Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm

Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện giới, sản phẩm từ hạt Kefir (Kefir Grains) ưa chuộng giá trị dinh dưỡng mà cịn đem lại cho người Ngồi việc cung cấp vi sinh vật có lợi, kefir cịn có tác dụng chống lão hóa tăng cường khả tiêu hóa Với ứng dụng có tính phục vụ cho sức khỏe người, kefir số công ty nghiên cứu phát triển nên số sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao sữa chua kefir Khác với sữa chua thông thường, kefir sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men Đây là, sản phẩm biết đến loại thực phẩm chức giúp tăng cường khả miễn dịch, giảm căng thẳng thần kinh, điều hồ huyết áp lợi ích sức khoẻ khác mà xem điều bí mật Song, sản phẩm có mặt từ lâu đời giới, thị trường tiêu thụ Việt Nam Do đó, để góp phần giúp cho sản phẩm Kefir ngày phổ biến quen thuộc với người tiêu dùng, việc nghiên cứu nâng cao chất lượng làm đa dạng phong phú cho sản phẩm Kefir điều cần thiết Với ý nghĩa khoa học thực tiễn nêu đồng thời chấp nhận Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, tiến hành thực nghiên cứu đề tài “Tổng quan kefir ứng dụng kefir thực phẩm” 1.2 Mục đích Tìm hiểu kefir ứng dụng kefir lĩnh vực thực phẩm lĩnh vực khác sống 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu thành phần, tính chất, hệ vi sinh vật, cơng dụng hạt Kefir (Kefir Grains), quy trình chế biến bảo quản giống Kefir Quy trình chế biến sữa chua Kefir (Kefir) Quy trình chế biến nước nho lên men Kefir Nghiên cứu khả trung hòa tính gây độc tế bào yếu tố ngoại bào B cereus kefiran SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu hạt kefir 2.1.1 Nguồn gốc hạt Kefir Cách hàng nghìn năm, Kefir biết đến thứ nấm dùng chữa bệnh, xuất xứ từ cách ni riêng tu sĩ Ấn Tạng Đây loại nấm vi khuẩn làm biến đổi sữa nhờ hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn nấm men chứng minh có lợi cho sức khoẻ Dân miền núi Caucasus thuộc nước Xô Viết cũ - nguyên quán Kefir - bào chế từ sữa sinh vật khác Kefir lên men tự nhiên túi da thú, theo tộc người họ xem kefir quà tặng đấng Allah, nguồn tài sản gia đình tộc, họ tiêu thụ Kefir từ thuở ấu thơ trì từ hệ đến hệ khác Họ đến bệnh ung thư, bệnh lao, bệnh dày… họ thọ đến trung bình 110 tuổi Núi Caucasus vùng địa cầu mà người ta đạt sức khoẻ hoàn toàn lứa tuổi Từ sớm bác sĩ Nga tin tưởng Kefir có lợi cho sức khoẻ có khả chữa bệnh Mãi đến năm đầu kỷ 20 hạt Kefir sản xuất với số lượng nhỏ Moscow Nguyên liệu để sản xuất Kefir sữa dê, sữa cừu hay sữa bò Theo Oberman H Libudiziz Z (1998) người ta lên men sữa thành Kefir túi da thú bồn gỗ sồi Đến cuối kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc dân nước vùng đông âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari ) nước vùng Scandinavia Tuy nhiên để sản xuất sản phẩm Kefir cho mục đích thương mại mà giữ chất lượng sản phẩm truyền thống điều khơng dễ dàng theo truyền thống người ta khơng sử dụng vật dụng kim loại cho trình chế biến mà từ dụng cụ gỗ, đất sét da thú Đến 1950, phương pháp sản xuất Kefir cơng nhận chất lượng phương pháp lên men có khuấy trộn Hiện có hai loại Kefir, loại có vị lên men với nước trái đường, loại lên men từ sữa Hệ vi sinh vật sử dụng sản phẩm Kefir bao gồm vi khuẩn lactic nấm men Chúng phát triển cộng sinh môi trường sữa Do sản phẩm Kefir có vị chua đặc trưng thoảng nhẹ mùi nấm men SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 2.1.2 Hạt Kefir Trong sản xuất Kefir, người ta sử dụng tổ hợp giống vi sinh vật dạng hạt Kefir ( Kefir Grains) Các hạt Kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định thường kết thành chùm với tạo dạng tương tự hoa Chou-fleur với đường kính trung bình 0,3÷2 cm Hạt Kefir phức hệ vi sinh vật gắn với chất polisaccharide Các hạt bao gồm chủ yếu vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Lactococci, Leuconostoc ) nấm men Đơi ta cịn tìm thấy vi khuẩn A.aceti A.racens với vi sinh vật khác tổ chức thành khối cầu vi sinh vật Tuy chưa làm sáng tỏ hoàn toàn từ hàng nghìn năm qua tiêu thụ chứng minh hệ vi sinh vật Kefir khơng gây bệnh mà cịn có khả ngăn chặn phát triển vi sinh vật gây bệnh Salmonella hay Shigella Hình 2.1: Hình dạng, kích thước hạt Kefir nguyên vẹn sau cắt đôi (http://user.chairot.net.au/~dna/thumb3-WKG.jpi) Thành phần, cấu trúc tạo nên cấu trúc hạt kefir polisaccharide Polisacharide chủ yếu nước, vật chất hoà tan biết Kefiranofaciens L kefir sản sinh polisacharide Chúng phần hạt, khơng có diện chúng hạt Kefir khơng thể hình thành Ngồi tế bào vi sinh vật, hạt Kefir chứa protein (chiếm khoảng 30% tổng chất khơ) Carbohydrate (25÷50%) Như từ số thông tin đưa thành phần hợp thành hạt giống Kefir phức protein Polisacharide béo Thành phần hạt giống sấy khô đông lạnh với hàm ẩm 3,5% tìm thấy bao gồm: béo 4,4%, tro: 12,1%, Muco-polisacharide (Kefiran): 45,7%, protein tổng số 34,3% gồm có: protein khơng hồ tan 27%, protein hồ tan 1,6% acid amin tự 5,6% SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 2.1.3 Chu kỳ phát triển giống Kefir Kefir giống gốc tự nhiên, chúng hình thành từ màng bao bọc mỏng khơng theo quy tắc bao gồm hỗn hợp protein, lipid, polisacharide Những màng bao bọc phát triển với hình dạng khơng định, hình thành thuỳ phức tạp khơng đồng đều, thuỳ lại có xu hướng trở nguyên tạo thành cấu trúc sinh học bao gồm nhiều thuỳ bao quanh Với dấu hiệu phát triển đặc biệt chúng hình thành hạt con, tiểu thuỳ kết nối với phần giữa, xịe gắn với điểm trung tâm hạt giống mẹ Hình 2.2: Sự hình thành hạt kefir SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Nhờ xuất mà hạt tách có mẫu hình phát triển giống hạt mẹ ban đầu Sau thời gian chấn thương tác động bên ngoài, phần thùy gắn với hạt mẹ bị tách thành hạt tự Những hạt lại tiếp tục nhân giống thành hạt mẹ Chu kỳ phát triển lặp lại với chu trình gần giống (tự nhân giống) Trong vài trường hợp đặc biệt, có hạt khơng thể cho hạt thời gian dài mà thay vào đó, chúng hình thành nên khối lớn (khối hạt Kefir) Hình 2.3: Hạt Kefir sau vớt khỏi sữa nước đường (www.Kleibers.de/ /guido/4a_kefir_tibet.jpg) Bề mặt hạt biến đổi từ dạng phẳng đến khơng đồng gồm nhiều thứ phức tạp, có chỗ lồi lõm rải rác khắp bề mặt Một vài hạt có vùng rộng phẳng, từ mẻ tương tự có hạt có bề mặt không đồng Nếu điều kiện thuận lợi, sau thời gian, hạt nhẵn thường trở lại dạng ngun thể, sau hình thành hạt bao quanh mình, nơi mà nhân giống lên Thường vùng khơng phẳng, xù xì thường có hoạt động mạnh nấm men, vùng phẳng vi khuẩn lại chiếm ưu Nấm men hình thành khóm nhỏ nhơ bề mặt, Streptococci bện vào với vi khuẩn khác khơng hình thành dạng cụm Ở sâu bên hạt, Lactobacilli chiếm ưu có tế bào nấm men, chúng gói gọn dịch polisacharide, vi khuẩn hình que nấm men hình thành cụm riêng biệt bên bên hạt Ở Lb.Kefiranoficients xem ngun nhân hình thành polisacharide hịa tan Kefiran Trong L SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm bacitophilus nguyên nhân hình thành vỏ bọc bên ngồi polisacharide mà giúp hạt co giãn Một số nghiên cứu cho vi khuẩn gây nhân giống hạt Kefir việc nhân giống hạt khơng xảy vắng mặt Lb kefiranoficients vi khuẩn sinh Kefiran trung tâm hạt 2.1.4 Kefiran Hình 2.4: Cấu tạo hóa học Kefir (www.kefir.co.kr/eng/image/sub_img_11.gif) Cơ chế phức tạp cấu trúc gian bào vi sinh vật hạt Kefir chưa giải thích rõ ràng Người ta khám phá gel hòa tan polysaccharide hạt kefir điều đủ cho tên gọi kefiran (KGF-C) Hạt kefir sấy khô bao gồm chất gian bào khoảng 45% kefiran Polisaccharide gồm hai đường đơn glucose galactose với tỉ lệ cân đối Kefiran hình thành trung tâm hạt, với điều kiện kỵ khí thuận lợi cho việc tổng hợp kefiran diện ethanol Một vài loài Lactobaccilli khác sinh polisaccharide Lb