Nghiên cứu chế độ thủy phân đầu, xương cá chẽm bằng sự kết hợp enzyme Alcalase và Flavourzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THANH TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN ĐẦU, XƯƠNG CÁ CHẼM BẰNG SỰ KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THANH TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN ĐẦU, XƯƠNG CÁ CHẼM BẰNG SỰ KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZYME

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD: TS NGUYỄN THỊ MỸ HƯƠNG

Nha Trang, tháng 6 năm 2013

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trung tâm thí nghiệm thực hành đã giúp tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn TS Nguyễn Thị Mỹ Hương đã hết lòng chỉ bảo và hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi và đôn đốc quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu và Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và bảo vệ đồ án tốt nghiệp

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi đã quan tâm, chia sẻ khó khăn

và động viên để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thanh Tuấn

MỤC LỤC

Trang

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 2

1.1.TỔNG QUAN VỀ CÁ CHẼM 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân bố và thành phần hóa học của cá Chẽm 2

1.1.2 Tình hình khai thác, nuôi trồng và chế biến cá Chẽm 5

1.1.3 Nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá Chẽm và các hướng tận dụng nguyên liệu còn lại này 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 10

1.2.1 Enzyme Protease 10

1.2.2.Một số enzyme protease thương mại 11

1.2.3.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein 12

1.2.4 Các dạng sản phẩm thủy phân 14

1.2.5 Ứng dụng của các sản phẩm thủy phân protein 15

1.3.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC VỀ SỰ THỦY PHÂN PROTEIN BẰNG ENZYME 15

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Nguyên liệu đầu, xương cá Chẽm 23

2.1.2 Enzyme 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Xác định thành phần hóa học của đầu xương cá Chẽm 24

2.2.2 Quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ đầu xương cá Chẽm 24

2.2.3.Thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu xương cá Chẽm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀTHẢO LUẬN 39

3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ĐẦU XƯƠNG CÁ CHẼM 39

3.2 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN ĐẦU VÀ XƯƠNG CÁ CHẼM BẰNG ENZYME ALCALASE VÀ ENZYME FLAVOURZYME 39

3.2.1 Kết quả xác định tỷ lệ enzyme Alcalase đến thích hợp 39

3.2.2 Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Alcalase 42

3.2.3 Kết quả xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Alcalase 44

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme đến quá trình thủy phân đầu và xương cá Chẽm 46

3.2.5 Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme 48

3.2.6 Kết quả xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme 51

3.3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất 53

3.3.2 Thuyết minh sơ đồ quy trình sản xuất 55

3.4.2 kết quả đánh giá chất lượng của sản phẩm thủy phân theo quy trình đề

xuất 57

3.4.3 Kết quả đánh giá chất lượng bột đạm thủy phân 59

3.4.4 Kết quả xác định thành phần acid amin của sản phẩm bột protein được sản xuất theo quy trình đề xuất 60

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 62

1 KẾT LUẬN 62

2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Chẽm 4

Bảng 1.2 Thành phần axít amin không thay thế của cá Chẽm nguyên con và 5

các cơ quan chính (g/100g protein) 5

Bảng 1.3 Sản lượng cá Chẽm nuôi trồng trên thế giới 2003-2011 ( đơn vị :tấn) 6

Bảng 1.4 Giá trị kinh tế của ngành nuôi trồng cá Chẽm thế giới (nghìn USD) (FAO fishery statistic) 6

Bảng 1.5 Sản lượng cá Chẽm đánh bắt trên thế giới 2003-2011 (đơn vị: tấn) (FAO fishery statistic) 7

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu và xương cá Chẽm 39

Bảng 3.2 Các sản phẩm thu được từ quá trình thủy phân và hiệu suất thu hồi sản phẩm……… 58

