Đồ án công nghệ thực phẩm Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành công nghệ thực phẩm

Ban đầu, quá trình sinh tổng hợp cellulose ngoại bào bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum được quan sát và nghiên cứu để làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp cellulose, tuy nhiên sau này ngườ

MỤC LỤC

Danh mục các bảng 4

Danh mục các hình 5

Lời mở đầu 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE VI KHUẨN (BACTERIAL CELLULOSE – BC) 8

1.1 CELLULOSE VI KHUẨN 8

1.1.1 Nguồn gốc 8

1.1.2 Định nghĩa 8

1.1.3 Cấu trúc 8

1.1.4 Phân loại 11

1.1.4.1 BC I 11

1.1.4.2 BC II 12

1.1.5 Đặc điểm 13

1.1.5.1 Tính tinh khiết 13

1.1.5.2 Tính giữ nước 14

1.1.5.3 Tính bền cơ học 14

1.1.5.4 Một số tính chất nổi bật khác 14

1.1.6 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum 15

1.1.7 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum 16

1.1.8 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 18

1.1.8.1 Giai đoạn polymer hóa 18

1.1.8.2 Giai đoạn kết tinh 20

1.1.9 Di truyền học và điều hòa của enzyme tổng hợp BC 21

1.1.10.Những sản phẩm khác của quá trình lên men bởi Acetobacter xylinum 21

1.2 SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN 22

1.2.1.2 Phân loại A xylinum 24

1.2.1.3 Đặc điểm hình thái của loài Acetobacter xylinum 25

1.2.1.4 Đặc điểm sinh lý của A Xylinum 27

1.2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 27

1.2.1.6 Những đột biến trên Acetobacter xylinum 28

1.2.2 Môi trường 28

1.2.2.1 Môi trường nước dừa 28

1.2.2.2 Môi trường rỉ đường 29

1.2.2.3 Môi trường nhân giống và lên men 31

1.2.3 Quy trình công nghệ sản xuất BC 32

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng 33

1.2.4.1 Thành phần môi trường 33

1.2.4.2 Điều kiện lên men 39

1.2.4.3 Phương pháp lên men 41

1.2.5 Phương pháp thực hiện 43

1.2.5.1 Nuôi cấy tĩnh 43

1.2.5.2 Nuôi cấy có khuấy đảo 44

1.2.5.3 Một số phương pháp sản xuất khác 45

CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG CỦA BC TRONG NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 49

2.1 DẠNG SẢN PHẨM THỰC PHẨM 49

2.1.1 Nata De Coco 49

2.1.2 Kombucha 50

2.2 DẠNG PHỤ GIA THỰC PHẨM 51

2.2.1 Phụ gia ổn định cấu trúc trong surimi 51

2.2.2 Phụ gia ổn định cấu trúc trong thức uống chocolate 51

2.3 DẠNG CHẤT MANG DÙNG ĐỂ CỐ ĐỊNH VI SINH VẬT HOẶC ENZYME 51 2.3.1 Dạng chất mang dùng để cố định enzyme – Ứng dụng của BC

trong cố định enzyme glucoamylase 52

2.3.2 Dạng chất mang dùng để cố định vi sinh vật 57

2.3.2.1 Thuận lợi và khó khăn của tế bào cố định trên BC so với tế

bào tự do 57

2.3.2.2 Cố định Lactococcus lactis trên chất mang BC để thu nhận và

cố định bacteriocin 58

2.3.2.3 Cố định vi khuẩn Acetobacter xylinum trên BC để ứng dụng

sinh tổng hợp ra chính BC 59

2.3.2.4 Cố định tế bào vi khuẩn trên BC để loại acid trong rượu vang

bằng quá trình lên men malolactic 60

2.3.2.5 Cố định nấm men trên chất mang BC ở quá trình lên men

chính trong sản xuất rượu vang nho 62 Tài liệu tham khảo 67

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Đặc tính cơ học của BC và một số vật liệu hữu cơ khác 14

Bảng 2 Một số giống vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose 23

Bảng 3 Đặc điểm sinh lý của A Xylinum 26

Bảng 4 Thành phần nước dừa già 29

Bảng 5 Hàm lượng vitamin có trong nước dừa 29

Bảng 6 Thành phần rỉ đường ở nước ta 30

Bảng 7 Hàm lượng vitamin có trong mật rỉ đường 31

Bảng 8 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của

A xylinum IFO 13693 35

Bảng 9 Đặc điểm vật lý của sản phẩm BC sinh ra từ 2 điều kiện

pH 4 và 5 38

Bảng 10 Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 42

Bảng 11 Tính chất St-BC và Ag-BC 42

Bảng 12 Hoạt tính tương đối của enzyme glucoamylase cố định bằng các phương pháp hoạt hóa khác nhau 53

Bảng 13 Aûnh hưởng của kích thước hạt BC đến hoạt tính tương đối của enzyme glucoamylase cố định 54

Bảng 14 Aûnh hưởng của hàm lượng nước trong hạt BC đến hoạt tính tương đối của enzyme glucoamylase cố định 54

Bảng 15 So sánh các chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc BC 9

Hình 2 Liên kết hydro được hình thành giữa các đơn phân trong chuỗi BC 9

Hình 3 Liên kết hydro hình thành giữa các chuỗi BC 9

Hình 4 So sánh cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật 10

Hình 5 Mô hình cấu trúc cellulose I .11

Hình 6 Phổ hấp thu 13C-NMR của hai loại cellulose Iα và Iβ 11

Hình 7 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt 12

Hình 8 Mô hình cấu trúc cellulose II 12

Hình 9 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu 13

Hình 10 Găng tay bằng BC 15

Hình 11 Cellulose được hình thành trong lên men tĩnh 16

Hình 12 Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum 17

Hình 13 Con đường hình thành cellulose ở A.xylinum 17

Hình 14 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 19

Hình 15 Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum 20

Hình 16 Polysaccharide Acetan 22

Hình 17 Acetobacter xylinum 24

Hình 18 Vi khuẩn Acetobacter Xylinum 25

Hình 19 SEM của A Xylinum 25

Hình 20 Khuẩn lạc của A bacterxylinum trên môi trường agar 26

Hình 21 Sơ đồ quy trình lên men sản xuất BC 32

Hình 22 Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 41

Hình 23 BC tạo ra trong điều kiện lên men tĩnh 43

Hình 24 Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 45

Hình 25 Quá trình Ajinomoto 46

Hình 29 Aûnh hưởng của thời gian cố định đến hoạt tính tương đối của enzyme

glucoamylase cố định 55Hình 30 Aûnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme glucoamylase cố định

và tự do 56Hình 31 Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme glucoamylase cố

định và tự do 56Hình 32 Aûnh hưởng của việc tái sử dụng đến hoạt tính của enzyme

glucoamylase cố định 57Hình 33 Hoạt tính bacteriocin của các lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định

trên BC để lên men 59Hình 34 Sản lượng BC theo chu kì tái sử dụng trong chế phẩm cố định so với