brevis, Lb sp Các loài Lactobaccilli khác sản sinh dạng gel polisaccharide gần giống tốc độ khác Đây phần chế phức tạp hạt kefir Có thể khuynh hướng khác mà Lactobaccilli sản sinh phần trung tâm hạt Một thử nghiệm chuột phát tính kháng ung bứu Kefiran Trong thử nghiệm kefiran cung cấp từ đường miệng chuột kết cho thấy kích thước khối u giảm rõ SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 2.1.5 Hệ vi sinh vật hạt Kefir Nhóm vi khuẩn lactic lactobacillus chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật hạt Kefir Chúng gồm loài ưa ẩm ưa nhiệt thực trình lên men lactic theo chế lên men đống hình lẫn dị hình Nhóm vi khuẩn lactic Lactococci chiếm 20% tổng số tế bào, Bacilli 69%, Streptococci 11-12%, nấm men chiếm 16-20% Hình 2.5: Ảnh chụp hạt Kefir kính hiển vi điện tử gồm vi khuẩn, nấm men, chất gian bào (Kefir.vilabo.oul.com) Riêng nấm men chiếm 5÷10% tổng số vi sinh vật hạt gồm lồi lên men lẫn khơng lên men đường lactose Các loài nấm men lên men đường lactose thường tìm thấy vị trí gần bề mặt hạt Kefir Ngược lại, loài nấm men khơng lên men đường lactose lại tìm thấy vị trí sâu bên tâm hạt Các tế bào nấm men tạo rượu cacbon dioxyt Protein bị phân giải phần trình trao đổi chất nấm men mà kết làm cho kefir có mùi đặc trưng nấm men Hàm lượng acid lactic, alcol cacbon dioxyt điều chỉnh nhiệt độ lên men SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Bảng 2.1: Các vi sinh vật có hạt Kefir (Oberman H cộng sự, 1998) Giống vi sinh vật Vi khuẩn Lactobacilli Loài Lb brivis Lb cellobiosus Lb acidepphilus Lb Kefir Lb casei ssp alactosus Lb casei ssp rhamnosus Lb helveticus ssplactis Lb delbruevii.ssp.lactic Lb paracasei.ssp.paracasei Lb casei Lb lactis Lb plantarum Lb delbrueckii ssp hulgaricus Lb fructivorans Lb hilgardii Lb kefiranofaciens Lb kefirgarnum sp.nov Streptococci Lb parakefir sp.nov S thermophilus S lactis S filant Lactococci S durans Lc lactis.ssp.lactis Lc lactis.ssp.lactis var diacetylactis Leuconostoc Lc lactis.ssp.cremoris Leuc mesesteroides.ssp.dextranicum Acetobacter Leuc mesenteroides.ssp.cremoris Acetobcaters casei Acetobacters rasenes Nấm men SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Kluyveromyces K lactis K marxinnus ssp bulgaricus Saccharomyces K.morxianus ssp Marxianus S lactis S cerevisiae S florentinus S globosus S unisporus S.carlsbergensis Candida S ssp torulopsis holmii C kefir C pseudotropicalis C tenuis C rancens Torulaspora T delbrueckii (Lê Văn Việt Mẫn, 2004 nguồn internet) 2.1.5.1 Vi khuẩn lactic a Đặc điểm chung vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium, vi khuẩn Gram (+) Đây trực khuẩn cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường khơng chuyển động kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng khơng chứa cytochrom enzyme catalase, chúng có khả sinh tổng hợp enzyme peroxydase mạnh, phân giải H2O2 để phát triển Đa số chúng lên men mono disaccharide, số không lên men saccharose, số khác không lên men đường maltose Các vi khuẩn lactic khơng có khả lên men tinh bột polysaccharide khác (chỉ có lồi L delbruckii đồng hóa tinh bột) Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình oval hình que, đường kính dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, tế bào hình cầu xếp thành cặp chuỗi có chiều dài khác Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thường đứng riêng lẻ kết thành chuỗi Các loài vi khuẩn lactic có khả khác tạo thành acid môi trường sức chịu đựng acid khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm tạo thành acid cao (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn phát triển pH = 4-3,8 cịn cầu khuẩn khơng thể phát triển môi trường Hoạt lực lên men tốt trực khuẩn lactic vùng pH = 5,5-6 Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt trực khuẩn đồng hình) kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng phát triển mơi trường có tương đối đầy đủ yếu tố dinh dưỡng cần thiết acid amin, peptide, protein, vitamin (B 1, B2, B6, PP, acid pantotenic acid folic)… Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy protein sữa tới peptide acid amin Hoạt tính lồi có khác nhau, thường trực khuẩn cao Chúng chịu trạng thái khô hạn, bền vững với CO cồn ethylic, nhiều loài sống mơi trường có 10-15% cồn cao hơn, số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10% Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 25-350C, lồi ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu 40-45 0C, lồi ưa lạnh phát triển nhiệt độ tương đối thấp (khoảng 0C thấp hơn) Khi gia nhiệt tới 60-800C hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút Một số loại có khả tạo màng nhầy Một số khác có khả đối kháng với thể hoại sinh vi sinh vật gây bệnh làm thối rữa thực phẩm Vi khuẩn lactic khả lên men lactic, chúng cịn có khả sản sinh chất kháng khuẩn gọi bacteriocin ứng dụng nhiều y học bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic phân bố rộng thiên nhiên, đất, nước, khơng khí, chủ yếu có mặt thực vật (đặc biệt có cỏ), thực phẩm (rau, quả, sữa, thịt,…), số chủng có mặt hệ thống đường ruột thể người động vật Trong thể người động vật, ngồi đường ruột chúng cịn tồn khoang miệng Các dạng cầu khuẩn đường ruột gọi Enterococus hay Streptococus fecalis Phân loại vi khuẩn lactic chưa hồn thiện cịn nhiều tranh cãi, chủ yếu phân loại dựa theo hình dáng tế bào Thí dụ: cầu khuẩn xếp giống Streptococcus Leuconostoc, trực khuẩn xếp thành giống Lactobacillus b Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất vi khuẩn lactic SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 10 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm phẩm, có acid formic sản phẩm phụ điển hình, chất thơm rượu vang Lên men lactic Có hai kiểu lên men lactic: điển hình dị hình Trong kiểu lên men lactic điển hình sinh acid lactic (tạo vị chua cho sản phẩm), cịn kiểu lên men dị hình khơng điển hình sản phẩm cuối acid lactic, ethanol, acid axetic CO2 (tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm này) Aceton diacetyl: có ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang, số lượng chúng tạo rượu vang khơng lớn lắm: acetoin từ 2,0÷84 mg/l diacetyl từ 0,1÷1,8 mg/l Sự có mặt chúng ảnh hưởng lớn đến hương vị rượu vang nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao làm biến đổi hóa sinh rượu, gây mùi vị không tốt cho rượu Aldehyd ester: hợp chất quan trọng hình thành nên hương vị loại vang Aldehyd gồm: aldehyd acetic, propionic, butyric, valeric… Ester gồm: etylbytyrat, ester rượu bậc cao… - Giai đoạn lên men malolactic thực vi sinh vật lactic Ở giai đoạn lên men malolactic hay gọi giai đoạn lên men phụ thực số vi khuẩn như: Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc, nhằn tạo cho rượu vang tính chất cảm vị đặc thù Điểm đặc trưng cùa giai đoạn acid hữu cơ, tác dụng phức hệ enzyme vi khuẩn lactic, bị biến đổi sâu góp phần tạo lên rượu vang Ví dụ như: acid malic có nho thành tố quan trọng nhất, chuyển hóa phức hệ enzyme vi khuẩn thành acid lactic khí cacbonic theo đường hướng khác Trong đó, đường hướng tiêu biểu đường hướng acid L-malic xúc tác enzyme malolactic chuyển hóa theo phương trình phản ứng sau: HOOCCH2CHOHCOOH Enzyme malolactic CH3CHOHCOOH + CO2 Cuối giai đoạn này, rượu vang hình thành, CO2 bão hịa, hạt lơ lửng rượu vang, tanat muối tartrat lắng xuống làm rượu vang trở lên  Quá trình phối chế thành phẩm sau lên men: SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 57 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Có thể thêm đường không (tùy thuộc độ sản phẩm), cho thêm vài giọt acid citric nước cốt chanh (có tác dụng điều hòa vị chua cho sản phẩm) e Thành phần dinh dưỡng lợi ích sản phẩm: Bảng 3.4: Thành phần dinh dưỡng sản phẩm nước nho lên men Kefir (khối lượng 253g) cho lượng khoảng 155kcal Thành phần chất Nước Protein Béo Tổng cacbonhydrat Ca Mg Na Fe P Vitamin A Vitamin C Riboflavin Thiamin Niacin Khối lượng 84% 0,55% 0,08% 15 8,69mg% 9,48mg% 2,76mg% 0,237mg% 10,67mg% 20(IU) 0,079mg% 0,039mg% 0,027mg% 0,276mg% 3.6 Nghiên cứu khả trung hịa tính gây độc tế bào yếu tố ngoại bào B cereus kefiran 3.6.1 Dịng vi khuẩn điều kiện ni cấy B cereus phân lập từ vụ ngộ độc thực phẩm cung cấp Laboratorio Central de Salud Pública, Buenos Aires, Argentina Dịch gốc bảo quản - 800C glycerol chất chống đông lạnh Vi khuẩn tái hoạt hóa 16 h 320C môi trường BHI broth bổ sung 0,1% glucose Sau đó, cấy chuyển dịch vi khuẩn vào ml mơi trường BHI broth có bổ sung 0,1% glucose ủ nhiệt độ 320C 16h điều kiện lắc Các tế bào tự sử dụng nuôi cấy thu sau tiến hành ly tâm (900 v/p) lọc (màng lọc 0,45 μm) pH dịch điều chỉnh lên 7,0 NaOH 5N để tránh hư hại tế bào mơi trường acid Tiến hành pha lỗng dịch nuôi cấy PBS Môi trường BHI broth sử dụng làm đối chứng Độ chuẩn hoạt tính sinh học xác định thử nghiệm 3.6.2 Phân lập định lượng kefiran SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 58 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Hạt kefir xử lý nước sôi (tỷ lệ hạt kefir : nước = : 10) h cách khuấy gián đoạn Hỗn hợp ly tâm 10000 v/p 20 phút 200C Polysaccharide dịch huyền phù kết tủa cách thêm thể tích cồn lạnh bảo quản nhiệt độ - 20 0C qua đêm Sau đó, hỗn hợp ly tâm 10000 v/p 20 phút nhiệt độ 40C Các chất kết tủa bị phân hủy nước nóng quy trình kết tủa lặp lại hai lần Chất kết tủa cuối hòa tan nước nóng vơ trùng (dung dịch kefiran) Nồng độ polysaccharide xác định phương pháp anthrone, đo độ hấp thụ bước sóng 620 nm sử dụng dung dịch glucose làm chất chuẩn Kefiran pha loãng để sử dụng cho thử nghiệm 3.6.3 Nuôi cấy tế bào biểu bì ruột người Tế bào Caco – nuôi cấy môi trường Dulbecco's modified Eagle's minimum essential (DMEM) chứa glucose với nồng độ 25 mM, bổ sung thêm 15% huyết bào thai bê bị bất hoạt nhiệt, 1% acid amin không thiết yếu, penicillin (12 UI/ml), streptomycin (12 μg/ml), gentamycin (50 μg/ml) fungizone (1,25 μg/ml) Để trì, tế bào cấy chuyển tuần, sử dụng 0,02% trypsin Ca2+ PBS khơng có Mg2+ Các tế bào lớp chuẩn bị đĩa nuôi cấy mô 24 giếng cách cấy 7.104 tế bào/giếng Thí nghiệm giữ tế bào ủ nhiệt độ 37 0C điều kiện 5% CO2 – 95% khơng khí Mơi trường ni cấy thay đổi ngày 3.6.4 Sự tách rời tế bào Sự tách rời tế bào Caco-2 đo lường theo nghiên cứu Minnaard ctv (2001) Tóm lại, tế bào biệt hóa ủ với dịch lọc có nồng độ pha loãng khác 370C h có diện nồng độ kefiran từ – 1000 mg/l Sau ủ, tế bào rửa với PBS, cố định phút với formaldehyde 2% PBS rửa lại Tiến hành nhuộm cách ủ 20 phút nhiệt độ phòng với 500 μl crystal violet Sau rửa PBS để loại bỏ thuốc nhuộm, mẫu xử lý khoảng h với cồn 50% PBS nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ bước sóng 650 nm Phần trăm tế bào gắn kết tính tốn theo cơng thức: 100 x (A/Ac), A độ hấp thụ tế bào xử lý; Ac độ hấp thụ tế bào đối chứng không xử lý SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 59 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 3.6.5 Hoạt tính dehydrogenase ty thể Tế bào đơn Caco – ủ với độ pha loãng dịch huyền phù khơng có diện tế bào B cereus khơng có diện kefiran (800 mg/l) Sau ủ 370C 1h, tế bào tách rời cách cạo học ủ với 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) 4h 37 0C Thử nghiệm MTT dựa vào khả chuyển hóa MTT thành formazan màu tím, khơng tan nhờ hoạt động dehydrogenase ty thể Mẫu ly tâm 14000 v/p vết màu chiết với HCl 0,1N isopropanol Sau ly tâm, độ hấp thu đo bước sóng 550 nm đĩa đọc Phần trăm hoạt tính trì tính theo cơng thức: 100 x (A/Ac), A độ hấp thụ tế bào xử lý; Ac độ hấp thụ tế bào đối chứng không xử lý 3.6.6 Đánh dấu với FITC annexin V