Bảng 3.3 Chất lượng cảm quan của dịch đạm thủy phân 58

Bảng 3.4 Thành phần hóa học của sản phẩm dịch đạm thủy phân 58

Bảng 3.5 Chất lượng cảm quan của sản phẩm bột thủy phân protein 59

Bảng 3.6 Thành phần hóa học của sản phẩm bột thủy phân protein 60

Bảng 3.7 Thành phần acid amin của bột nêm được sản xuất theo quy trình đề xuất .61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cá Chẽm 2

Hình 1.2 Sản lượng cá Chẽm nuôi trồng trên thế giới (FAO fishery statistic) 5

Hình 1.3 Sản lượng cá Chẽm đánh bắt trên thế giới (FAO fishery statistic) 7

Hình 2.2 Sơ đồ xác định thành phần hóa học của đầu cá Chẽm 24

Hình 2.3 Qui trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ đầu, xương cá Chẽm 25

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp 28

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp 30

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp 32

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme thích hợp 34

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho enzyme Flavourzyme 36

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho enzyme Flavourzyme 38

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hiệu suất thu hồi Nitơ 40

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm lượng Nitơ acid amin 40

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase hàm lượng Nitơ amoniac 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Alcalase đến hiệu suất thu hồi Nitơ 42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Alcalase đến hàm lượng Nitơ acid amin 43

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Alcalase đến hàm lượng Nitơ amoniac 43

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Alcalase đến hiệu suất thu hồi Nitơ 44

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Alcalase đến đến hàm lượng Nitơ acid amin 45

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Alcalase đến đến hàm lượng Nitơ amoniac 45

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme đến hiệu suất thu hồi Nitơ 46 Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme đến hàm lượng Nitơ acid

amin 47

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme hàm lượng Nitơ amoniac 47

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Flavourzyme đến hiệu suất thu hồi Nitơ 49

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Flavourzyme đến hàm lượng Nitơ acid amin 49

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân của enzyme Flavourzyme đến hàm lượng Nitơ amoniac 50

Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Flavourzyme đến hiệu suất thu hồi Nitơ 51

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Flavourzyme đến đến hàm lượng Nitơ acid amin 51

Hình 3.18 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme Flavourzyme đến đến hàm lượng Nitơ amoniac 52

Hình 3.19 Sơ đồ quy trình sản xuất bột protein từ đầu, xương cá chẽm 54

Hình 3.20 Dầu cá chẽm thu được……….58

Hình 3.21 Bột khoáng……… ……….58

Hình 3.22 Bột protein không tan……… ………58

Hình 3.23 Bột thủy phân protein… ………58

Hình 3.24 Dịch thủy phân từ đầu, xương cá Chẽm 58

Hình 3.25 Bột protein từ đầu, xương cá Chẽm 59

gN/l: gam nitơ trên lít

FAO: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc VASEP: Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam

MỞ ĐẦU Hiện nay, ngành chế biến thủy sản của nước ta đang phát triển rất mạnh.

Trong 4 tháng đầu năm, tổng sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 1.563 nghìn tấn, trong đó sản lượng khai thác đạt 875 nghìn tấn, sản lượng nuôi trồng 688 nghìn tấn [34]

Bên cạnh đó, công nghệ thủy phân bằng enzyme cũng ngày càng phát triển

và nguồn nguyên liệu còn lại tạo ra từ ngành chế biến thủy sản rất nhiều, chiếm một

tỷ lệ khá cao và còn mang lại giá trị kinh tế lớn Phế liệu tạo ra từ ngành chế biến thủy sản có thể tận thu, khai thác chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế như: sản xuất chitin, chitosan từ vỏ tôm, sản xuất bột cá, bột đạm, dịch đạm dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi và tạo ra các sản phẩm thực phẩm cần thiết cho con người

Hàng năm, lượng nguyên liệu còn lại này không được xử lý còn gây ra ô nhiễm môi trường trầm trọng

