2.2.6.1. Định lƣợng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983)
Nguyên lý: O-phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 9, đo được ở bước sóng 510 nm. Nồng độ Fe(II) cho phép đo là 0,01 5 mg/l. Kết quả của phép đo có thể bị ảnh hưởng bởi ion Mn và Cu.
Chuẩn bị:
Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ được rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng
Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4 (thể tích).
Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):
CH3COONH4 40 g
CH3COOH 50 ml
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch hydroxyl ammonium chloride 1,4 M (khử Fe3+ thành Fe2+) NH2OH. HCl 10 g
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch phenanthrolin 21 mM (Tạo phức):
C12H9ClN2.H2O 0,5 g
Nước cất đủ 100 ml
(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)
Dung dịch chuẩn:
FeSO4.7H2O 2,78 mg
HCl 25% 6,25 ml
Nước cất đủ 100 ml
Tiến hành:
Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate và 2 ml dung dịch
hydroxyl ammonium chloride, trộn đều bằng vortex, hỗn hợp phải có pH nằm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5).
Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.
Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Đo OD tại bước sóng 510 nm.
Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(II) từ 5 - 50 µM.
2.2.6.2. Định lƣợng sulfate(Dinh và cs, 2004)
Nguyên lý: SO42- kết hợp với Ba2+ tạo kết tủa BaSO4 theo phương trình: Ba2+ + SO42- → BaSO4 kết tủa trắng. Hàm lượng sulfate được xác định thông qua hàm lượng chất kết tủa BaSO4 tạo thành.
Chuẩn bị
Dung dịch BaCl2 0,2 M trong HCl 0,2 M (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
Màng lọc nitrocellulose 0,2 µm Bộ dụng cụ hút chân không
Tiến hành
Sấy màng lọc ở 105oC trong 2 h, sau đó cân xác định trọng lượng. Hút 1 ml dung dịch BaCl2 0,2 M / HCl 0,2 M vào ống nghiệm thủy tinh.
Bổ sung 1 ml mẫu (đã ly tâm) vào ống nghiệm trên, trộn đều (vortex), giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Lọc tủa qua màng nitrocellulose nhờ bộ dụng cụ hút chân không. Lấy màng lọc ra và sấy ở 105oC trong 2 h, sau đó cân lại màng lọc.
Tính toán lượng chất kết tủa tạo thành, suy ra hàm lượng sulfate trong mẫu theo công thức:
Y: Khối lượng màng sau lọc (gam); X: Khối lượng màng trước lọc (gam)
2.2.6.3. Xác định nồng độ sulfide(Cord-Ruwisch, 1985)
Nguyên lý: Ion S2 phản ứng với ion Cu2+ tạo CuS có màu nâu đen dạng huyền phù, đo được nhanh ở bước sóng 480 nm.
Chuẩn bị:
Dung dịch CuSO45 mM trong HCl 50 mM
Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
Tiến hành:
Hút 4 ml dung dịch CuSO4 5 mM / HCl 50 mM vào ống nghiệm
Thêm 100 µl mẫu vào ống nghiệm, đảo đều.
Đo nhanh ở bước sóng 480 nm.
Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ S2
từ 0 – 20 mM
2.2.7 Thiết kế mô hình xử lý AMD
Nguồn AMD: Nguồn AMD được thu thập từ mỏ than Tràng Khê ở Quảng Ninh có các
đặc điểm lý hóa như sau: pH = 4
Nồng độ sắt = 200 mg/l (tương đương 3,57 mM) Nồng độ sulfate = 1320 mg/l (tương đương 13,75 mM)
Giá thể: Phoi bào được lót dưới lớp đáy của bể xử lý
Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàuSRB sau lần cấy truyền thứ 4 (E1-4)
Chu trình xử lý: AMD từ bể điều hòa (1) được chảy vào bể xử lý (2) có chứa cơ chất, giá thể cho vi sinh vật và nguồn SRB. pH và nồng độ sulfate được xác định 1 lần/ ngày. Khi pH tăng lên và nồng độ sulfate giảm đến mức đạt yêu cầu, phần AMD đã được xử lý sẽ được chuyển sang bể chứa 3 theo nguyên lý chảy tràn (hình 2.1).
Hình 2.2. Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm. 1) Bể điều hòa chứa AMD đầu vào; 2) Bể xử lý AMD bằng SRB; 3) Bể lắng chứa nước thải đầu ra.
Mô hình xử lý AMD được hoạt động với nguồn cơ chất cho SRB sinh trưởng được bổ sung từ bên ngoài là methanol hoặc nước thải có hàm lượng hữu cơ cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ các mẫu nƣớc thải
Nguồn nước thải sử dụng để làm giàu SRB gồm có nước trong hồ sinh học xử lý nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương (E1), nước thải trong bể biogas (E2) và nước thải sau biogas (E3) của nhà máy rượu Hà Nội tại Yên Phong,
Bắc Ninh. Các mẫu được lấy từ lớp bùn đáy và nước ở độ sâu 10 20 cm trên bề
mặt đáy, giữ trong bình Duran đóng kín và đưa về phòng thí nghiệm.
Vi khuẩn khử sulfate (SRB) được làm giàu từ các mẫu nước thải đã thu thập ở trên trong môi trường khoáng dịch thể chứa sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử duy nhất và Na-Lactate (10 mM) là chất cho điện tử. pH môi trường trong thí nghiệm làm giàu là 6,5 – 6,8, nhiệt độ nuôi cấy là 30C. Sự sinh trưởng của SRB trong các mẫu làm giàu được nhận biết sau 5 – 7 ngày nuôi cấy thông qua sản phẩm
trao đổi chất sulfide trong phản ứng tạo kết tủa CuS màu nâu với dung dịch CuCl2
(xem chương 2). Cấy truyền dịch làm giàu được thực hiện sau mỗi 5 – 7 ngày khi dịch nuôi có mật độ tế bào cao và tạo nhiều sulfide.
0 2 4 6 8 10 12
E1-4 E2-4 E3-4
N ồn g độ s ul fi de ( m M )
Hình 3.1. Hàm lượng sulfide của các mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ 4. E1-4: Mẫu làm giàu với nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương sau 4 lần cấy truyền. E2-4: Mẫu làm giàu với nước thải trong bể biogas của nhà máy rượu Hà Nội sau 4 lần cấy truyền. E3-4: Mẫu làm giàu với nước thải sau biogas của nhà máy rượu Hà Nội sau 4 lần cấy truyền.
Sau 4 lần cấy truyền, hàm lượng sulfide trong các mẫu làm giàu với các nguồn nước thải khác nhau được định lượng để so sánh mức sinh trưởng của SRB trong đó (hình 3.1). Có thể nhận thấy mẫu làm giàu với nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương (E1-4) sau 4 lần cấy truyền có chứa SRB với hoạt tính cao hơn hai mẫu còn lại (hình 3.1).
Trên cơ sở đó, mẫu này (hình 3.2a) được sử dụng để tiến hành phân lập các chủng SRB thuần khiết. Việc phân lập được tiến hành trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) chứa môi trường khoáng kỵ khí có chất cho và nhận điện tử tương ứng là lactate và sulfate (Widdel, Bak, 1992). Các khuẩn lạc đơn hình thành trong ống thạch (hình 3.2b) được tách riêng bằng đầu pipet Pasteur và chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường dịch thể kỵ khí dành cho SRB.
(a) (b)
Hình 3.2. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate từ mẫu nước thải. (a) – Mẫu làm giàu vi khuẩn SRB E1-4; (b) – Khuẩn lạc SRB hình thành trong ống thạch bán lỏng
Ba chủng SRB được phân lập từ ống pha loãng 108
dựa trên hình thái khác nhau của khuẩn lạc (bảng 3.1).
Bảng 3.1. SRB phân lập đƣợc từ dịch làm giàu với mẫu nƣớc thải E1-4 Tên chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Hình dạng tế bào Đặc điểm chuyển động của tế bào SR2 Hình múi khế 4 cạnh, màu đen
Hình que, có độ dài khác nhau tùy thuộc thời gian và điều kiện nuôi cấy, kích thước tế bào nhỏ nhất 1×3,5 μm (hình 3.3)
Không chuyển động
SR3 Hình múi khế 3
cạnh, màu đen
Hình ovan đơn hoặc xếp chuỗi, kích thước 1×1,5-2 μm (hình 3.3) Chuyển động chậm SR4 Hình đĩa lồi 2 mặt, màu đen
Hình phẩy khuẩn, kích thước 1×2-3 μm (hình 3.3)
Chuyển động nhanh
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. Hình thái tế bào của ba chủng SRB thuần khiết phân lập được từ mẫu dịch làm giàu với nước thải
3.2. Vị trí phân loại của ba chủng SRB dựa trên trình tự gen 16S rDNA
DNA genome của 3 chủng SRB thuần khiết được tách theo phương pháp của Marmur (1961), sau đó sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4).
Hình 3.4. DNA genome của ba chủng SRB phân lập được
DNA tổng số được dùng làm khuôn trong phản ứng PCR để nhân gen 16S rDNA. Với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen 16S rDNA của
E. coli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500 bp. Kết quả kiểm tra bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy các băng có kích thước khoảng 1500 bp đúng như lý thuyết. Băng DNA rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo (hình 3.5).
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng Kit được kiểm tra hàm lượng DNA và độ tinh sạch thông qua phương pháp so màu ở bước sóng 260 nm.
Marker SR2 SR3 SR4
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuyếch đại gen 16S rDNA của các chủng SRB phân lập được trên gel agarose 1%.
Trình tự gen 16S rDNA được đọc với 3 đoạn mồi 27F, 800F và 1492R (các số tương ứng với các vị trí nucleotide trên gen 16S rDNA ở E. coli). Đoạn gen 16S rDNA gần đủ của mỗi chủng sau đó được tạo ra bằng việc cắt các đoạn trùng lặp và ghép nối các trình tự có được với 3 đoạn mồi nói trên sử dụng công cụ tạo trình tự Contig trong phần mềm BioEdit. Sau đó chuỗi trình tự này được so sánh với các gen 16S rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen bằng chương trình BLAST Search, theo đó độ tương đồng của các chủng SRB phân lập được so với các chủng đã công bố như sau:
Chủng SR2 có độ tương đồng 98% so với Desulfomicrobium baculatum.
Chủng SR3 có độ tương đồng 98% so với Desulfobulbus propionicus.
Chủng SR4 có độ tương đồng 98% so với Desulfovibrio magneticus.
Vị trí phân loại của ba chủng SRB mới phân lập so với các loài SRB có liên hệ gần gũi dựa trên trình tự gần đủ của gen 16S rDNA được biểu diễn trên cây phân loại ở hình 3.6. Trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S rDNA, ba chủng SRB mới phân lập được định danh tương ứng là Desulfomicrobium sp. SR2, Desulfobulbus sp. SR3 và Desulfovibrio sp. SR4.
Marker SR2 SR3 SR4 ĐC()
Hình 3.6. Cây phân loại neibourgh joining dựa trên trình tự gen 16S rDNA gần đủ của các chủng SRB mới phân lập so sánh với các loài SRB có quan hệ gần gũi.
Escherichia coli (-Proteobacteria) được chọn làm outgroup.
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập
Để có thể sử dụng các chủng SRB mới phân lập trong các ứng dụng thực tế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của chúng, cụ thể là ảnh hưởng của các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ muối tới sinh trưởng cũng như các chất cho và nhận điện tử có thể phục vụ sinh trưởng.
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ muối trong môi trƣờng
Độ mặn là một trong các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý của vi khuẩn trong tự nhiên, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng và tốc độ khử sulfate thành sulfide đối với các chủng SRB phân lập được (hình 3.7).
Nồng độ sulfide OD600
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường tới mức tăng sinh và hoạt tính khử sulfate của các chủng SRB mới phân lập.
Kết quả cho thấy chủng SR2 tăng sinh tốt ở các nồng độ muối 15 g/l (tương đương với điều kiện nước lợ) và bị ức chế rõ rệt ở các nồng độ muối cao hơn. Hoạt tính sinh học thể hiện qua lượng sulfide tạo ra cũng tương đối thống nhất với việc tạo sinh khối, đạt mức cao nhất tại nồng độ muối 5 g/l, giảm nhẹ ở các nồng độ 10 và 15 g/l, và bị ức chế rõ rệt ở nồng độ muối > 15 g/l.
Khác với chủng SR2, chủng SR3 chỉ tăng sinh tốt ở nồng độ muối 5 và 10 g/l, mức độ tăng sinh thấp hơn đáng kể ở các nồng độ muối < 5 g/l hay > 10 g/l. Tuy nhiên về hoạt tính khử sulfate thành sulfide, chủng SR3 lại thể hiện ở mức khá cao tại tất cả các nồng độ muối nghiên cứu, cao nhất ở hai nồng độ 5 và 10 g/l. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng SR4 tăng sinh tốt và thể hiện hoạt tính khử sulfate cao ở các nồng độ muối < 5 g/l, cả hai đặc tính này đều giảm dần ở các nồng độ muối > 5 g/l.
SR2 0 1 2 3 4 5 0 1 5 10 15 20 25 Nồng độ muối (g/l) N ồn g độ s ul fi de (m M ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 O D 6 0 0 SR3 0 1 2 3 4 5 0 1 5 10 15 20 25 Nồng độ muối (g/l) N ồn g độ s ul fi de (m M ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 O D 6 0 0 SR4 0 1 2 3 4 5 0 1 5 10 15 20 25 Nồng độ muối (g/l) N ồn g độ s ul fi de (m M ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 O D 6 0 0
Như vậy, mặc dù được phân lập từ môi trường nước ngọt nhưng cả ba chủng SRB mới phân lập đều có thể sinh trưởng ở các môi trường có nồng độ muối cao hơn, đặc biệt hai chủng SR2 và SR4 còn sinh trưởng tốt ở nồng độ muối tới 15 g/l, tương đương với môi trường nước lợ. Trong khi hai chủng SR2 và SR4 không thể hiện yêu cầu bắt buộc có muối trong môi trường sinh trưởng thì chủng SR3 lại có yêu cầu này.
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH trong môi trƣờng
pH là yếu tố rất quan trọng không chỉ ảnh hưởng tới sinh lý của SRB mà còn quyết định khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý AMD có pH thấp. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (10 mM) làm chất cho điên tử, pH trong khoảng từ 4 – 8 (chỉnh bằng HCl hoặc Na2CO3), nuôi ở 30C.
Nồng độ sulfide OD600
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới mức tăng sinh và hoạt tính khử sulfate của các chủng SRB mới phân lập.
Nghiên cứu cho thấy (hình 3.8) các chủng SR2, SR4 tăng sinh tốt tại các pH 6, 7, 8, tuy nhiên SR2 chỉ có khả năng tạo sulfide cao ở pH 7 và 8, cao nhất tại pH 8; trong khi đó, tại pH 6 SR4 vẫn có khả năng tạo nhiều sulfide. Khác với 2 chủng SR2 và SR4, chủng SR3 hầu như không sinh trưởng ở pH thấp hơn 7. Chủng SR3 đạt mức sinh trưởng cao nhất và tạo sulfide nhiều nhất ở pH 8.
SR2 0 1 2 3 4 4 5 6 7 8 pH N ồn g độ s ul fi de ( m M ) 0 0.1 0.2 0.3 O D 6 0 0 SR3 0 1 2 3 4 4 5 6 7 8 pH N ồn g độ s ul fi de ( m M ) 0 0.1 0.2 0.3 O D 6 0 0 SR4 0 1 2 3 4 4 5 6 7 8 pH N ồn g độ s ul fi de ( m M ) 0 0.1 0.2 0.3 O D 6 0 0
Như vậy, trong số 3 chủng SRB mới phân lập chỉ có chủng SR4 có khả năng sinh trưởng và thể hiện hoạt tính khử sulfate ở pH 6, tuy nhiên cả 3 chủng đều bị ức chế ở pH < 6.
Nhằm mục đích lựa chọn nguồn SRB phù hợp nhất cho xử lý AMD, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hỗn hợp ba chủng SRB mới phân lập so với mẫu dịch làm giàu gốc của ba chủng này (hình 3.9).
Nồng độ sulfide OD600
Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đối với hỗn hợp chủng SRB và mẫu làm giàu gốc (E1-4)
Kết quả cho thấy hỗn hợp ba chủng SR2, SR3 và SR4 vẫn bị ức chế ở pH < 6, trong khi đó hỗn hợp làm giàu E1-4 lại có thể tăng sinh và thể hiện hoạt tính khá