propidium iodine Phương pháp sử dụng van Engeland (1999) Theo đó, sau 1h ủ với dịch ni cấy B cereus nồng độ kefiran khác nhau, tế bào rửa lần với buffer gắn Sau đó, thêm μl FITC – annexin V, μg propidium iodine 100 μg Rnase 100 μl buffer gắn Tế bào ủ nhiệt độ phòng 15 phút, rửa lần với buffer gắn làm tiêu glycerol 50% buffer gắn Chụp ảnh kính hiển vi huỳnh quang 3.6.7 Quét kính hiển vi điện tử Tế bào Caco – nuôi cấy mặt kính phẳng Sau ủ 2h với dịch huyền phù khơng có tế bào B cereus, có (800 mg/l) khơng có kefiran, mẫu rửa lần PBS cố định với glutaraldehyde 2,5% Vết bẩn khử nước dung dịch ethanol pha lỗng Cuối cùng, mẫu làm khơ tới hạn cách sử dụng CO2, phủ lớp vàng xác định kính hiển vi electron 3.6.8 Thử nghiệm phân giải hemoglobin Khả phân giải hồng cầu định theo Promdonkoy Ellar (2003) Theo đó, tiến hành pha lỗng dịch huyền phù khơng có tế bào B cereus bổ sung tế bào hồng cầu người PBS Dịch ủ 37 0C tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 600 nm thời điểm khác Ảnh hưởng kefiran SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 60 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm thử nghiệm nồng độ 0, 500, 800 1000 mg/l Phần trăm hồng cầu không bị ly giải tính theo cơng thức % = (A 600 mẫu/A600 đối chứng)x100 Độ hấp thu đo bước sóng 600 nm 3.6.9 Kết Sử dụng dịch huyền phù thử nghiệm tế bào Caco-2 dẫn đến đáp ứng theo liều định Hình 3.10A, hoạt tính sinh học bao gồm tổng tách rời tế bào nồng độ yếu tố ngoại bào cao Không có tách rời ủ với mơi trường BHI BHI kefiran Từ nhận thấy kefiran (800 mg/l) có khả bảo vệ tế bào hồng cầu khỏi hoạt tính tách rời dịch huyền phù B cereus Hình 3.10B chứng tỏ ảnh hưởng nồng độ kefiran khác đến hoạt tính sinh học yếu tố ngoại bào B cereus pha loãng 1/32 Sự bảo vệ chống lại hoạt tính sinh học dịch chiết tương đương với nồng độ kefiran từ 300-1000 mg/l Thật có 55% tế bào trì gắn kết khơng có kefiran giá trị khoảng 80% thử nghiệm tất nồng độ kefiran Hình 3.10: Ảnh hưởng dịch huyền phù B cereus tế bào biểu bì ruột người (Caco – 2) Ảnh hưởng sinh học yếu tố ngoại bào B cereus bao gồm suy yếu hoạt tính dehydrogenase ty thể (hình 3.11) Kefiran bảo vệ chống lại hoạt tính phá hủy tế bào Thật ra, độ pha lỗng dịch huyền phù ni cấy sử dụng B cereus SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 61 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm nồng độ 1/16 trì 50% hoạt tính dehydrogenase ty thể đến 70% hoạt tính trì có diện kefiran Hình 3.11: Ảnh hưởng việc sử dụng dịch huyền phù B cereus B10502 đến hoạt tính dehydrogenase ty thể tế bào Caco-2 có khơng có hiên diện kefiran Tế bào đơn bào Caco – ủ h với dịch huyền phù B cereus có tỷ lệ hoại tử cao (hình 3.12A) Trái lại, có diện kefiran ủ, ảnh hưởng hoại tử giảm đáng kể có vài tế bào tự hủy (hình 3.12B,C) Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát Bề mặt tế bào hấp thu ruột bị thay đổi đáng kể ủ với dịch huyền phù B cereus gồm có ngắn bớt lơng nhỏ (hình 3.13A) Trái lại, với diện kefiran trì giống thực nghiệm đối chứng (hình 3.13B,C) SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 62 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Hình 3.12: Đánh giá số lượng tế bào hoại tử tự chết cách đánh dấu với Annexin V – FITC propiduin Iodine Kết hoạt tính thủy phân hồng cầu dịch huyền phù có liên quan đến tính độc tế bào Q trình thủy phân thể có diện hay khơng có diện kefiran thể hình 3.14 Độ pha lỗng dịch huyền phù ni cấy có B cereus cao (1/192) có ly giải hồng cầu người Hoạt tính ly giải biến bổ sung kefiran nồng độ 800 mg/l Hình 3.13: Kết quét kính vi điện tử tế bào Caco – ủ với dịch huyền phù B cereus có (A), khơng có (B) kefiran, (C) đối chứng SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 63 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Hình 3.14: Kết ly giải tế bào hồng cầu người theo thời gian