Với mục đích làm tăng giá trị kinh tế cho nguyên liệu còn lại từ đầu và xương cá chẽm và góp phần bảo vệ môi trường, dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Thị Mỹ Hương, tôi thực hiện đề tài:” NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN ĐẦU XƯƠNG CÁ CHẼM BẰNG SỰ KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZYME”

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ CÁ CHẼM

1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân bố và thành phần hóa học của cá Chẽm

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Tên tiếng Anh: Seabass , Barramundi, Giant seaperch[15]

Tên khoa học: Lates calcarifer

Theo FAO (1974) cá Chẽm có hệ thống phân loại như sau:

có hình quạt Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên Chiều

dài thân bằng 2,7 – 3,6 lần chiều cao Chiều dài lớn nhất 47cm, thông thường là 19 – 25cm Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, nâu vàng khi sống trong môi trường nước ngọt Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng

Cá Chẽm là loài cá phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương và có tính di cư xuôi dòng, cá lớn lên chủ yếu ở vùng nước ngọt như sông, hồ Khi thành thục (từ 3 đến 4 năm tuổi) chúng sẽ

di cư ra vùng cửa sông, vùng ven biển có độ mặn thích hợp để sinh sản Ấu trùng sau khi nở ra sẽ được sóng đưa vào vùng cửa sông, vùng ven bờ và lớn lên Cá con

sẽ dần di cư vào các thủy vực nước ngọt sinh sống và phát triển thành các cá thể trưởng thành

Ở nước ta, chúng phân bố chủ yếu tại vùng vịnh Bắc bộ, vùng biển miền Trung và số ít ở vùng biển miền Nam, mùa vụ khai thác là quanh năm Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu khai thác tự nhiên chiếm số lượng thấp, chủ yếu là nguyên liệu thông qua nuôi trồng (tập trung nhiều ở các tỉnh ven biển miền trung, hình thức nuôi

là trong các ao đất và lồng lưới) Khi cá đạt từ 10 đến 12 tháng tuổi là khai thác được, lúc này trọng lượng mỗi con từ 800 – 1,2 kg và kích thước từ 350 đến 500

mm

Trên thế giới, Cá Chẽm phân bố chủ yếu ở một số nước như: NewGuinea, Indonesia, Malaysia, Philippines, Đông Châu Phi, Vịnh Percian, Ấn Độ, Srilanca, Myanmar, Australia[12]

1.1.1.3 Thành phần hóa học của cá Chẽm

Thành phần hóa học cơ bản của cơ thịt cá Chẽm gồm có: nước, protein, lipid, gluxit, khoáng chất, vitamin Thành phần hóa học của cá thường khác nhau theo giống loài nhưng trong cùng một loài mà ở môi trường sống khác nhau thì thành phần hóa học cũng khác nhau Thành phần hóa học của cá còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, mùa vụ, thức ăn, thời tiết Sự khác nhau về thành phần thức ăn làm ảnh hưởng rất lớn đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của cá Thành phần hóa học của cá Chẽm được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Chẽm

Cá Chẽm chắc thịt, ít béo, giàu omega 3 và protein, có các axít amin cân đối

và một lượng khoáng hợp lý Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng rất cần thiết cho sự phát triển của con người Với giá trị dinh dưỡng rất cao và sản lượng khai thác cao, nên giá trị về mặt kinh tế của cá Chẽm cũng rất cao Thịt cá Chẽm chứa đủ các acid amin và quan trọng hơn cả là trong thịt có đủ các axít amin không thay thế như bảng sau:

Thành phần dinh dưỡng trong 100g thực phẩm ăn được

Năng

lượng Nước Protein Lipid Tro Calci Phospho Sắt Natri Kali A B1 B2 PP

111 75,5 20,5 3,2 1,2 26 202 0,4 56 329 15 0,1 0,16 2,1

Bảng 1.2 Thành phần axít amin không thay thế của cá Chẽm nguyên con và

các cơ quan chính (g/100g protein)