đối chứng (DC) 60Hình 35 Quy trình cố định nấm men trên BC trong dịch nho theo phương pháp

hấp phụ 63Hình 36 Quy trình cố định nấm men trên chất mang BC bằng phương pháp hấp

phụ- ủ 64Hình 37 Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau khi cố định bằng

phương pháp hấp phụ (không ủ) 65Hình 38 Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau khi cố định bằng

phương pháp hấp phụ- ủ, thời gian ủ 2 ngày 65Hình 39 Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau quá trình lên men sử

dụng chất mang cố định bằng phương pháp hấp phụ- ủ, thời gian ủ 2ngày 66

LỜI MỞ ĐẦU

Cellulose là vật liệu sinh học rộng rãi nhất trên trái đất, có nhiều ứng dụngquan trọng và có mặt khắp nơi phục vụ cho nhu cầu của con người hàng ngàn nămqua Cellulose được tổng hợp bởi rất nhiều sinh vật Nó hình thành cấu trúc cơ bảncủa vách tế bào hầu hết thực vật, nhiều loài nấm và một số loài tảo Tuy nhiên,

các chủng vi khuẩn bao gồm Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Sarcina và Acetobacter [21] cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulose nhằm mục đích tạo

màng bảo vệ tế bào

Khác với bông vải và giấy, khi tinh chế sẽ làm giảm chiều dài của các chuỗicellulose, cellulose vi khuẩn không đòi hỏi quá trình xử lý để loại bỏ các polymerkhông mong muốn và các tạp chất khác nên do đó giữ lại độ trùng hợp lớn hơn

(Nishi và cộng sự 1990) Ở trạng thái tự nhiên, cellulose vi khuẩn có khả năng giữ

nước khá tốt, có khả năng giữ được hơn 100 lần trọng lượng của nó khi ở trong môitrường nước Thêm vào đó, cellulose vi khuẩn còn có độ bền cơ học cao và có thể

bị phân huỷ bởi một số nhóm vi sinh vật

Ban đầu, quá trình sinh tổng hợp cellulose ngoại bào bởi vi khuẩn

Acetobacter xylinum được quan sát và nghiên cứu để làm sáng tỏ con đường sinh

tổng hợp cellulose, tuy nhiên sau này người ta chủ yếu tập trung vào nghiên cứunhững ứng dụng của cellulose vi khuẩn vào trong những lĩnh vực cụ thể như: thựcphẩm, y học, sinh học, môi trường, … [87] Trong đó, cellulose vi khuẩn có rất nhiềuứng dụng quan trọng trong ngành công nghệ thực phẩm, bao gồm: dạng sản phẩmthực phẩm (thạch dừa, kombucha, …), chất phụ gia và dạng chất mang cố định cácenzyme và vi sinh vật

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE VI KHUẨN

này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum

[20]

Đến nửa thế kỷ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều vềcellulose vi khuẩn Đầu tiên, Hestrin và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng tổnghợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này cóthể sử dụng đường để tổng hợp cellulose [32]

1.1.2 Định nghĩa:

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, nó tạo thành cấutrúc cơ bản của vách tế bào hầu hết các loài thực vật, nấm và một số loài tảo.Cellulose vi khuẩn được định nghĩa là cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn [6, 35,36]

Ngày nay, cấu trúc của BC đã được xác định nhờ vào các kĩ thuật về côngnghệ hiện đại, như kĩ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định kích thước và phân biệtcấu trúc BC Các kĩ thuật khác như phổ Raman, phân tích phổ hồng ngoại, phổcộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose [6, 31, 50]

1.1.3 Cấu trúc:

BC là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua các nối 1,4-glucan Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van derWaals Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo nêncấu trúc tiền sợi có chiều rộng 1,5nm Những tiền sợi này kết tinh lại tạo thành sợi.Các sợi kết hợp với nhau tạo thành bó Các bó sau đó kết hợp với nhau tạo thànhdải Theo Zaar (1977) các dải này có bề dày từ 3 đến 4 nm, bề rộng từ 70 đến

β-80 nm Theo Brown và cộng sự (1976) các dải này có kích thước là 3,2 x 133 nm,còn theo Yamanaka và cộng sự (2000) là 4,1 x 177 nm, trong khi chiều rộng của sợi

cây thông thì lớn hơn theo thứ tự lần lượt là 1,4 - 4,0 x 10-2 và 3,0 -7,5 x10-2 mm

Nhiều dải cellulose có chiều dài từ 1 đến 9 nm tạo thành mạng lưới dày đặcvà ổn định nhờ những nối hydro bao quanh [6, 7, 31, 50, 86, 77, 29]

Hình 1 Cấu trúc BC [31]

Hình 2 Liên kết hydro được hình thành giữa các đơn phân trong chuỗi BC

(Bielecki và cộng sự)

Hình 3 Liên kết hydro hình thành giữa các chuỗi BC (Bielecki và cộng sự)

Những dãi siêu nhỏ của BC có chiều dài nằm trong khoảng 1-9 μm có chứa

từ 2000 đến 18 000 đơn phân glucose (Ross và cộng sự., 1991) hình thành nên một

mạng lưới cấu trúc dày đặc được giữ ổn định bằng những liên kết hydro BC đượcphân biệt với PC (Plant cellulose – cellulose thực vật) nhờ vào chỉ số kết tinh cao(trên 60%) và sự khác nhau của độ trùng hợp (DP), thông thường DP của BC nằmgiữa khoảng 2 000 và 6 000 (Jonas và Farah, 1998), nhưng trong vài trường hợp đạt

đến 16 000 hoặc thậm chí 20 000 (Watanabe và cộng sự ,1998 b) trong khi DP

trung bình của polymer ở PC chỉ nằm trong khoảng13 000 đến 14 000 (Teeri,1997).Ngoài ra, đường kính của BC chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thựcvật [7, 31]

1.1.4.1.BC I:

Hình 5 Mô hình cấu trúc cellulose I [29]

BC I là dạng chuyển hóa nhiệt động lực học của cellulose Tùy thuộc điềukiện, môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà BC có dạng các chuỗi glucan xếpsong song nhau theo 2 dạng là Iα và Iβ Trong vi sợi cellulose đều có sự tham giacủa hai loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993) Trong khi hầu hếttinh thể Iβ tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thunhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này Cấu trúc của cellulose được tổng

hợp từ vi khuẩn A xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng

loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60% Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto &Horii, 1994) Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nênthành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai Ở đó, cellulose Iαchỉ chiếm khoảng 20% Hai dạng thù hình này có thể được phân biệt dựa vào phổ

13C-NMR

Trong môi trường nuôi cấy tĩnh thường xuất hiện dạng BC I này [63], chúngcó đường kính từ 0,05-0,1 m Dù vẫn thường được sử dụng song phương phápnuôi cấy tĩnh thường cho sản lượng thấp và mang tính thủ công BC tạo ra từ nuôicấy tĩnh thường có dạng màng dày trên bề mặt môi trường BC tổng hợp theophương pháp nuôi cấy bề mặt thường có ưu thế ở việc dễ tạo màng và có độ chịulực cao [6, 7, 31, 36, 50].