dịch nuôi cấy B cereus có khơng có diện cửa kefiran SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 64 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sữa kefir có giá trị dinh dưỡng cao tốt cho sức khỏe Ngoài việc cung cấp vi sinh vật có lợi, kefir cịn có tác dụng chống lão hóa tăng cường khả tiêu hóa, giảm căng thẳng thần kinh, điều hoà huyết áp… Khác với sữa chua thông thường, kefir sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men Hệ vi sinh hạt kefir gồm : - Nhóm vi khuẩn lactic: Streptococcus lactic gây đông tụ sữa, Streptococcus diacetylatic tạo mùi hương cho sản phẩm, Lactobaccillus casein phân hủy casein sữa thành acid amin, Lactobacillus helveticus tạo độ chua cho sữa… - Nhóm nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis, Kluyveroyces…giúp thúc đẩy q trình lên men - Nhóm vi khuẩn Acetobacter: đặc trưng Acetobacter aceti có khả đồng hóa đạm hữu nguồn cacbon ethanol, glucose, fructose, saccharose, maltose, glycerin, lactose… Trong thành phần kefir có kefiran, thành phần có nhiều ứng dụng ứng dụng kefiran khả trung hòa khả gây độc tế bào B cereus 4.2 Kiến nghị Kefir quà sống đươc ban tặng cho người Từ xa xưa sử dụng lưu truyền đên Sản phẩm bổ sung số lượng lớn vi sinh vật cho thể, giúp thể khỏe mạnh sống lâu Vì kefir nên sử dụng rộng rãi tìm hiểu kỹ Vì để nâng cao giá trị dinh dưỡng, đa dạng hóa sản phẩm, cúng người tiêu dùng chấp nhận, sản phẩm cần nghiên cứu thêm: - Nghiên cứu phát triển kefir môi trường khác: dịch nguyên chất, sữa đậu nành, sữa dừa, - Khảo sát thời gian thời gian khuấy trộn, nồng độ oxy cung cấp cho trình lên men - Khảo sát thời gian nhiệt độ ủ lạnh sản phẩm sau lên men để sản phẩm có hương vị đặc trưng hấp dẫn SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 65 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm - Nghiên cứu bổ sung chất bảo quản thích hợp cho sản phẩm để sử dụng lâu mà đảm bảo chất lượng không độc hại với người SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 66 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm PHỤ LỤC Bảng 4.1: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm sữa Kefir Điểm Mô tả Mùi Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng sữa chua, mùi thơm dịu dâu Tây hòa hợp với mùi rượu etylic, dễ chịu Sản phẩm có mùi thơm nhẹ sữa chua, mùi thơm dịu dâu Tây thoảng mùi rượu etylic, đặc trưng Mùi thơm sữa chua dâu Tây rõ, mùi rượu nhẹ q nồng, hài hịa Sản phẩm có mùi kém, khơng có mùi tự nhiên sữa chua, khơng có mùi dâu mùi dâu bị biến đổi, mùi acid acetic mạnh Sản phẩm có mùi lạ, nhận biết mùi sữa dâu Sản phẩm có mùi thối, mùi sữa hư hỏng, khó ngửi Vị Sản phẩm hài hòa vị vị chua dịu acid lactic, vị nồng nhẹ cồn CO2 hấp dẫn Sản phẩm có vị chua hài hịa độ cồn cao thấp, tương đối hấp dẫn Vị chua sản phẩm hài hòa, chua ngọt, cồn nhiều q ít, khơng hấp dẫn Sản phẩm chua không chua, vị kém, không hịahợp, khơng phát cồn cồn mạnh, đắng Sản phẩm có vị lạ, nhạt nhẽo Vị khó chấp nhận, đắng chát, biểu hư hỏng Hình thái Sản phẩm đồng nhất, không phân lớp, độ nhớt vừa phải Sản phẩm tương đối đồng nhất, lợn cợn Sản phẩm có dấu hiệu tách nước, độ nhớt cao Sản phẩm bị phân lớp (lớp nước bên trên, dịch sữa bên đồng nhất) độ nhớt cao Sản phẩm bị phân lớp rõ rệt, dịch sữa bên khơng đồng nhất, (có lợn cợn lớn) Sản phẩm bị phân làm nhiều lớp SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 67 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Bảng 4.2: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nước nho lên men Kefir Điểm Mô tả Độ màu sắc Chất lỏng suốt, khơng đục khơng có vật thể lạ nhỏ Có màu sắc đặc trưng nho ( màu: xanh, đỏ, tím, đen…) Chất lỏng suốt, có vật thể lạ nhỏ (xác nho cịn sót lại) Vẫn cịn màu đặc trưng sản phẩm Chất lỏng tương đối trong, có xác cặn nhiều hơn, màu khác so với màu đặc trưng sản phẩm Chất lỏng đục, có