2.2.1. Làm giàu và phân lập SRB
Bảng 2.1. Môi trƣờng khoáng nƣớc ngọt dành cho vi khuẩn khử sulfate
(Widdel, Bak, 1992) Thành phần Nước cất 1 lít Na2SO4 4 g NaCl 1 g MgCl2.6H2O 0,4 g CaCl2.2H2O 0,15 g KCl 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g NH4Cl 0,25 g KH2PO4 0,2 g
Khử trùng môi trường ở 121oC, lấy ra ở 80oC, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội, sau đó bổ sung các chất sau (đã khử trùng riêng) (ml/lít môi trường):
Hỗn hợp vitamin (bảng 2.2) 1 ml
Hỗn hợp vi lượng (bảng 2.2) 1 ml
Vitamin B1 (Thiamin) 1 ml
Vitamin B12 1 ml
NaHCO3 1 M 30 ml
Chỉnh pH ở 7 – 7,2, sau đó san môi trường sang các bình serum hoặc ống nghiệm rồi sục khí N2 trong 30 giây, đậy bình và ống nghiệm bằng nút cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở, sử dụng ngay hoặc bảo quản trong tối.
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp vi lƣợng và vitamin (Widdel, Bak, 1992)
Hỗn hợp vi lƣợng Hỗn hợp Vitamin (trong đệm phosphate)
Thành phần mg/Lít Thành phần mg/100 ml đệm
HCl 25% (7,7 M) 13 ml Na2HPO4/NaH2PO4 25 mM pH 7,1: 100 ml
FeSO4.7H2O 200 4-Aminobenzoic acid 4
H3BO3 30 D(+)- Biotin (Vitamine H) 1
MnCl2.4H2O 100 Nicotinic acid (Niacin) 10
CoCl2.6H2O 190 Calcium-D(+)- Pantothenat 5
NiCl2.6H2O 24 Pyridoxin 2 HCl 15
CuCl2.2H2O 2 Lipoic acid 1,5
ZnSO4.7H2O 144 Folic acid 4
Na2MoO4.2H2O 36 Na-2- Mercaptoethan sulfonat 25
Thêm nước cất đến 1000 ml
Làm giàu SRB. SRB trong mẫu nước thải thu thập về được làm giàu bằng cách cấy vào bình serum chứa môi trường dịch thể kỵ khí nước ngọt cho vi khuẩn khử sulfate (bảng 2.1) với tỷ lệ 10%, nuôi trong tủ ấm 30oC. Các lần cấy truyền tiếp theo được tiến hành sau mỗi 5 – 7 ngày nuôi cấy theo tỷ lệ 10% thể tích. Qua mỗi lần cấy truyền, số lượng SRB trong mẫu được tăng lên.
Phân lập SRB. Mẫu làm giàu lần 4 được dùng để phân lập SRB. Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với
môi trường có thành phần tương tự môi trường dùng trong làm giàu (Widdel, Bak, 1992). Ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ mẫu làm giàu được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược tại 30oC trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể.
2.2.2 Xác định điều kiện sinh trƣởng tối ƣu
Nhiệt độ. Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ khí có pH = 7, ở các nhiệt độ: 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 37oC. Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày).
pH. Các chủng SRB thuần khiết và hỗn hợp chủng SRB được nuôi cấy trong môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trường dịch thể kỵ khí có pH khác nhau: pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 trong tủ ấm
30oC. Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và
sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày).
Độ muối.Các chủng SRB thuần khiết được nuôi trong môi trường dịch thể kỵ khí ở pH 7, có độ muối khác nhau là 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25 g/l. Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo thời gian (được xác định 1 lần/ngày trong 5 ngày).
Chất cho điện tử.Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ khí có bổ sung các chất cho điện tử khác nhau như lactate, acetate, methanol (10 mM mỗi loại) và sulfate (28 mM) là chất nhận điện tử duy nhất. Sinh trưởng của SRB được đánh giá sau 5 ngày nuôi cấy thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600).
Chất nhận điện tử. Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ khí có bổ sung lactate (10 mM) là chất cho điện tử và một trong các chất nhận điện tử khác như Fe(III)-citrate (20 mM), Na-nitrate (5 mM). Dịch nuôi với sulfate (28 mM) là đối chứng dương. Sinh trưởng của SRB được đánh giá sau 5
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trƣờng và chủng thuần khiết
DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996) mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm: 100
mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM đệm phosphate (Na2HPO4-
/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Các bước tiến hành như sau:
Trộn 2 ml mẫu môi trường với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol 15 ml.
Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần.
Bổ sung 40 µl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút
trong 30 phút ở 37o
C.