Hình 7 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt

1.1.4.2.BC II:

Hình 8 Mô hình cấu trúc cellulose II [29]

BC II là dạng sợi cellulose ổn định về nhiệt động lực học Các chuỗi glucansắp xếp đối song song với nhau và thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấybề sâu Các sợi cellulose này thường có dạng uốn cong, đường kính 0,1-0,2  m.Sợi cellulose vừa tổng hợp ra thường phân bố khắp môi trường nuôi cấy hoặcchúng kết hợp lại với nhau tạo thành các dạng hạt nhỏ hay các hạt hình sao BCtổng hợp theo phương pháp nuôi cấy bề sâu tuy có độ chịu lực không cao bằngphương pháp nuôi cấy bề mặt nhưng có ưu thế là độ trương nở và ngậm nước cao[6, 7, 31, 50].

Hình 9 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu.

1.1.5 Đặc điểm:

1.1.5.1 Tính tinh khiết:

 Bacterial cellulose là loại cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp màkhông chứa lignin hay hemicellulose, thành phần môi trường có thể được loại bỏ đểthu được BC với độ tinh sạch cao Cellulose thu nhận từ thực vật phải trải quanhiều giai đoạn nghiền nhão xử lý đến sự loại bỏ lignin và những hỗn hợp khác.Bước loại lignin này thì đặc biệt tốn kém và gây ô nhiễm môi trường Trong khi đó,cellulose vi khuẩn thuần khiết và không phải có những bước xử lý phức tạp Bởi vìnhững bước xử lý cellulose vi khuẩn yêu cầu ít hơn, tiêu tốn ít tiền hơn và ít tạo racác sản phẩm không mong muốn Nhưng một ưu điểm lớn hơn là những sợicellulose còn lại sau xử lý không sứt mẻ vì xử lý đơn giản hơn, và như vậycellulose bền hơn và vẫn giữ lại những đặc tính quan trọng [18]

 Ngoài ra, cellulose vi khuẩn còn có thể bị phân huỷ bởi một số nhóm vi

1.1.5.2 Tính giữ nước:

 Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 tới

700 lần trọng lượng của nó, trong khi gỗ hoặc bông về mặt vật lý phải được nghiềnnhỏ ra để làm cho chúng có khả năng giữ được nước [17], quá trình này ảnh hưởngđến độ bền của cellulose Một khi BC được hình thành trong một mạng lưới hútnước và không cần xử lý, nó sẽ giữ những sợi nhỏ dài và độ bền cao của nó Ngoài

ra có thể điều chỉnh độ xốp cũng như có khả năng chứa dung tích bề mặt cao [31,77]

 Khi thêm những cơ chất nhất định hoặc thêm một số chất phụ trong quátrình tổng hợp BC có thể thay đổi những thuộc tính của BC Ví dụ, sự thêmCarboxymethyl cellulose (CMC) trong thời gian sự hình thành BC làm tăng thêmkhả năng giữ nước tới 1000 lần so với trọng lượng khô của nó [56]

1.1.5.3 Tính bền cơ học [31, 77].

Cellulose I có độ bền cơ học cao, sức căng lớn, trọng lượng nhẹ, kích thướcổn định Giá trị Young’s modulus của BC khoảng 30GPa, xấp xỉ 4 lần so với sợịhữu cơ khác

Bảng 1 Đặc tính cơ học của BC và một số vật liệu hữu cơ khác

Loại vật liệu Young’s modulus

(GPa) Sức căng(MPa) Độ giãn(%)

1.1.5.4 Một số tính chất nổi bật khác:

 Màng BC được tổng hợp một cách trực tiếp vì vậy không cần qua các bứơctrung gian trong quá trình sản xuất các sản phẩm ứng dụng BC ( sản xuất giấy từbột giấy, quá trình dệt không cần se chỉ…) Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp đượccác loại màng siêu mỏng và các sợi siêu nhỏ [6]

 Trong quá trình tổng hợp cellulose người ta có thể tác động lên gen liênquan, từ đó kiểm soát các dạng kết tinh và trong lượng phân tử cellulose [13, 77]

 Cellulose vi khuẩn có thể được tổng hợp với hình dạng và kích thước mongmuốn trong các thiết bị lên men thích hợp[19] Một vài nghiên cứu đã cho thấy khảnăng hình thành BC bên trong một khuôn làm sẳn Từ những miếng BC hình thành

thành một găng tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng một khối đất xốpmà không khí ngấm qua được chìm xuống nước bên trong môi trường nuôi cấy A.xylinum Những tế bào tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose [81].

Hình 10 Găng tay bằng BC (U.K Patent 12,169,543)

1.1.6 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum:

Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát

triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên, điển hình là các vai trò sau:

 Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn(Bielecki et al., 2001)

 Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum giúp tế bào lơ lửng và tớiđược bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí Do đó chỉ những tế bào gầnranh giới hai pha lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose [44, 79,33]

 Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A xylinum trên cơchất và bảo vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất [82]

 Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịuvới những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gâybệnh…) trong môi trường sống tăng lên

 Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV Khoảng 23% vikhuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bịchiếu tia UV [15,82]

Tuy nhiên, cellulose vi khuẩn cũng gây một bất lợi nhỏ cho vi khuẩn vìmàng cellulose được hình thành ở bề mặt phân cách của dịch môi trường lỏng [16].Khi màng cellulose được hình thành và được đẩy xuống phía dưới môi trường,cellulose mới kết tinh sẽ nằm phía trên bề mặt của môi trường Vì lý do này nênlượng oxy ở phía trên rất hạn chế và chất dinh dưỡng khó khuếch tán lên phía trên

do màng càng lúc càng dày [84]

1.1.7 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum :

 Để khẳng định tuyên bố rằng chỉ những tế bào gần bề mặt của môi trườngmới phát triển [16], Borzani và Souza (1995) đặt một sợi tóc lên trên bề mặt củamột màng cellulose đang được tổng hợp và theo dõi vị trí của sợi tóc khi màngcellulose tiếp tục được tổng hợp Những kết quả cho thấy rằng rõ ràng khoảng cáchgiữa sợi tóc và đáy của màng mỏng không thay đổi, và cellulose được tổng hợpthêm và vượt qua phía trên của sợi tóc Điều này chứng minh rằng cellulose đượchình thành từ phần phía trên của màng cellulose, và vi khuẩn ở phần đáy của màngthì không hoạt động [16,68]

