Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chistreptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè Thái Nguyên

Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chistreptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-   -

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES

SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-   -

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES

SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS VI THỊ ĐOAN CHÍNH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS Vi Thị Đoan Chính

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi

Xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học

và công nghệ Việt Nam

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN

đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu của tôi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008

Tác giả

Bùi Thị Hà

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Những chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

1.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5

1.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn 6

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 8

1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9

1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 10

1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 10

1.2.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11

1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12

1.3.1 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh 12

1.3.2 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16

1.4 MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA

1.4.1 Một số bệnh hại chè do nấm 18

1.4.2 Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật 21

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và hóa chất 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè 27

2.2.2 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28

2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28

2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh 28

2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29

2.2.3 Bảo quản giống 29

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30

2.2.4.1 Đặc điểm hình thái 30

2.2.4.2 Đặc điểm nuôi cấy 31

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31

2.2.5 Lên men tạo kháng sinh 32

2.2.5.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 32

2.2.5.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 33

2.2.5.3 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 33

2.2.6 Các phương pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33

2.2.6.1 Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 33

2.2.62 Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 34

2.2.6.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 35

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 38

3.2.1 Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38

3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41

3.3 Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42

3.3.1 Đặc điểm hình thái 42

3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43

3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 45

* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon 45

* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp 46

* Khả năng chịu muối 46

* Khả năng sinh enzym ngoại bào 47

3.3.4 Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48

3.3.5 Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50

3.4 Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 52

3.4.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 52

3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 54

3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 56

3.5 Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 57

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57

3.5.2 Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 60

4 2 Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo 61

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DNA : Deoxyribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid

ISP : International Streptomyces Project

TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid

SDS : Sodiumdodecyl sulfat

TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid

PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm 37

Bảng 3.2 Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39

Bảng 3 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè 40

Bảng 3 4 Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41

Bảng 3.5 Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 44

Bảng 3.6 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45

Bảng 3.7 Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 46

Bảng 3.8 Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 47

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định 48

Bảng 3.10 So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S misawaensis 50

Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trường lên men khác nhau 53

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 55

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1 Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 38

Hình 3 2 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39

Hình 3.3 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 40

Hình 3.4 Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 42

Hình 3.5 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42

Hình 3.6 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 43

Hình 3.7 Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng 44

Hình 3.8 Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn 47

Hình 3.9 Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 49

Hình 3.10: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tổng hợp CKS 54

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS 55

Hình 3.12 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS 57

Hình 3.13 Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn 58

Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 59

và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái

Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh

Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo

vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững

Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong

phú của Thái Nguyên Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây

-2-

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có

hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một

số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng

3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài

* Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên

- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

* Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định

2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm

từ các mẫu đất khác nhau

3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một

số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn

4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn

-3-

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân

bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì

có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc

từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,

Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn

hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi

Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá

-4- amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [7]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

* Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22]

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ quan sát bằng mắt thường

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh

Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…

Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn

Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

-5-

* Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi

Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh

sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng

Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ [43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi

Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [7]

1.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành

-6- Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A0

chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào

tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại

xạ khuẩn Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13]

Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp khi kích thích

sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi

1.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn

bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp:

Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 120A0

, khi già có thể đạt tới 150 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0

Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào

bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá

-7- trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], [32], [35] [36]

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành

Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom

và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol)

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote

ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11]

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế

-8- chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng

là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau

là khác nhau

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

1.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và

bề mặt bào tử

Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:

RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên như ta đã biết

1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng

20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV

Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho các chi đó

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11]

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

-10- Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [29]

1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh

lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số

Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng

- Công thức của Sokal và Michener (SSM)

-11-

100 N

N N

N N S

d S S

S S

N

N S

d S

S : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)

NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng

so sánh

Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia)

Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu

"rễ cây") của các thông số Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi

Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện

nhất định [44]

1.2.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và

Henrici đặt tên năm 1943 [43] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề

-12- mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi

khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng

rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi

khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là

25 - 300C, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật

Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà

phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [48],[49]