Thêm 600 µl SDS (20%), ủ ở 65o
C trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. Bổ sung với lượng tương đương PCI về thể tích, sau đó trộn đều. Ly tâm
6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, lặp lại bước trên 1 lần.
Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng.
Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan DNA trong 50 µl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở 20oC.
DNA genome của chủng thuần khiết được tinh sạch theo phương pháp của Marmur (1961), gồm các bước như sau:
1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 – 10 000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó
Thêm 50 µl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ.
Thêm 50 µl SDS (20%) và 50 µl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ.
Thêm 400 µl PCI, trộn đều trong 1- 3 phútt, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC
trong 15 phút. Lặp lại bước vừa rồi thêm 1 lần.
Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đó để lạnh -20o
C), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ.
Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA.
Rửa DNA trong ethanol 70% (đó để lạnh 20oC) trong 1 phút, ly tâm 13 000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan DNA trong 50 µl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại 20C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100 V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).
2.2.4. Phƣơng pháp điện di biến tính DGGE
Hình 2.1. Vị trí đoạn gen 16S rDNA được sử dụng trong phân tích DGGE ở
Lactobacillus plantarum (Lopez và cs, 2003).
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp). Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (hình 2.1) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCTACGGGAGGCAGCAG) và 907R (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT) (Muyzer và cs, 1993). Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên
gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp
(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGCCGGGGCGGGGGCACGGGGGG) được gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F. “Touch-down” PCR (bảng 2.5) được sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE.
Thành phần phản ứng Thể tích
(µl) Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR
H2O MQ 27 Taq polymerase được đưa vào phản
ứng sau bước biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi được đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút.
10x Taq buffer 5 BSA (3 mg/ml) 5 MgCl2 (20 mM) 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 Mồi GM5F-GC (50 pmol/µl) 1 Mồi 907R (50 pmol/µl) 1 DNA khuôn 2
Taq polymerase (5 u/µl) 1
Tổng thể tích phản ứng 50
DGGE. Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).
Cắt băng và thôi gel. Băng điện di được cắt, rửa và thôi trong nước qua đêm tại 4C. Dịch thôi DNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 2.5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng kít (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự.
2.2.5. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gen 16S rDNA (1500 bp) của các chủng SRB thuần khiết được khuếch đại trong
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) và 1492R (GGTTACCTTGTTACGACT T) ( Weisburg và cs, 1991) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Phản ứng PCR khuyếch đại gen 16S rDNA.
Thành phần phản ứng Thể tích
(µl)
Nhiệt độ
(oC) Thời gian Số chu
kỳ H2O MQ 13,5 94 3 phút 10x buffer 2,5 94 30 giây 35 BSA (3 mg/ml) 2,5 55 45 giây MgCl2 (20 mM) 2 72 1,5 phút dNTP (2,5 mM) 2 72 7 phút Mồi 27F (50 pmol/µl) 0,5 Mồi 1492R (50 pmol/µl) 0,5
Taq polymerase (5u/µl) 0,5
DNA Khuôn 1
Tổng thể tích phản ứng 25
Gen 16S rDNA của các chủng thuần khiết (1500 bp) và sản phẩm PCR từ
các băng điện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít tinh sạch sản phẩm PCR (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems. Trình tự gen sau đó được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. Cây phân loại được
dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).
2.2.6. Phân tích hóa học
2.2.6.1. Định lƣợng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983)
Nguyên lý: O-phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 9, đo được ở bước sóng 510 nm. Nồng độ Fe(II) cho phép đo là 0,01 5 mg/l. Kết quả của phép đo có thể bị ảnh hưởng bởi ion Mn và Cu.
Chuẩn bị:
Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ được rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng
Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4 (thể tích).
Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):
CH3COONH4 40 g
CH3COOH 50 ml
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch hydroxyl ammonium chloride 1,4 M (khử Fe3+ thành Fe2+) NH2OH. HCl 10 g
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch phenanthrolin 21 mM (Tạo phức):
C12H9ClN2.H2O 0,5 g
Nước cất đủ 100 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)
Dung dịch chuẩn:
FeSO4.7H2O 2,78 mg
HCl 25% 6,25 ml
Nước cất đủ 100 ml
Tiến hành:
Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate và 2 ml dung dịch
hydroxyl ammonium chloride, trộn đều bằng vortex, hỗn hợp phải có pH nằm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5).
Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.
Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Đo OD tại bước sóng 510 nm.
Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(II) từ 5 - 50 µM.
2.2.6.2. Định lƣợng sulfate(Dinh và cs, 2004)
Nguyên lý: SO42- kết hợp với Ba2+ tạo kết tủa BaSO4 theo phương trình: Ba2+ + SO42- → BaSO4 kết tủa trắng. Hàm lượng sulfate được xác định thông qua hàm lượng chất kết tủa BaSO4 tạo thành.
Chuẩn bị
Dung dịch BaCl2 0,2 M trong HCl 0,2 M
Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
Màng lọc nitrocellulose 0,2 µm Bộ dụng cụ hút chân không
Tiến hành
Sấy màng lọc ở 105oC trong 2 h, sau đó cân xác định trọng lượng. Hút 1 ml dung dịch BaCl2 0,2 M / HCl 0,2 M vào ống nghiệm thủy tinh.
Bổ sung 1 ml mẫu (đã ly tâm) vào ống nghiệm trên, trộn đều (vortex), giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Lọc tủa qua màng nitrocellulose nhờ bộ dụng cụ hút chân không. Lấy màng lọc ra và sấy ở 105oC trong 2 h, sau đó cân lại màng lọc.
Tính toán lượng chất kết tủa tạo thành, suy ra hàm lượng sulfate trong mẫu theo công thức:
Y: Khối lượng màng sau lọc (gam); X: Khối lượng màng trước lọc (gam)
2.2.6.3. Xác định nồng độ sulfide(Cord-Ruwisch, 1985)
Nguyên lý: Ion S2 phản ứng với ion Cu2+ tạo CuS có màu nâu đen dạng huyền phù, đo được nhanh ở bước sóng 480 nm.
Chuẩn bị:
Dung dịch CuSO45 mM trong HCl 50 mM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
Tiến hành:
Hút 4 ml dung dịch CuSO4 5 mM / HCl 50 mM vào ống nghiệm
Thêm 100 µl mẫu vào ống nghiệm, đảo đều.
Đo nhanh ở bước sóng 480 nm.
Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ S2
từ 0 – 20 mM
2.2.7 Thiết kế mô hình xử lý AMD
Nguồn AMD: Nguồn AMD được thu thập từ mỏ than Tràng Khê ở Quảng Ninh có các
đặc điểm lý hóa như sau: pH = 4
Nồng độ sắt = 200 mg/l (tương đương 3,57 mM) Nồng độ sulfate = 1320 mg/l (tương đương 13,75 mM)
Giá thể: Phoi bào được lót dưới lớp đáy của bể xử lý
Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàuSRB sau lần cấy truyền thứ 4 (E1-4)
Chu trình xử lý: AMD từ bể điều hòa (1) được chảy vào bể xử lý (2) có chứa cơ chất, giá thể cho vi sinh vật và nguồn SRB. pH và nồng độ sulfate được xác định 1 lần/ ngày. Khi pH tăng lên và nồng độ sulfate giảm đến mức đạt yêu cầu, phần AMD đã được xử lý sẽ được chuyển sang bể chứa 3 theo nguyên lý chảy tràn (hình 2.1).
Hình 2.2. Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm. 1) Bể điều hòa chứa AMD đầu vào; 2) Bể xử lý AMD bằng SRB; 3) Bể lắng chứa nước thải đầu ra.
Mô hình xử lý AMD được hoạt động với nguồn cơ chất cho SRB sinh trưởng được bổ sung từ bên ngoài là methanol hoặc nước thải có hàm lượng hữu cơ cao.
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ các mẫu nƣớc thải
Nguồn nước thải sử dụng để làm giàu SRB gồm có nước trong hồ sinh học xử lý nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương (E1), nước thải trong bể biogas (E2) và nước thải sau biogas (E3) của nhà máy rượu Hà Nội tại Yên Phong,
Bắc Ninh. Các mẫu được lấy từ lớp bùn đáy và nước ở độ sâu 10 20 cm trên bề
mặt đáy, giữ trong bình Duran đóng kín và đưa về phòng thí nghiệm.
Vi khuẩn khử sulfate (SRB) được làm giàu từ các mẫu nước thải đã thu thập ở trên trong môi trường khoáng dịch thể chứa sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử duy nhất và Na-Lactate (10 mM) là chất cho điện tử. pH môi trường trong thí nghiệm làm giàu là 6,5 – 6,8, nhiệt độ nuôi cấy là 30C. Sự sinh trưởng của SRB trong các mẫu làm giàu được nhận biết sau 5 – 7 ngày nuôi cấy thông qua sản phẩm
trao đổi chất sulfide trong phản ứng tạo kết tủa CuS màu nâu với dung dịch CuCl2
(xem chương 2). Cấy truyền dịch làm giàu được thực hiện sau mỗi 5 – 7 ngày khi dịch nuôi có mật độ tế bào cao và tạo nhiều sulfide.
0 2 4 6 8 10 12
E1-4 E2-4 E3-4
N ồn g độ s ul fi de ( m M )
Hình 3.1. Hàm lượng sulfide của các mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ 4. E1-4: Mẫu làm giàu với nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương sau 4 lần (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});