 Ishikawa và cộng sự (1995) khảo sát mối quan hệ giữa sự tăng trưởng vàquá trình tạo thành cellulose bên trong môi trường nuôi cấy lắc Một thí nghiệmcho thấy rằng khả năng tạo thành cellulose tăng khi mật độ tế bào ngày càng tăng,điều này dẫn đến kết luậân là sự tổng hợp cellulose có liên quan đến sự phát triển.Sau đóù họ cố gắng thúc đẩy sự tăng trưởng và như vậy tăng thêm số lượng của BCsản sinh ra

Hình 11 Cellulose được hình thành trong lên men tĩnh

 Người ta cho rằng quá trình hình thành cellulose không bị chi phối bởi thờigian của quá trình lên men nên những phân tử cellulose được tổng hợp có cùngnhững thuộc tính như nhau Ngược lại, độ trùng hợp trong BC gia tăng tỉ lệ thuậnvới thời gian, và đã có những báo cáo về sự khác nhau về thuộc tính phân tử của

PC và BC (Marx-Figini, 1982) Người ta kết luận rằng quá trình sinh tổng hợp BCchỉ xảy ra khi vi khuẩn tăng mật độ quần thể

 Ross (1991) cho rằng các con đường biến dưỡng trong quá trình tạo thànhcellulose sử dụng chu trình pentose, chu trình pyruvic và chu trình citrate Cũng

cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose.

 UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong

A xylinum Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là

một quá trình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme Những bước này làsự phosphoryl hoá của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase (EC 2.7.1.2)thành glucose-6-phosphate, sự đồng phân hoáù của glucose-6-phosphate thànhglucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2), và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9) [62] UDP-Glucosepyrophosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi

khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột biến không có khả năng tổng

hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981)

Hình 12 Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon & Anderson,

1991)

Hình 13 Con đường hình thành cellulose ở A.xylinum

 Công thức tổng quát cho sự tổng hợp cellulose được biểu diễn như sau: UDP-Glc + (β-1,4-glucose)n → UDP + (β-1,4-glucose)n+1 [62]

1.1.8 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành hai giai

đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh

1.1.8.1. Giai đoạn polymer hóa:

 Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóachuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Sau đó enzymephosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thànhglucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng đồng phân hóa Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-Glucose Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và celluloseđược tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose

synthase (Iguchi et al., 2000).

 Qua nghiên cứu các dạng vi khuẩn không có khả năng tổng hợp cellulosecho thấy enzyme chủ yếu trong quá trình tổng hợp BC là UDP-Glcpyrophosphorylase Hoạt tính của enzyme này thay đổi giữa các chủng Acetobacterxylinum Ơû Acetobacter xylinum spp sucrofermentans BPR2001, enzyme này cóhoạt tính cao

 Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạocellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽchuyển fructose thành fructose–1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ đượcchuyển hóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽgiúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theoglucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để

tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).

Hình 14 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000) [15]

Các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn:

 CS : cellulose synthase (EC 2.4.2.12)

 FBP : fructose-1, 6- biphosphate phosphatase (EC 3.1.3.11)

 FK : glucokinase (EC 2.7.1.2)

 G6PDH : glucose -6-phosphate dehydrogenase EC 1.1.1.49)

 1PFK : fructose-1-phosphate kinase (EC 2.7.1.56)

 PGI : phospho glucoisomerase

 PMG : phosphogluco mutase (EC 5.3.1.9)

 PTS : hệ enzyme phosphotransferases

 UGP : pyrophosphorylase UDPGlc (EC 2.7.7.9)

 Fru-bi-P : fructose -1,6-bi-phosphate

 Fru-6-P : fructose-6-ph osphate

 Glc-6(1)-P : glucose-6(1)-phosphate

 PGA : phosphogluconic acid

 UDPGlc : uridine diphosphoglucose

1.1.8.2. Giai đoạn kết tinh:

 Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β -1,4-glucan Các chuỗiglucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van DerWaals Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kếthợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan.Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếptục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thôngqua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn Sau đó, các bó sợi hình thành các dải có cấutrúc hoàn chỉnh, nằm song song dọc theo chiều dài tế bào có chiều rộng của cácdải nằm trong khoảng 40- 60 nm [18, 21, ]

 Khi quan sát thời gian kéo dài dải cellulose, các tác giả đã phát hiện ra dảicellulose gồm có 2 lớp, mỗi lớp có khoảng 23 vi sợi, mỗi vi sợi gồm 28 chuỗiglucan Kết quả hình thành một dải sợi gồm 1288 chuỗi glucan với tốc độ kéo dàidải sợi khoảng 2,59 micron trong một giây [68]

 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ

sắp xếp thành hàng dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991) Các lỗ này chính

là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào Đây là những lỗ có đườngkính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn Mỗi lỗbao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp cellulose Mỗi tiểu phần 10 nmtạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm

Hình 15 Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum

(Iguchi et al., 2000) [35, 11]

1.1.9 Di truyền học và điều hòa của enzyme tổng hợp BC:

 Người ta sử dụng một chủng đột biến Cel- để phân lập một operon gồmbốn gen [65] được gọi tên lần lượt là AxCeSA, AxCeSB, AxCeSC và AxCeSD(Delmer 1999) Ba gen đầu đóng vai trò không thể thiếu trong quá trình hình thànhcellulose ngoại bào bởi A xylinum trong khi gen thứ tư đóng vai trò điều khiển quátrình kết tinh của cellulose

 AxCeSA mã hóa cho đơn vị xúc tác của enzyme cellulose synthase, là tiểuphần xúc tác β -glycosyltransfer của enzyme glycosyltransferases sử dụng UDP-glucose hoặc là một đường nucleotide như là một cơ chất [64]

 AxCeSB có thể là mã hóa cho tiểu đơn vị kiểm soát sự liên kết với cyclic

di GMP hoặc là sự tập trung và di chuyển cyclic di GMP (Mayer và cộng sự 1991)

 AxCeSC mã hóa cho protein hình thành nên những lỗ ở màng ngoài của vikhuẩn, gen thì hoàn toàn không cần cho sự hình thành cellulose ở thực vật[64]

 AxCeSD đóng vai trò định hướng và liên kết các chuỗi glucan trong suốtquá trình kết tinh của cellulose và khi nuôi cấy lắc thì nó sẽ đóng vai trò hình thànhcellulose II thay vì là cellulose I [64]

 Quá trình sinh tổng hợp cellulose còn liên quan đến những gen nằm ở vùngtrên và vùng dưới của operon mã hóa cho enzyme cellulose synthase, vùng trêngồm có hai gen lần lượt mã hóa cho hai enzyme được xác định có những chức năngrất quan trọng là enzyme di-guanylate cyclase xúc tác cho phẩn ứng hình thành củacyclic di GMP trong khi enzyme phosphodiesterase xúc tác cho phản ứng phân hủycyclic di GMP [62] Một gen còn lại mã hóa cho enzyme tổng hợp cellulase cònchức năng thứ hai thì không biết được Tuy nhiên khi gen này bị bất hoạt thì tế bàocũng không còn khả năng tổng hợp cellulose (Standal, 1994)

