỵ khí (Skousen và cs, 1999)

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình xử lý AMD bằng SRB

Là quy trình công nghệ dựa trên hoạt động của vi sinh vật, quá trình xử lý AMD bị chi phối bởi các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất sinh lý, sinh hóa của SRB, cụ thể là:

phân bò, bùn cống hay bùn cặn từ các hệ thống xử lý nước thải yếm khí và các nguồn khác

làm chất cho điện tử để khử sulfate (Logan và cs, 2005) Trong xử lý AMD, cacbon đơn giản đôi khi được bổ sung vào hệ thống xử lý để cho SRB phát triển, thông dụng nhất là methanol và ethanol (Tsukamoto và cs, 2004) Để

ổn định hệ thống xử lý, trong nhiều trường hợp giá thể được đưa vào cùng với cơ chất hữu cơ Thực tế cho thấy gỗ (dăm bào) và đá sỏi có tác dụng tốt hơn so với giá thể bằng nhựa (Tsukamoto và cs, 2004)

Trong trường hợp chất hữu cơ cao phân tử có mặt trong môi trường thì trước hết bị phân hủy bởi các loài vi khuẩn dị dưỡng thành các hợp chất cacbon đơn giản, sau đó mới được SRB tiếp cận Bước thủy phân các hợp chất cao phân tử là bước giới hạn của việc tạo H2S, do đó để tăng tốc quá trình xử lý cần tác động vào bước này (Logan và cs, 2005) Ví dụ trường hợp cellulose được sử dụng làm cơ chất, do quá trình thủy phân diễn ra tối ưu ở pH6 nên pH của hệ thống cần phải được điều chỉnh tương ứng (Logan và cs, 2005)

 pH: SRB ưa axit hoặc có tính chống chịu cao đối với môi trường axit có lợi

thế trong xử lý AMD SRB được biết đến với khả năng sinh trưởng trong biên độ pH rộng Jong & Parry (2006) chứng minh SRB ở pH 6 – 4 có hoạt tính khử sulfate ở mức 553 – 1052 mmol/m3/ngày, nhưng khi pH xuống dưới 3,5 hoạt tính chỉ còn ở mức 3,35 mmol/m3/ngày SRB chịu axit có thể được đưa vào hệ thống xử lý, tuy nhiên để duy trì hoạt tính cao hơn và tạo điều kiện cho quá trình kết tủa kim loại, pH ban đầu cần điều chỉnh lên mức  4

sinh trưởng của quần thể vi khuẩn, giảm tốc độ khử sulfate và ức chế quá

trình xử lý (Cabera và cs, 2006) Hỗn hợp chủng SRB (Desulfovibrio spp.)

và cs, 1994) Trong hệ thống xử lý tồn tại các khu vực có điều kiện vi môi trường khác nhau, do vậy ảnh hưởng của kim loại lên vi SRB có thể không đồng đều

2004) Ở những nơi có nhiệt độ thấp, việc bổ sung SRB chịu lạnh có thể cải thiện đáng kể tình trạng xử lý của hệ thống xử lý (Higgins và cs, 2003)

1.3 Đặc tính sinh học của SRB

SRB là vi khuẩn hô hấp kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các hợp chất hữu cơ đơn giản và hydro SRB được tìm ra lần đầu tiên vào năm 1895 do nhà vi sinh vật học người Hà Lan Beijerinck SRB phổ biến trong môi trường kỵ khí, nơi chúng có vai trò quan trọng trong cả chu trình lưu huỳnh và chu trình cacbon (hình 1.2)

1.3.1 Phân bố của SRB trong tự nhiên

SRB phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên có chứa sulfate Chúng được phân lập hoặc được tìm thấy (dựa trên các dấu vết phân tử) từ các mẫu trầm tích biển (Webster và cs, 2006; Mussmann và cs, 2005; Ravenschlag và cs, 2000; Boschker

và cs, 1998), các vực thủy nhiệt (Jeanthon và cs, 2002), mỏ dầu khí (Kniemeyer và

cs, 2007), bùn núi lửa (Stadnitskaia và cs, 2005), và phong phú trong các thảm vi sinh vật muối cao, thậm chí ở nơi có nồng độ oxy bão hòa (Minz và cs,