Một số loài cá Chẽm nuôi hiện nay: cá Chẽm Châu Âu, cá Chẽm Nhật Bản,

cá Chẽm Chile và cá Chẽm Châu Á…Trong đó, cá Chẽm Châu Á được nuôi phổ biến Các nước nuôi cá Chẽm Châu Á là Philippin, Singapore, Oxtraylia, Malaixia, Đài Loan, Indonesia … Nuôi trong lồng đang được phát triển ở nhiều nước như Thái Lan, Indonesia, Philippin, Singapore Thành công trong việc sản xuất cá Chẽm nhân tạo, cung cấp con giống từ nguồn này sẽ lớn mạnh trong tương lai Sản lượng nuôi trồng cá Chẽm được thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 1.2 Sản lượng cá Chẽm nuôi trồng trên thế giới (FAO fishery statistic)[36]

Bảng 1.3 Sản lượng cá Chẽm nuôi trồng trên thế giới 2003-2011 ( đơn vị :tấn)

(FAO fishery statistic)[36]

Ở Thái Lan, phần lớn cá Chẽm bán trên thị trường là cá nuôi lồng hoặc nuôi

ao Thái Lan cũng là quốc gia đầu tiên sản xuất cá Chẽm giống và có truyền thống lâu đời về lĩnh vực này Tuy nhiên, nhiều nước khác ở châu Á cũng có bờ biển để nuôi thương mại loài cá này nhưng nhìn chung hoạt động nuôi trong suốt thập niên qua vẫn phát triển chậm do thiếu nguồn cá giống và chưa tạo được uy tín cao về mặt hàng này

Ở Inđônêxia, công ty PTFEGA MAIRKULTURA đã thành công trong việc nuôi cá Chẽm Châu Á trong lồng nuôi ở vùng biển khơi Hiện nay công ty có 25-30 lồng nuôi đặt trong vùng biển đang hoàn toàn nguyên sơ có diện tích 2.300 ha của Inđônêxia, cách Jakarta khoảng 40 hải lý Sản lượng năm 2010 dự kiến đạt 1.000 tấn và tăng lên 5.000 tấn năm 2011[37]

Cá Chẽm được nhiều nước trên thế giới nhập khẩu như Trung Quốc, Mỹ, Anh Trong đó Singapore là nước nhập khẩu thực phẩm cá biển lớn trong khu vực Châu á tới 1000 tấn hằng năm

Cá Chẽm được đánh giá là loại cá có giá trị kinh tế cao theo FAO:

Bảng 1.4 Giá trị kinh tế của ngành nuôi trồng cá Chẽm thế giới (nghìn USD)

(FAO fishery statistic) [36]

Năm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Sản

lượng

28698 28888 31388 32524 34801 43586 49173 67095 69116

Năm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Giá trị 96826 74375 84045 100673 117027 159081 165964 276339 310646

Theo tổ chức nông lương thếgiới (FAO), sản lượng cá Chẽm thương phẩm hàng năm của thế giới đạt gần 130 nghìn tấn, trong đó sản lượng của Thái Lan và các nước châu Á khác chiếm hơn 90%

Sản lượng đánh bắt cá Chẽm cũng được FAO thống kê như sau:

Hình 1.3.Sản lượng cá Chẽm đánh bắt trên thế giới (FAO fishery statistic) [36] Bảng 1.5 Sản lượng cá Chẽm đánh bắt trên thế giới 2003-2011 (đơn vị: tấn)

(FAO fishery statistic) [36]

Hiện nay do nguồn khai thác cá Chẽm từ biển và đại dương khá khan hiếm nên nguyên liệu cá Chẽm được cung cấp cho thị trường chủ yếu là từ nguồn nuôi thông qua các hộ nuôi Ở khu vực Đông Nam Á,Thái Lan đi đầu trong việc nghiên cứu tạo giống cũng như nuôi cá Chẽm, cung cấp cho thị trường nội địa và xuất khẩu một lượng lớn giống và cá Chẽm thương phẩm