1.1.10. Những sản phẩm khác của quá trình lên men bởi

Acetobacter xylinum:

Trong suốt quá trình sản sinh cellulose, A xylinum tạo ra những chất biếndưỡng thứ cấp khác bên cạnh cellulose, đáng quan tâm nhất là acetan,heptasaccharide và acid gluconic [25]

1.1.10.1 Polysaccharide Acetan:

Ngoài cellulose, A xylinum sản sinh một polysaccharide ngoại bào trước đây

không biết rõ mà bây giờ gọi là acetan [24] Polysaccharide này bao gồm glucose,mannose, acid glucuronic, và rhamnose trong một tỷ lệ là 4 : 1 : 1 : 1

Hình 16 Polysaccharide Acetan, kích thước ảnh 1,2 μm x 1,2 μm.

1.1.10.2 Heptasaccharide:

Heptasaccharide được hình thành bởi liên kết β -1,4 giữa hai phân tử

glucose, hình thành một chuỗi lặp lại Cấu trúc và phương pháp hình thành đượccho thấy là tương tự như xanthan, một polysaccharide ngoại bào được tiết ra bởi

Xanthomonas campestris

1.1.10.3 Acid gluconic

Trong quá trình lên men pH của môi trường giảm xuống rất nhanh do sự tạothành của acid gluconic và từ đó ức chế sự tăng trưởng của giống sản xuất Acidgluconic là nguyên nhân lớn nhất dẫn đến giảm năng suất sinh tổng hợp cellulose[25]

1.2 SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN:

1.2.1 Giống:

Cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ khá nhiều loài vi khuẩn, song

Acetobacter xylinum được biết đến như là loài vi khuẩn sinh tổng hợp BC hiệu quả

nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất do những đặc điểm ưu việt của nónhư năng suất cao, cấu trúc BC phù hợp cho nhiều ứng dụng ở các lĩnh vực khácnhau [6, 13, 31, 36, 86]

Bảng 2 Một số giống vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose [38]

Giống vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môitrường hiếu khí

Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas Các sợi không tách

Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực

vật

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu

trúc

Sự kết bông trong nước thải

1.2.5.1 Sơ lược về Acetobacter xylinum:

 Năm 1886, A.J.Brown đã phát hiện rằng có khả năng sản xuất BC trên bềmặt của môi trường Từ đó, giống vi khuẩn này được nghiên cứu một cách rộng rãiđể giải thích những phản ứng sinh hoá xảy ra trong quá trình tổng hợp cellulose.Hestrin (1947) là một trong những nhóm đầu tiên đưa ra bản báo cáo chi tiết về

quá trình tổng hợp cellulose từ A.xylinum (tác nhân tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp

BC, các cơ chất và chất ức chế trong tổng hợp BC, hệ enzyme và các sản phẩmtrung gian liên quan đến sản xuất BC…).Sau đó Colvin (1957) đã phát hiện sự tổng

hợp cellulose trong các mẫu chứa dịch chiết của A.xylinum, glucose và ATP Tiếp đó là nhiều công trình nghiên cứu về tổng hợp cellulose bởi A.xylinum đi sâu về sự

biểu hiện gen,các phản ứng sinh hoá, cơ chế tổng hợp, ứng dụng BC làm vật liệu

sinh hoc…Kết quả là từ những khám phá ban đầu, A.xilynum không chỉ trở thành

công cụ nghiên cứu chính trong việc giải thích sự tổng hợp cellulose trong hệ thốngsống mà còn có tiềm năng trở thành một nguồn cellulose chính ngoài thực vật vàcotton

xylinum (Ludwig 1898) và Bacterium acidi oxalici (Banning 1902), Bacterium xylinodes (Henneberg 1906), Bacillus xylinoides (Macé 1913) Sau đó nó mới được biết đến với tên Acetobacter xylinum (Bergey và cộng sự 1925), và nó trở thành

tên chính thức theo quy định của tổ chức Danh pháp quốc tế về vi khuẩn

(International Code of Nomenclature of Bacteria) Nó còn mang tên Acetobacter xylinoides (Shimwell 1948), Acetobacter xylinum var maltovorans (Frateur 1950), Acetobacter xylinum var xylinoides (Acetobacter xylinum var xylinoides), Acetobacter bordeaux (Janke 1957), Acetobacter xylinum var africanum (Kulka và cộng sự 1958), Acetobacter aceti subsp xylinus (De Ley và Frateur 1974, Gillis và cộng sự 1983), Acetobacter xylinus subsp xylinus (Yamada 1984), Acetobacter xylinus subsp Sucrofermentans (Toyosaki và cộng sự 1996), Gluconacetobacter xylinus (Yamada và cộng sự 1998)

1.2.5.2 Phân loại A xylinum:

 Theo khoá phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc:

1.2.5.3 Đặc điểm hình thái của loài Acetobacter xylinum:[2, 6, 7]

 A.xylinum có dạng hình que, hơi cong, kích thước khoảng 2 µm, có thể

chuyển động hoặc không chuyển động, không sinh bào tử Là loại vi khuẩn gramâm, nhưng gram có thể thay đổi do tế bào già đi hoặc do điều kiện môi trường.Chúng có thể đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi

 Khuẩn lạc có kích thước nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữakhuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép nhẵn

 A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì thể chúng sinh trưởng ở bề mặt

tiếp xúc giữa môi trường lỏng và khí

 Trên môi trường dinh dưỡng rắn sau 3-7 ngày nuôi cấy, A.xylinum có dạng

nhầy, có màu kem, hơi trong, nhưng về sau thì to, đục, màu cà phê sữa, khô dần.Trên môi trường lỏng sau khi nuôi cấy 24h thì xuất hiện một lớp đục dày, sau 36đến 48 giờ hình thành một lớp trong và ngày càng dày lên

Hình 18 Vi khuẩn Acetobacter Xylinum

Hình 19 SEM của A xylinum (Forge & Preston, 1977)

Hình 20 Khuẩn lạc của A bacterxylinum trên môi trường agar.[35]

1.2.5.4 Đặc điểm sinh lý của A xylinum: [3, 38,1]

Bảng 3 Đặc điểm sinh lý của A xylinum

STT Đặc điểm sinh hóa của

A xylinum

quả

1 Oxy hóa ethanol thành

acid acetic, CO2, H2O

Acid acetic tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộnghơn và tạo lớp cặn đục rõ