1999; Rissati và cs, 1994) SRB đã được tìm thấy trong môi trường có pH cực trị, như ở các điểm thoát nước thải khai mỏ axit pH2 (Sen, 2001) hay trong các hồ soda

có pH10 (Geets và cs, 2006) SRB được tìm thấy và phân lập từ các mỏ dầu (Nilsen

và cs, 1996) cũng như sâu dưới bề mặt (Kovacik, 2006) Chúng cũng có mặt trong các trầm tích nước ngọt (Sass và cs, 1998), trong rễ của thực vật (Hines và cs, 1999; Bahr và cs, 2005), các tầng ngập nước và các hệ thống xử lý nước thải kỵ khí (Dar

và cs, 2007; Ben-Dov và cs, 2007; Dar và cs, 2005; Wawer và cs, 1997; Oude Elferink và cs, 1994; Ramsing và cs, 1993)

Hầu hết SRB sống tự do, nhưng cũng có một số sống hợp tác với các vi sinh vật khác như cổ khuẩn sử dụng metan (Boetius và cs, 2000), hoặc thậm chí trong một mối quan hệ thân thiết hơn, ví dụ như sống cùng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh trong cơ thể các động vật thân mềm ở biển (Dubilier và cs, 2001)

1.3.2 Đa dạng về di truyền của SRB

Dựa trên phân tích so sánh trình tự 16S rDNA và đặc tính sinh lý sinh hóa, SRB được chia thành 4 nhóm (hình 1.3)

Nhóm 1: Bao gồm phần lớn SRB được biết đến hiện nay, thuộc 23 chi nằm

trong phân lớp -Proteobacteria Đây là các loài SRB Gram (), ưa ấm (20 – 40C),

đa dạng về hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa Các chi chính là Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfobotulus, Desulfoarculus, Desulfopila

Hình 1.3 Đa dạng di truyền của SRB dựa trên so sánh trình tự 16S rDNA (Muyzer

và Stams, 2008)

Nhóm 2: Gồm các loài SRB Gram (+), sinh bào tử, chủ yếu thuộc chi

Desulfotomaculum, sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ ấm, có thể chịu được nhiệt

độ cao nhờ bào tử

Nhóm 3: Gồm các loài SRB ưa nhiệt như Thermodesulfovibrio) và

Thermodesulfobium (Mori và cs, 2003) SRB thuộc nhóm này sinh trưởng tối ưu ở

65 – 70C, thường có mặt ở các môi trường có nhiệt độ cao như các vực thủy nhiệt, suối nước nóng

Nhóm 4: Gồm các cổ khuẩn khử sulfate ưa nhiệt, sinh trưởng ở nhiệt độ trên

80C, đươc tìm thấy ở các vực thủy nhiệt ở biển Đại diện gồm có chi

Archaeoglobus thuộc lớp Euryarchaeota, chi Thermocladium (Itoh và cs, 1998) và

chi Caldirvirga (Itoh và cs, 1999) thuộc lớp Crenarchaeota

1.3.3 Đặc điểm sinh lý của SRB

1.3.3.1 Nhu cầu dinh dƣỡng của SRB

Hầu hết SRB có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường

có nguồn cacbon/năng lượng ổn định (Postgate, 1984) Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate và rượu (Hao và cs, 1996) Tuy nhiên, lactate và acetate là nguồn điện tử thường được sử dụng nhất trong thí nghiệm phân lập và nuôi cấy SRB (Widdel, Hansen, 1991) Ngoài các hợp chất cacbon hữu cơ, khí hydro có thể làm chất cho điện tử để khử sulfate (Postgate, 1984) Một số SRB có thể sinh trưởng tự dưỡng với H2 là chất cho điện tử và CO2 là nguồn cacbon duy nhất (Postgate, 1984)

Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể được phân chia thành hai nhóm trao đổi chất như sau (Widdel, 1988):

Thuộc nhóm này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp

acetate) hoàn toàn thành CO2. Trong nhóm này có đa dạng các loài SRB

khác nhau, như Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina

spp

SRB thực hiện trao đổi chất oxy hóa các cơ chất hữu cơ sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng (Postgate, 1984) Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá trình sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme (hình 1.4) (Fauque và cs, 199; Kremer, Hansen, 1988)

Hình 1.4 Các bước khử sulfate ở SRB và các enzyme tham gia

Phản ứng có thể được tóm tắt như sau (Peck và Lissolo, 1988):

SO42 → SO32 → HSO3→ HS → S2 (1.12) Ngoài sulfate, SRB còn có khả năng sử dụng một số hợp chất ở mức oxy hóa cao khác làm chất nhận điện tử trong quá trình tích lũy năng lượng, ví dụ như nitrat (NO3), sắt (Fe3+), hay thậm chí cả oxy như một số loài thuộc chi Desulfovibrio

(Muyzer và Stams, 2008)

Bên cạnh đó phải kể đến một số chất đặc biệt khác có thể làm chất nhận điện

tử cho SRB như acrylate, arsenate, chromate hay uranium, các hợp chất chứa clo, theo đó mà SRB có vai trò quan trọng trong các quá trình phân hủy sinh học, loại bỏ chất độc ô nhiễm trong môi trường (Muyzer và Stams, 2008)

1.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của SRB

Nhiệt độ, pH, độ muối SRB có thể sinh trưởng trong dải pH rộng (5,5 – 9,0), tuy

nhiên tốt nhất ở điều kiện kiềm nhẹ với pH trong khoảng 7,0 – 7,8 (Pfennig và cs, 1981) Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm trong khoảng 28 – 38C đối với SRB ưa ấm (Widdel, Pfennig, 1984) Dải muối từ 1 – 4% NaCl thích hợp đối với sự sinh trưởng của hầu hết SRB (Ollivier và cs, 1994) Tuy nhiên, quá trình khử sulfate do vi khuẩn còn được quan sát ở các môi trường khắc nghiệt có nhiệt độ, pH hay độ mặn đặc biệt (Zeikus và cs, 1983)

Nồng độ sulfide Sulfide có tính độc cao đối với tế bào sinh vật, gây phá hủy các

protein và bất hoạt tế bào (Postgate, 1984) Phần lớn vi sinh vật chỉ có khả năng hoạt động ở môi trường không có sulfide hoặc sulfide ở nồng độ thấp Đối với SRB,

sự kết tủa các kim loại nguyên tố vết ở dạng sulfide kim loại là cần thiết để giảm nồng độ sulfide trong môi trường, tạo điều kiện cho sự sinh trưởng (Bharathi và cs, 1990) Ngoài ra, các polymer ngoại bào ở SRB có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi sự ảnh hưởng của chất độc ở mức độ nhất định (Teitzel and Parsek, 2003)

Trạng thái của sulfide phụ thuộc vào pH của môi trường Tại pH 7, sulfide tồn tại ở cả dạng H2S và S2-, nhưng chủ yếu là ở dạng H2S (Perry và Green, 1984) Theo Speece (1983), trong hai dạng tồn tại của sulfide chỉ có H2S có khả năng đi vào trong màng tế bào và gây ức chế

1.3.3.3 Cạnh tranh của SRB với các nhóm vi khuẩn khác trong môi trường

Trong môi trường kỵ khí có thế oxy hóa khử thấp và có sẵn nguồn cơ chất phù hợp, SRB cạnh tranh với các vi sinh vật kỵ khí khác như vi khuẩn khử nitrate, vi khuẩn khử Fe(III), vi khuẩn sinh acetate và cổ khuẩn sinh metan (methanogens) (hình 1.5)