1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh

-13- Theo định nghĩa của Outchinnikov [48] Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào

ung thư ở ngay nồng độ thấp

Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928

Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành "một loại thuốc thần kỳ" Năm 1945, A.Fleming, E Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh

Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene' Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [31]

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới

Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn

-14- Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh

Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces

fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại

các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15]

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces

sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47]

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần

để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41]

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN,

kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những

đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS

-15-

1.3.2 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [6]

Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều

có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh

là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [5]

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau

- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền

-16-

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

1.3.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

* Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 300C, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C [20]

* pH môi trường

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường

pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [24],[46]

* Độ thông khí

Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy)[21] Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan oxy Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men [8]

* Tuổi giống

Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10% [14]

-17-

1.3.3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng [5],[26],[29]

* Nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS

* Nguồn nitơ

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS[27] Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

* Nguồn photphat vô cơ

Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS

* Các yếu tố vi lượng

-18- Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

* Hình thức lên men

Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí

1.4 MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT

1.4.1 Một số bệnh hại chè do nấm

1.4.1.1 Bệnh phồng lá chè

Bệnh được phát hiện năm 1868 ở Ấn Độ, nhưng đến năm 1895 Masse mới

nghiên cứu phát hiện nguyên nhân gây bệnh Bệnh do nấm Esobasidium

vexans Mase gây ra [1],[4]

Bệnh phát sinh ở lá non, cành non, vết bệnh phần lớn ở mép lá Đầu tiên trên lá xuất hiện những chấm nhỏ hình giọt dầu màu vàng nhạt Sau đó vết bệnh lớn dần, màu nhạt dần Phía dưới vệt bệnh (mặt dưới lá) phồng lên và mặt trên lõm xuống, phía lồi có hạt phấn màu trắng, có giới hạn rõ rệt với phần

lá khoẻ Cành bị nấm hại sẽ bị chết [50]

Đám bào tử (Basidiospore) của nấm bệnh có hình gậy, phía đỉnh phân nhánh, mỗi nhánh đính một bào tử có hình bầu dục hoặc hình thận không màu Lúc đầu bào tử là đơn bào, về sau ở giữa có vách ngăn tạo thành hai bào tử Bào tử rất dễ rụng

-19- Dưới điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnh là tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9 đến tháng

10 Nhiệt độ thích hợp là 15 200

C

1.4.1.2 Bệnh đốm nâu

Bệnh đốm nâu (còn gọi là khô lá

chè hình bánh xe) là bệnh hại lá thường

thấy ở các nương chè Việt Nam Bệnh

phát sinh vào tháng 5, 6 mưa nhiều và

bệnh phát sinh mạnh nhất vào tháng 8,

9 Bệnh nặng có thể làm khô lá và rụng

sớm Tác nhân gây bệnh là do nấm

Colletotrichum camelliae Masse [1],[4]

Bệnh đốm nâu chủ yếu hại lá già, cành và quả Trên lá vết bệnh bắt đầu

từ mép lá, màu nâu, không có hình dáng nhất định hoặc hình bán nguyệt Trên vết bệnh có các đường tròn đồng tâm, ở giữa vết bệnh lá bị khô, màu xám tro đen lan dần theo hình gợn sóng bánh xe Trên cành cũng có triệu trứng như vậy, bộ phận bị bệnh có thể bị rách (vỡ) ra [50]

Bào tử nấm tồn tại trên vết bệnh và lá bệnh, thậm chí cả khi lá rơi xuống đất Năm sau, khi nhiệt độ tăng lên, bào tử phát tán nhờ gió mưa truyền đến các lá chè và sau lây nhiễm 5 18 ngày thì xuất hiện vết bệnh Bệnh ưa nóng ẩm nên thường phát sinh vào tháng 7, 8 Sau mưa liên tục

10 15 ngày bệnh phát triển rất nặng

Ở vùng đất thấp có mực nước ngầm cao, thoát nước không tốt, phân bón không đủ đều tạo điều kiện cho bệnh phát sinh Trong quá trình chăm sóc chè bị xây xát nhiều, ánh sáng quá mạnh hoặc khi gặp mưa, bệnh phát sinh càng nặng, giống chè lá to bệnh dễ phát sinh mạnh

-20-

1.4.1.3 Bệnh đốm trắng

Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng có ở mọi vùng chè, phát sinh trên vườn chè mới trồng, gây hại ở lá non và cành non Mùa mưa bệnh phát sinh mạnh

nhất Tác nhân gây bệnh là do nấm Phyllosticta theafolia Hara [4]

Lúc đầu vết bệnh còn nhỏ, hình tròn, màu nâu phần giữa lõm xuống có màu trắng sáng, xung quanh có màu lông sẫm Đường kính vết bệnh 0,5 1,5

mm Thời kỳ sau, nhiều vết nhỏ liên kết với nhau tạo thành vết lớn không có hình dạng nhất định, cuống lá bị bệnh dễ làm cho lá rụng Bệnh có thể phát sinh ở tất cả cành non Mặt trên vết bệnh có những vết nhỏ màu đen Bệnh đốm trắng có những nốt mốc và có những vết nhỏ hình mũi kim

Sợi nấm hoặc bào tử tồn tại trong lá bị rụng hoặc ở cành cây để qua đông Mùa xuân bào tử phát tán và xâm nhập vào các cành non và lá bánh tẻ Nhiệt độ từ 18 250C rất thích hợp cho sự phát sinh của bệnh Mùa xuân và mùa thu, mưa nhiều là điều kiện cho sự phát sinh mạnh Trên các giống chè

lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh

chè còi cọc Tác nhân gây bệnh là do

nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4]

Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm,

lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá Bệnh thường bắt đầu

từ mép lá và làm cho lá rụng Vết bệnh có hình gợn sóng, trên vết bệnh có các hình vân đen Lá thường bị rụng khi bệnh lan khắp lá hoặc 1/2 lá

-21- Những điểm nhỏ trên lá là bào tử phân sinh đính trên cuống ngắn và đính bào tử Bào tử có 3 ngăn, đầu nhỏ có cuống, đầu lớn có 3 lông, bào tử màu nâu xẫm

1.4.1.5 Bệnh thối búp chè

Bệnh thối búp chè thường thấy ở

các nước trồng chè của vùng Châu Á

Bệnh này được phát hiện ở Phú Hộ từ

năm 1961 - 1962 trên những nương chè

tăng sản và lấy hom giống Tác nhân gây

bệnh là do nấm Colletotrichum theae

Petch [4]

Bệnh thường xuất hiện ở lá non, cuống lá và cành non Vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim có màu đen, sau đó lan dần ra hết cả búp và cành chè Sau

8 10 ngày vết bệnh có thể dài tới 15 20 mm Khi thời tiết nóng ẩm lá dễ

bị rụng Trong vườn ươm thường hay bị nặng hơn ở nương chè hái búp Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng Nhiệt độ

270C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh Bào tử nấm lan truyền nhờ mưa gió Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn

1.4.2 Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật

* Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu tình hình sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học

-22-

rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có

thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có

thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất

Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể

hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc

ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là

quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ

nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh Xạ khuẩn chống nấm ngoài

việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym

phân giải Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực

vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ [14]

* Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây

bệnh thực vật

Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số

biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện

pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một

số bệnh mà trước đây ít gặp Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng

chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại

Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh

do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt

côn trùng và cỏ dại kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất So với thuốc

hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân

hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường,

còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học CKS và dịch lên

men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt

nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất

của cây và khử trùng đất [15]

-23- Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến

rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ Ở

Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu

sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống

bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có

khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh

này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium

oxysporum, F solani [15]

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ

thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng

xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum

gây bệnh thối rễ ở thực vật [2] Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực

bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen

dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

Ngoài ra, giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều

kiện sản xuất của người nông dân Do đó cần có sự phối hợp thống nhất trong

việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền

thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn

trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh

tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người [14]