+

3 Môi trường Hoyer Sinh khối không phát triển _

4 Chuyển hóa glucose

thành acid gluconic Vòng sáng xung quanh khuẩn lạc +

5 Chuyển hóa glycerol

thành dihydroxyaceton Vòng CuO xuất hiện xung quanh khuẩn lạc +

6 Kiểm tra khả năng sinh

7 Kiểm tra tổng hợp

cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam +

1.2.5.5 Đặc điểm sinh trưởng:

 Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vậnchuyển chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào Tuy nhiên lớp màng này có thể giữnước nên giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bàochống lại tia UV

 A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chẳng hạn chủng A xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993), trong khi chủng A xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)…

A xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân

làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôicấy

 Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 250C đến 300C và pH từ 5,4

đến 6,3 Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A xylinum phát triển là 5,5 và không

phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu Theo

Maccormide et al (1996) cho rằng A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ

3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể phát triển trong môi trường có nồngđộ ethanol lên tới 10%

 Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ,khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già tế bào mọc dínhthành cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống

 A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung

thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễmkhuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose

1.2.5.6 Những đột biến trên Acetobacter xylinum:

Ba phương pháp được sử dụng nhiều nhất để tạo ra các dòng đột biến là:rung lắc thật mãnh liệt, sử dụng các tác nhân hóa học gây đột biến và gây đột biếnbằng tia UV Hiện nay còn có thêm kỹ thuật di truyền

a) Đột biến khi rung lắc mãnh liệt:

Trong môi trường rung lắc mãnh liệt A xylinum chuyển sang dạng Cel- Tuynhiên, các dòng này vẫn có khả năng hình thành cellulose trở lại khi được chuyểnsang lên men ở điều kiện khay tĩnh Người ta khám phá ra rằng thông qua trangthái đột biến Cel- và khi được phục hồi khả năng tạo thành celluose thì sẽ hìnhthành nên những dòng đột biến mới [69] Khi được chuyển vào những điều kiệnthích hợp, một vài dòng có khả năng tạo thành cellulose với số lượng rất nhiều sovới dòng hoang dại

b) Độït biến sử dụng tác nhân hóa học:

Valla và Kjosbakken (1982) tìm ra rằng nếu thêm kháng sinh ngăn chặn quátrình sinh tổng hợp RNA hoặc protein vào môi trường nuôi những tế bào đột biếnCel- thì sẽ tái hoạt hoá lại sự tạo thành cellulose của chúngï Từ điều này họ kếtluận rằng những đột biến không phải trong cấu trúc của gen mà liên quan đến sựhình thành của những enzyme xúc tác cho sự tổng hợp cellulose, tuy nhiên cơ chếtự nhiên của chúng thì vẫn chưa biết được [75]

Một thử nghiệm sử dụng một môi trường có chứa NaBr và NaBrO3 theo tỉ lệ5:1 Kết quả là chủng thu được chỉ sản xuất một lượng acid gluconic rất thấp và cókhả năng tạo thành cellulose tăng gấp hai lần dòng hoang dại khi được đưa trở lạimôi trường lên men lý tưởng [64]

c) Đột biến bằng tia UV

De Wulf và cộng sự (1996) sử dụng kỹ thuật di truyền để tạo ra một chủng

A xylinum và những loài có liên quan mà có khả năng hạn chế tạo ra acid gluconic.

Giống như mọi vi sinh vật khác phát triển trong môi trường chứa đường glucosehoặc sucrose, nó chuyển đổi những đường này thành keto gluconate [64] Mặc dùtế bào sẽ sử dụng đến chúng sau này khi mà đường đã được sử dụng hết, tuy nhiênsự xuất hiện của acid gluconic sẽ dẫn đến pH lẫn tốc độ tăng trưởng giảm xuống.Sau khi gây đột biến bằng tia UV, vài khuẩn lạc sẽ được ủ, và một trong số đóđược tìm thấy có khả năng sản sinh cellulose nhanh hơn kiểu hoang dại Một ít acidgluconic được tạo thành nhưng không có acid keto gluconic nào được phát hiện ra,và pH vẫn được giữ nguyên như tại thời điểm ban đầu của quá trình lên men Kếtquả là thu được những màng BC có kích thước gấp hai lần so với kiểu hoang dại,điều này thì có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất cellulose vi khuẩn ở quy mô côngnghiệp

d) Đột biến nhờ sử dụng kĩ thuật di truyền Fujiwara và cộng sự đã thiết kế một vectơ con thoi chứa đựng những gen từ cả hai loài A xylinum và E coli ( Fujiwara và cộng sự., 1992) Vectơ cũng chứa

đựng một gen kháng ampicillin, giúp cho quá trình chọn lọc những tế bào chuyểngen được dễ dàng Những tác giả sẽ sử dụng vectơ này để tạo dòng những gen liên

quan đến sự tổng hợp cellulose bên trong A xylinum.

Bảng 4 Thành phần nước dừa già [7, 9]

0,2 %0,39 %2,61 %

24 (mg/100g)0,29 (mg/100g)

25 (mg/100g)

PhosphoKaliNatriVitamin CFolateAcid béo noAcid béo không noCác khoáng khác

20 (mg/100g)

250 (mg/100g)

105 (mg/100g)2,4 (mg/100g)3,0(mg/100g)0,176 (mg/100g)0,010 (mg/100g)Phần còn lại

Bảng 5 Hàm lượng vitamin có trong nước dừa [8]

1.2.2.2 Môi trường rỉ đường

Rỉ đường được sử dụng khá nhiều trong công nghệ vi sinh Rỉ đường là mật míahoặc mật củ cải đường không kết tinh được trong quá trình sản xuất đường Rỉđường là một hỗn hợp khá phức tạp, ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứacác hợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác Rỉ đường rất thích hợpđể sử dụng sản xuất BC ở quy mô công nghiệp nhưng cần xử lý tiệt trùng nghiêmngặt vì dễ xảy ra tạp nhiễm [9]

Bảng 6 Thành phần rỉ đường ở nước ta [9]

Thành phần Rỉ đường Vạn Điểm Rỉ đường Việt Trì

Bảng 7. Hàm lượng vitamin có trong mật rỉ đường (Andercofler)

Vitamin Hàm lượng (γ/g)g)

1.2.2.3 Môi trường nhân giống và lên men:

 Có rất nhiều tài liệu đưa ra thành phần môi trường khác nhau, tuy nhiênvẫn chứa những thành phần chính như: cao nấm men (yeast extract), (NH4)2SO4,(NH4)2HPO4, các loại đường (saccharose, glucose, fructose, …) Theo Tiến sĩNguyễn Thuý Hương thì thành phần môi trường để nhân giống và lên men như sau:(tính trên 1 lít nước dừa già) [3, 4, 5, 6]

 (NH4)2SO4: 8g

 (NH4)2HPO4 : 2g

 saccharose: 10-20g

 Cao nấm men: 2g

 pH: 4,5 (chỉnh bằng acid acetic)