nhiều xác cặn nhìn thấy rõ Mùi khác nhiều so với mùi đặc trưng Chất lỏng đục, nhiều lắng cặn, có nhiều xác to hơn, màu không đặc trưng (chuyển từ màu tươi sang màu ngả thâm đen) Vẫn đục, màu tối xác cặn nhiều mặt chất lỏng, sản phẩm bị hư hỏng Mùi Sản phẩm có mùi thơn nồng rượu vang nhẹ, dễ chịu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm Chưa hồn tồn hịa hợp (mùi rượu etylic cay nồng nên khó nhận rõ) Mùi cay gắt, thoảng mùi phụ khác, đặc trưng cho sản phẩm Mùi rượu nồng gắt, thoảng mùi lạ, đặc trưng cho sản phẩm Nồng hăng nồng cay gắt, khó ngửi khơng đặc trưng cho sản phẩm Có mùi lạ sản phẩm bị hư hỏng, khơng ngửi Vị Hòa hợp, êm dịu vị chua nho lẫn vị cay nồng rượu etylic, để lại dư vị tốt Ngoài ra, CO tạo cảm giác mát, khát khoan khoái sau uống Chưa hòa hợp vị, dư vị vừa phải, đặc trưng Cảm giác khát chưa có lượng CO2 cịn Chưa hịa hợp, gắt sốc, dư vị yếu, đặc trưng Vị cay gắt, xen lẫn vị đắng, thoảng vị lạ, đặc trưng SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 68 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm cho sản phẩm Sốc, có vị lạ khó chịu sản phẩm bị hư hỏng SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 69 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Bảng 4.3: Một số vi khuẩn lên men lactic (môi trường nước đường) Streptococcus Trực khuẩn ngắn, gây lên men Nhiệt độ tối thiểu cho lactic chua sữa tự nhiên, yếm khí tùy tiện chúng phát triển 100C, Lên men tốt glucose, maltose, tối ưu 350C cao lactose, tạo mơi trường 450C đường 0,8÷1% acid lactic Nguồn Streptococcus nitơ cho vi khuẩn peptone Thường tạo thành chuỗi dài Phát triển nhiệt độ thp cremoris T bo cú kớch thc l 0,6ữ0,7à hn Streptococcus lactic: Lên men glucose galactose tối ưu 25÷300C, tối đa Lactobacterium 35÷380C Đây trực khuẩn dài, có khả Nhiệt độ phát triển tối đa Vulgaricum lên men glucose lactose 40÷450C, tối ưu 200C, có khả tạo acid cao (có khả tạo 3,7% acid lactic) SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 70 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm Bảng 4.4: Một số nấm men (mơi trường nước đường) Saccharomyces Tế bào hình cầu, hình ôvan hay elip Khi già chúng thường kết cerevisae thành vịng tạo thành màng lên dịch men Hansenula Lên men đường tốt, tạo thành 18% cồn etylic Giống tạo thành màng dịch chứa đường Trên bề mặt nước nho chúng phát triển nhanh tạo màng sau 2÷3 ngày lắng cặn, đồng thời lên men rượu, tích tụ 2÷3% cồn Trong dịch Hansenula phát triển lên men nhẹ, đồng thời acid hóa đường rượu (khi mơi trường có nồng độ rượu 13%) đủ oxy Nó cịn oxy hóa đường rượu, acid hữu làm cho pH môi trường chuyển từ acid thành kiềm Trong trình phát triển, Hansenula chuyển hóa đường thành rượu etylic, butyric, amylic, thành acid acetic, succinic, butyric, ester bay (đặc biệt etyl acetate) làm Kloeckera cho dịch lên men có mùi thơm riêng biệt Giống men trưởng thành có hình dáng ovan, elip apiculata dài.Kích thước tế bào khơng lớn: 3ữ4,5*5ữ11àm Loi nm men ny thng cú trờn qu cú đường (trong có nho) Nó có đặc điểm sinh sản nhanh so với loài khác (so với men rượu vang nhanh gấp lần) 350C ngừng sinh sản, 450C chúng bị chết Điều giải thích giai đoạn đầu lên men, đóng vai trị chủ yếu SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 71 .. .Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu hạt kefir 2.1.1 Nguồn gốc hạt Kefir Cách hàng nghìn năm, Kefir biết đến thứ nấm dùng chữa bệnh, xuất xứ từ cách... sữa Do sản phẩm Kefir có vị chua đặc trưng thoảng nhẹ mùi nấm men SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 2.1.2 Hạt Kefir Trong sản xuất Kefir, người ta sử dụng tổ hợp... hàm lượng ethanol) tiêu cảm quan (mùi vị ) sản phẩm Hình 3.3: Các sản phẩm sữa Kefir SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thảo 40 Tổng quan Kefir ứng dụng Kefir thực phẩm 3.2 Hạt Kefir môi trường nước đường