-24-

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

- KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

- KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini

- Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.1.2.3 Các công thức môi trường

Môi trường phân lập và giữ giống nấm

*Môi trường CZ (Czapek - Dox - Agar) (g/l)

NaNO3 - 2; KH2PO4 - 1; MgSO4 7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01;

Thạch - 20; H2O - 1lít

*Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l)

Khoai tây miếng - 200; Thạch - 18; đường - 20, H2O 1lít; pH 7 - 1,4

Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

* Môi trường Gause - I (g/l)

Tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 7H2O - 0,5; NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 - 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; Thạch - 18 g; H2O - 1lit; pH 7 - 7,4

* Môi trường Gause - II (g/l)

Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCl - 5; glucoza - 10; Thạch - 18g; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4

-26- Trypton - 5, cao nấm men - 3; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2

* Môi trường ISP -2 (g/l)

Cao nấm men - 3; Cao malt - 10; Dextrose - 4; Thạch - 20; Nước cất - 1lit;

pH 7 - 7,2

* Môi trường ISP - 3 (g/l)

Bột kiều mạch - 20; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH - 7,2

* Môi trường ISP - 4 (g/l)

Tinh bột tan - 10; K2HPO4 - 1,0; MgSO4 7H2O - 1,0; NaCl - 1,0; (NH4)2SO4 - 2; CaCO3 - 2; dung dịch khoáng - 1ml; thạch - 18g; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2

* Môi trường ISP - 5 (g/l)

Asparagin - 1; Glixerin - 10; K2HPO4 - 1; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,0 - 7,4

* Môi trường ISP - 6 (g/l)

Peptone - 10; cao nấm men - 1; xitrat sắt - 0,5; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2

* Môi trường ISP - 7 (g/l)

Glycerol - 15; L - tyrosine - 0,5; L - asparagine - 1; FeSO4.7H2O - 0,01; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 7H2O - 0,5; Nacl - 0,5; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,2 - 7,4

* Môi trường ISP - 9 (g/l)

(NH4)2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65; MgSO4 - 1; dung dịch muối B - 1ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; H2O - 1lít; pH 6,8 - 7

- Dung dịch muối A (%): FeSO4 - 0,1; ZnSO4 - 0,15; MnCl2 - 0,1; Nước cất - 100ml

- Dung dịch muối B (%): CuSO4 - 0,64; FeSO4 - 0,11; MgCl2 - 0,79; nước cất - 100ml

* Môi trường 79 (g/l)

-27- Glucoza -10; peptone -10; cazein thủy phân - 2; cao nấm men - 2; NaCl - 6,

K2HPO4 - 0,2; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4

* Môi trường A4 - H (g/l)

Glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7

* Môi trường A - 4 (g/l)

Glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7

* Môi trường Tinh bột (g/l)

Tinh bột - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,5; KNO3 - 1; NaCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 30,0; Nước - 1 lít; pH 7,2 - 7,4

* Môi trường Czapek Glycerin (g/l)

Glycerin - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít

* Môi trường Czapek Gluco (g/l)

Gluco - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè

Chọn các mẫu chè có triệu chứng điển hình, mới Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước,cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng Dùng dao mổ

vô trùng cắt các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần

mô bệnh và mô khỏe) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trường Czapek trên đĩa petri Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh Để đĩa môi trường đã đặt mẫu trong tủ ấm 300C Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi

-28-

CZ Thu nhận giống thuần khiết trong ống thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở 40C [14]

2.2.2 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3 10-6 Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt

độ phòng từ 4 - 7 ngày Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I để làm sạch Sau đó nuôi ở nhiệt

độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause - I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]

Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X) [16],[19], [42]

2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh

Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển Xạ khuẩn)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 4 hoặc Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định Sau đó để vào tủ lạnh 4 - 5h cho CKS khuếch tán vào môi trường thạch sau đó để vào tủ ấm VSV kiểm định nuôi ở 28 -

300C, đọc kết quả sau vài ngày [7]