 Môi trường nhân giống đem đi tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút rồi đượclàm nguội, môi trường lên men được thanh trùng bằng cách đun sôi trong 20 phút

1.2.3 Quy trình công nghệ sản xuất BC:

Nước dừa già

Giống vi khuẩn

Lọc- Bổ sung

chất dinh dưỡng

Thanh trùng

Cấy giống

Nhân giống cấp 2

Nhân giống cấp 1

Chỉnh pH Làm nguội

Lên men

BC

Hình 21 Sơ đồ quy trình lên men sản xuất BC [6]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng:

Để đánh giá được quá trình tổng hợp BC, vấn đề hiểu biết và mô tả đượccác nhân tố tác động đến quá trình là rất cần thiết Chỉ sau khi kiểm tra riêng lẽ tácđộng của từng nhân tố thì người ta mới chọn được phạm vi đặc trưng của các điềukiện mà tại đó quá trình tổng hợp đạt được tối đa Các nhân tố then chốt tác độngtrực tiếp đến quá trình có thể được chia ra thành 3 nhóm chính, đó là thành phầnmôi trường lên men, điều kiện lên men và phương pháp lên men

1.2.4.1 Thành phần môi trường:

a) Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

 Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của

chủng A xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn

nitơ là dịch chiết nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3 [32] Từ khi thànhphần môi trường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hếtcác nghiên cứu về sản xuất cellulose vi khuẩn Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhauđã có sự thay đổi thành phần môi trường liên quan đến phần trăm của nitơ từ cácnguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steep liquor), peptone,trypton, cao thịt, proteopeptone… Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứng dụng,trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tếbào và tốc độ tạo cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồnnitơ có giá thành tương đối rẻ [40, 38, 73]

 Các amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate Masaoka et

al (1993) đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế

bào và tăng hiệu suất tạo cellulose so với môi trường không có amino acid này[51]

 Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid và biotin đượcxác định là cần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khipantothanate và riboflavin cho kết quả ngược lại [85]

 Người ta tìm ra ammonium dihydrogen phosphate có thể được sử dụng thaycho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ, và thêm vào một lượng nhỏ dịchchiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/l) thì cho sản lượng cao [26]

b) Ảnh hưởng của nguồn carbon:

 Ban đầu khi nghiên cứu về Acetobacter xylinum người ta đã chứng minh

được rằng đường fructose là nguồn carbon cho sản lượng cellulose tốt nhất, trongkhi những cơ chất khác cũng được đánh giá là thích hợp bao gồm glucose, sorbitolvà mannitol cho sản lượng cao [64] Glycerol, galactose, lactose, sucrose vàmaltose được xem là những cơ chất thích hợp, trong khi đó sorbose, mannose,

có khả năng sử dụng để tạo nên màng cellulose [34]

 A xylinum có khả năng phát triển và sản sinh cellulose trên những cơ chất

đa dạng khác nhau Chính điều này dẫn tới nhiều nghiên cứu liên quan đến việc tối

ưu hóa môi trường cho sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật này, và những cố gắngđể thay đổi sản xuất cellulose dựa vào cơ chất Dudman ( 1959a) kiểm tra một số

hydratcarbon thô trong một môi trường nuôi cấy của A acetigenum và xác định mật

rỉ được thủy phân và làm giàu fructose, là nguồn hydratcarbon thích hợp để sảnxuất cellulose cho năng suất cao nhất Tiếp sau đó là mật thô cũng cho năng suấtcao [27, 26]

 Oikawa và cộng sự (1995) tìm thấy D-mannitol là một cơ chất có hiệu quả để sản xuất cellulose với A xylinum Môi trường tối ưu ngoài mannitol còn có chứa

polypeptone và cao nấm men Họ tìm thấy môi trường này có thể cho sản lượngcellulose tăng 3 lần so với khi sử dụng glucose trong điều kiện lên men tương tựnhau Những tác giả đề nghị rằng mannitol trước hết được chuyển đổi thànhfructose trước khi vào con đường sinh tổng hợp cellulose[55]

 Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khácnhau đối với các cơ chất khác nhau Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất

cho A xylinum IFO 13693 tổng hợp cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên

tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men [51] Tuy nhiên, hàm lượng

cellulose được tổng hợp bởi A xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất là glucose (Oikawa et al., 1995) Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996).

 Embuscado và cộng sự., 1994 xác định mối quan hệ của 4 nhân tố cơ bản,

gồm nồng độ fructose hay sucrose, pH, nhiệt độ lên men, và sản lượng cellulose.Sự phân tích cho thấy những giá trị tối ưu là 24,8g/l fructose hay 76,5g/l sucrose,

pH là 4,49, và nhiệt độ thích hợp là 29,3oC

 Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khuẩn A xylinum IFO 13693 khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn

làm nguồn carbon để đối chứng

Bảng 8 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của A xylinum

IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998) [38 ]

Nguồn Carbon Năng suất tổng hợp cellulose (%) Monosaccharides

167337-11

1841893620380

201512620.5

c) Aûnh hưởng của acid acetic [72]

Trong quá trình nuôi cấy Acetobacter xylinum trên môi trường glucose,người ta nhận thấy nếu bổ sung thêm 2% acid acetic( 20g/1lít môi trường ), sảnlượng cellulose tăng thêm 4 lần Tuy nhiên khi bổ sung một vài acid hữu cơ khácnhư succinic hay gluconic acid đều không làm tăng năng suất tổng hợp cellulose.Sự tăng sinh cellulose trên không phải do tạo pH thích hợp đối với chủngAcetobacter xylinum Acid acetic được xem như một cơ chất kích thích tế bào vikhuẩn sản sinh nhiều cellulose

d) Aûnh hưởng của lactate [54]

 Tác động của lactate lên quá trình sinh tổng hợp BC được nghiên cứu ởchủng BPR3001A trên môi trường fructose Việc bổ sung 12,5g/l lactate vào môitrường sẽ tăng năng suất tạo BC lên 36% Khi bổ sung lactate, nồng độ ATP nộâibào cũng tăng cao hơn hẳn so với môi trường chỉ có CSL-Fructose

 Trong nuôi cấy mẻ dùng lactate làm nguồn carbon chính , 77% lactateđược tế bào sử dụng và chuyển thành CO2, trong khi chỉ có 6,9% lactate đượcchuyển thành BC Ta thấy lactate chỉ có chức năng chính làm nguồn năng lượngcho tế bào vi khuẩn hoạt động chứ không phải là cơ chất chính cho quá trình sảnxuất BC Sự gia tăng nồng độ ATP nội bào chính là nguyên nhân làm cho BC đượctổng hợp nhiều hơn vì có tác dụng kích thích tế bào chuyển hóa fructose tạo BC

e) Aûnh hưởng của acid lactic [34]

Nếu thêm acid lactic vào môi trường sẽ thúc đẩy tế bào sản sinh BC Điềunày là do acid lactic làm tăng hàm lượng ATP nhờ enzyme lactate dehydrogenasevà làm tăng hoạt động của chu trình TCA bằng việc sản sinh nhiều pyruvate

f) Aûnh hưởng của acid carbonic [34]

Người ta nhận thấy nếu thêm acid carbonic vào môi trường sẽ làm tế bàosinh sản nhanh hơn ở pha lag và sản lượng BC cũng gia tăng

g) Aûnh hưởng của ethanol [34]

Khi thêm vào môi trường cơ bản 1.4% ethanol thì sản lượng BC tăng 4 lần

h) Các chất kích thích tạo Bacterial Cellulose

 Hestrin, Aschner và Mager (1947) khám phá ra rằng khi thêm một lượngnhỏ ethanol sẽ thúc đẩy quá trình tạo cellulose [34]

 Những nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng khi thêm những chất dinh dưỡng

nhất định hoặc những enzyme thì làm tăng thêm sự tạo thành cellulose Tajima và cộng sự., (1996) đã tăng thêm sự hình thành của cellulose bằng cách thêm dịch hòa

tan chitosan Mặc dù số lượng tế bào không thay đổi so với môi trường ban đầu,nhưng sự tạo thành cellulose tăng thêm khoảng 50% Điều này cho thấy có sự kíchhoạt con đường sinh tổng hợp cellulose hơn là sự tăng trưởng của toàn bộ tế bào[71] Đồng thời, chitosan được hợp nhất vào trong cellulose với số lượng lên tới

17% Khi thêm vào endoglucanase, enzyme được phân lập từ vi khuẩn Bacillus subtilis, cũng cho thấy cho sự tạo thành cellulose tăng [66] Enzyme cũng làm giảm

lượng polysaccharide không mong muốn có tên là acetan Không giống nhưchitosan, enzyme thêm vào không ảnh hưởng tới cấu trúc của cellulose vi khuẩn

 Sự thêm vào những tiền chất của quá trình tổng hợp cellulose như Uridine,Guanine, hoặc Guanosine chỉ có những thúc đẩy vừa phải Những ion như Calci vàMagnê khi thêm vào sẽ thúc đẩy khả năng tạo thành BC, Natri không có ảnhhưởng, và những Ion Kali thì kìm hãm quá trình tạo thành cellulose Caffein thúcđẩy đáng kể quá trình tạo thành cellulose

Ishikawa và cộng sự (1995)ï khám phá ra rằng khi thêm vào p -aminobenzoic acid

(PABA) vào trong môi trường thì làm gia tăng sự tăng trưởng của tế bào và từ đógia tăng tốc độ sản xuất Họ sử dụng các tác nhân hóa học để chọn lọc ra nhữngdòng có khả năng chống lại được sulfaguanidine, một đồng phân của PABA.Những tế bào này thì có thể tích lũy chính xác PABA và như vậy sản sinh nhiềucellulose hơn, năng suất tốt nhất là tăng hơn 40 % so với chủng ban đầu

i) Các chất ức chế tổng hợp Bacterial Cellulose

Dudman phát hiện ra rằng Natri Clorua có tác dụng kìm hãm sự tạo thànhcellulose, ở nồng độ 5g/l thì nó làm giảm sản lượng sản xuất cellulose đến 50%.Tác giả cũng khám phá rằng những tế bào không phát triển lâu, mặc dù việc đầyđủ nguồn và nitơ thích hợp nhưng tế bào vẫn không sản sinh cellulose Đường trongmôi trường tiếp tục sẽ được sử dụng và chuyển đổi thành những sản phẩm phụ chothấy những tế bào vẫn tồn tại tuy nhiên không phát triển được [27]

j) Tác hại của cellulase [53]

 Acetobacter xylinum sản sinh cả cellulose và cellulase

 Husemann và Werner cho rằng mức polymer hóa giảm do cellulase tế bàothải ra môi trường trong suốt quá trình nuôi cấy tĩnh kéo dài Lúc này bề mặt lớp

BC do được tạo ra trước, chịu nhiều ảnh hưởng của cellulase hơn, nên nhũn hơn, dễrách hơn so với lớp đáy mới được tạo ra Tuy nhiên các tác giả không chỉ ra đượchoạt động của cellulase lên quá trình polymer hóa trong ống nghiệm

phân CM-cellulase và cellotriase Tính thủy phân của các enzyme này cao nhất ở

pH 5 và giảm đi 80-90% hoạt tính ở pH 4 Cả 2 enzyme đều thuỷ phân tốt BC

 Nhóm Tabuchi, Watanabe, Yano và Yoshinaga đã làm nhiều thử nghiệmtrong ống nghiệm cho thấy cả 2 enzyme đều làm giảm mức polymer hoá cellulose.Họ đã nghiên cứu sự thay đổi lượng BC trong quá trình nuôi cấy trộn ở pH 4 và 5,đồng thời so sánh các đặc điểm vật lý của sản phẩm BC sinh ra từ 2 điều kiện pHtrên Kết quả thí nghiệm như sau:

Bảng 9 Đặc điểm vật lý của sản phẩm BC sinh ra từ 2 điều kiện pH 4 và 5

Tại pH 4 Tại pH 5

 Kết quả trên cho thấy 2 loại cellulase trên không chỉ ảnh hưởng làm giảmmức polymer hóa mà còn làm giảm tính chất vật lý của sản phẩm BC

 Nhóm nghiên cứu cho biết enzyme cellotriase là enzyme nội bào Cả haienzyme CM-cellulase và cellotriase hoạt động gần plasmid của tế bào Hoạt tínhcủa chúng lại có trong môi trường lên men cho thấy chúng có thể bị tiết ra hay rò rĩkhỏi tế bào và tác động lên BC ngoài môi trường

 Lượng cellulase sinh ra tỷ lệ với tăng trưởng của tế bào Khi tế bào ngừngtăng trưởng, cellulase vẫn còn trong môi trường và không tăng thêm

k) Aûnh hưởng do nhiễm vi sinh vật khác :

 Trong quá trình nuôi cấy, canh trường lên men có thể nhiễm các vi sinh vậtkhác và ảnh hưởng đến cấu trúc của BC, điển hình như:

 Miếng BC dễ dàng tách ra thành vài lớp do bị nhiễm nấm mốc

 Nếu lượng nấm men cộng sinh với Acetobacter xylinum quá lớn thì miếng

BC sẽ bị mềm nhũn

 Khi vi sinh vật lạ bám lên miếng BC chúng làm thay đổi cấu trúc miếng

BC có thể theo các cách:

 Bản thân tế bào vi sinh vật có thể chen vào giữa miếng BC

Tế bào vi sinh vật nhiễm tiết cellulase phân hủy BC