Cặp oxy hóa khử SO42 /HS ở mức khoảng 0,2 mV, sau các cặp O2/H2O,

NO3/N2, Fe3+/Fe2+, có nghĩa là năng lượng tạo ra khi oxy hóa một chất hữu cơ bằng sulfate sẽ thấp hơn so với oxy hóa bằng oxy, nitrate hay Fe(III) Tuy nhiên thế oxy hóa khử và hàm lượng sulfate trong môi trường có thể quyết định khả năng cạnh tranh của quá trình khử sulfate với các quá trình khác (Schink và cs, 2006) Bên cạnh đó, sản phẩm trao đổi chất sulfide của SRB còn là yếu tố ức chế thứ cấp đối với các loài vi sinh vật khác khi sinh trưởng trên cùng một loại cơ chất (Stams và

cs, 2003)

có thể cạnh tranh được với methanogen để sử dụng nguồn cơ chất cho quá trình khử sulfate thành sulfide (Brysch và cs, 1987; Weijma và cs, 2002) Giữa các loài SRB,

Desulfovibrio spp có ái lực cao nhất với sulfate, tiếp đó là các loài Desulfobulbus

và Desulfobacter (Laanbroek và cs, 1984)

 Hóa chất và một số kit dùng cho sinh học phân tử do các hãng Bioneer – Hàn Quốc, Fermentas – Đức, Qiagen – Mỹ, ABI – Mỹ, BioRad – Mỹ cung cấp

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế

 Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc

 Máy đo pH Horiba, Nhật Bản

 Máy ly tâm Eppendoff, Đức

 Máy ly tâm siêu tốc Beckman Counter, Mỹ

 Máy PCR Eppendoff, Đức

 Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ

 Máy DGGE DcodeTM universal Mutation Detection System BioRad, Mỹ

 Máy GelDoc BioRad, Mỹ

 Máy đo quang phổ UV – Vis (GBC instrument, Úc)

 Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Bản

 Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang Zeiss, Đức

Ngoài ra, một số thiết bị, dụng cụ cần thiết khác được sử dụng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí như bình N2, CO2, ống nghiệm nút xoáy, pipet pasteur, bình serum, nút cao su, bình duran, màng lọc vi khuẩn…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chỉnh pH ở 7 – 7,2, sau đó san môi trường sang các bình serum hoặc ống nghiệm rồi sục khí N2 trong 30 giây, đậy bình và ống nghiệm bằng nút cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở, sử dụng ngay hoặc bảo quản trong tối

Bảng 2.2 Thành phần hỗn hợp vi lƣợng và vitamin (Widdel, Bak, 1992)

HCl 25% (7,7 M) 13 ml Na2HPO4/NaH2PO4 25 mM pH 7,1: 100 ml

MnCl2.4H2O 100 Nicotinic acid (Niacin) 10

CoCl2.6H2O 190 Calcium-D(+)- Pantothenat 5

Na2MoO4.2H2O 36 Na-2- Mercaptoethan sulfonat 25

Thêm nước cất đến 1000 ml

Làm giàu SRB SRB trong mẫu nước thải thu thập về được làm giàu bằng cách cấy

vào bình serum chứa môi trường dịch thể kỵ khí nước ngọt cho vi khuẩn khử sulfate (bảng 2.1) với tỷ lệ 10%, nuôi trong tủ ấm 30oC Các lần cấy truyền tiếp theo được tiến hành sau mỗi 5 – 7 ngày nuôi cấy theo tỷ lệ 10% thể tích Qua mỗi lần cấy truyền, số lượng SRB trong mẫu được tăng lên

Phân lập SRB Mẫu làm giàu lần 4 được dùng để phân lập SRB Việc phân lập

được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với

môi trường có thành phần tương tự môi trường dùng trong làm giàu (Widdel, Bak, 1992) Ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ mẫu làm giàu được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược tại 30oC trong bóng tối Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể

2.2.2 Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu

Nhiệt độ Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ

khí có pH = 7, ở các nhiệt độ: 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 37oC Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày)

pH Các chủng SRB thuần khiết và hỗn hợp chủng SRB được nuôi cấy trong môi

trường dịch thể kỵ khí có pH khác nhau: pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 trong tủ ấm

30oC Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày)

Độ muối Các chủng SRB thuần khiết được nuôi trong môi trường dịch thể kỵ khí ở

pH 7, có độ muối khác nhau là 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25 g/l Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày)

Chất cho điện tử Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch

thể kỵ khí có bổ sung các chất cho điện tử khác nhau như lactate, acetate, methanol (10 mM mỗi loại) và sulfate (28 mM) là chất nhận điện tử duy nhất Sinh trưởng của SRB được đánh giá sau 5 ngày nuôi cấy thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600)

Chất nhận điện tử Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường

dịch thể kỵ khí có bổ sung lactate (10 mM) là chất cho điện tử và một trong các chất nhận điện tử khác như Fe(III)-citrate (20 mM), Na-nitrate (5 mM) Dịch nuôi với sulfate (28 mM) là đối chứng dương Sinh trưởng của SRB được đánh giá sau 5 ngày nuôi cấy thông qua xác định sinh khối (OD600)

2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết

DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996) mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm: 100

mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM đệm phosphate (Na2HPO/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB) Các bước tiến hành như sau:

4- Trộn 2 ml mẫu môi trường với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol 15 ml

 Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở

C trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần

 Bổ sung với lượng tương đương PCI về thể tích, sau đó trộn đều Ly tâm

6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

 Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, lặp lại bước trên 1 lần

 Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ

 Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng

Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng

 Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng

 Hòa tan DNA trong 50 µl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở 20oC

DNA genome của chủng thuần khiết được tinh sạch theo phương pháp của Marmur (1961), gồm các bước như sau:

 1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 – 10 000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8)

 Thêm 50 µl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong

1 giờ

 Thêm 50 µl SDS (20%) và 50 µl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong

bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ

 Thêm 400 µl PCI, trộn đều trong 1- 3 phútt, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút Lặp lại bước vừa rồi thêm 1 lần

 Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đó

để lạnh -20o

C), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ

 Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA

 Rửa DNA trong ethanol 70% (đó để lạnh 20oC) trong 1 phút, ly tâm 13 000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng

 Hòa tan DNA trong 50 µl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại

20C cho các thí nghiệm tiếp theo

Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100 V trong thời gian 15 phút Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia

UV trên máy GelDoc (BioRad)

2.2.4 Phương pháp điện di biến tính DGGE

Hình 2.1 Vị trí đoạn gen 16S rDNA được sử dụng trong phân tích DGGE ở

Lactobacillus plantarum (Lopez và cs, 2003)

Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp) Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với

độ dài 550 bp (hình 2.1) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCTACGGGAGGCAGCAG) và 907R (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT) (Muyzer và cs, 1993) Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên

(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGCCGGGGCGGGGGCACGGGGGG) được gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F “Touch-down” PCR (bảng 2.5) được sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE

Thành phần phản ứng Thể tích

(µl) Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR

H2O MQ 27 Taq polymerase được đưa vào phản

ứng sau bước biến tính đầu tiên ở

94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt

80○C Nhiệt độ gắn mồi được đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C) Sau mỗi chu kỳ, nhiệt

độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút

DGGE Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính

urea/formamid từ 30% đến 60% Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60C, tại 200 V, trong 3,5 giờ Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad)

Cắt băng và thôi gel Băng điện di được cắt, rửa và thôi trong nước qua đêm tại

4C Dịch thôi DNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 2.5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng kít (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự

2.2.5 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

Gen 16S rDNA (1500 bp) của các chủng SRB thuần khiết được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) và 1492R (GGTTACCTTGTTACGACT T) ( Weisburg và cs, 1991) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 2.6

Bảng 2.6 Phản ứng PCR khuyếch đại gen 16S rDNA

Thành phần phản ứng Thể tích

(µl)

Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu