DNA genome của 3 chủng SRB thuần khiết được tách theo phương pháp của Marmur (1961), sau đó sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4).
Hình 3.4. DNA genome của ba chủng SRB phân lập được
DNA tổng số được dùng làm khuôn trong phản ứng PCR để nhân gen 16S rDNA. Với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen 16S rDNA của
E. coli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500 bp. Kết quả kiểm tra bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy các băng có kích thước khoảng 1500 bp đúng như lý thuyết. Băng DNA rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo (hình 3.5).
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng Kit được kiểm tra hàm lượng DNA và độ tinh sạch thông qua phương pháp so màu ở bước sóng 260 nm.
Marker SR2 SR3 SR4
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuyếch đại gen 16S rDNA của các chủng SRB phân lập được trên gel agarose 1%.
Trình tự gen 16S rDNA được đọc với 3 đoạn mồi 27F, 800F và 1492R (các số tương ứng với các vị trí nucleotide trên gen 16S rDNA ở E. coli). Đoạn gen 16S rDNA gần đủ của mỗi chủng sau đó được tạo ra bằng việc cắt các đoạn trùng lặp và ghép nối các trình tự có được với 3 đoạn mồi nói trên sử dụng công cụ tạo trình tự Contig trong phần mềm BioEdit. Sau đó chuỗi trình tự này được so sánh với các gen 16S rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen bằng chương trình BLAST Search, theo đó độ tương đồng của các chủng SRB phân lập được so với các chủng đã công bố như sau:
Chủng SR2 có độ tương đồng 98% so với Desulfomicrobium baculatum.
Chủng SR3 có độ tương đồng 98% so với Desulfobulbus propionicus.
Chủng SR4 có độ tương đồng 98% so với Desulfovibrio magneticus.
Vị trí phân loại của ba chủng SRB mới phân lập so với các loài SRB có liên hệ gần gũi dựa trên trình tự gần đủ của gen 16S rDNA được biểu diễn trên cây phân loại ở hình 3.6. Trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S rDNA, ba chủng SRB mới phân lập được định danh tương ứng là Desulfomicrobium sp. SR2, Desulfobulbus sp. SR3 và Desulfovibrio sp. SR4.
Marker SR2 SR3 SR4 ĐC()
Hình 3.6. Cây phân loại neibourgh joining dựa trên trình tự gen 16S rDNA gần đủ của các chủng SRB mới phân lập so sánh với các loài SRB có quan hệ gần gũi.
Escherichia coli (-Proteobacteria) được chọn làm outgroup.