1.1.2.2 Trong nước

Ở nước ta, cá Chẽm được xem là giống cá mới và có tiềm năng lớn trong tương lai Chúng ta đã sản xuất thành công cá Chẽm giống và đang nghiên cứu sâu hơn về loài này Trong hoàn cảnh cá tra và cá basa đã có khuynh hướng bão hòa, nguyên liệu tôm đang gặp nhiều khó khăn do dịch bệnh tràn lan và khó kiểm soát về

dư lượng kháng sinh thì nguyên liệu cá Chẽm được xem là một trong những mặt

Năm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Sản

lượng

70705 60645 72235 85640 95269 81119 90823 102066 94782

hàng đem lại hiệu quả kinh tế cao Mặt khác, việc nuôi cá Chẽm cũng ít làm ô nhiễm môi trường nước do chúng là loài ăn tạp và ít phát sinh dịch bệnh Vì vậy, nhiều hộ dân ở các tỉnh miền trung đã chuyển đổi mô hình nuôi cá tra, cá basa, tôm,

cá khác sang nuôi cá Chẽm và bước đầu đem lại lợi nhuận lớn

Hiện nay, cá Chẽm được nuôi trong ao đầm nước lợ, nuôi lồng hoặc nuôi quảng canh Năm 2001, tổng số lồng nuôi trên biển là 23.989 lồng, nhiều hơn năm

2000 là 5.244 lồng, trong đó số lồng nuôi cá biển là 4.077 lồng Sản lượng nuôi lồng bè nước mặn năm 2001 đạt 2.635 tấn, cao hơn năm 2000 là 853 tấn, trong đó sản lượng cá biển là 1.898 tấn Năm 2004, diện tích nuôi cá biển trong ao là 1.750

ha và số lồng cá Chẽm trên 8.850 chiếc đạt sản lượng 7.675 tấn Ngoài ra tại các đầm nước lợ ven biển cá đã được thả nuôi ghép với đối tượng khác nhau Sản lượng

cá nuôi nước lợ mặn đạt 13.865 tấn Kết quả này còn hạn chế, một trong những nguyên nhân chủ yếu là do chưa chủ động được nguồn cá giống[3]

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất giống cá biển từ những năm 1993 –

1994 Đến năm 2005, chúng ta cơ bản chủ động sản xuất giống một số loài cá biển trong đó có cá Chẽm Trong năm 2003 – 2004, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II và Trường Đại học Nha Trang đã sản xuất 400.000 con giống cá Chẽm

Dự án nuôi cá Chẽm của công ty cổ phần Vĩnh Hoàn được khởi động vào cuối năm 2010, và sẽ mở rộng diện tích ao nuôi lên 300 ha vào năm 2012 Dự kiến, sản lượng cá chẽm của Vĩnh Hoàn trong năm 2012 là 700 tấn và 6100 tấn vào năm 2013[38]

Hiện nay ở Sóc Trăng cũng đã tiến hành nuôi thí điểm cá Chẽm công nghiệp đạt 70 tấn cá/ ha

Vì vậy, để phát triển các loài cá nuôi mới phù hợp với chế biến công nghiệp

và tiềm năng thị trường, Chương trình xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 của Bộ NN&PTNT có đề xuất phát triển nhanh việc nuôi cá Chẽm quy mô công nghiệp, nhằm đưa con cá này trở thành một trong các sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu chủ chốt, kim ngạch xuất khẩu đạt từ 300-500 triệu USD vào năm 2015

1.1.3 Nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá Chẽm và các hướng tận dụng nguyên liệu còn lại này

Nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến này là: đầu, xương, vây, mỡ, nội tạng, rẻo cá… Trước đây, người ta chủ yếu tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại này làm thức ăn tự chế cho thủy sản Vì vậy, với sự phát triển của công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản thì công nghệ xử lý và tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại này ngày càng phát triển Bởi lẽ, từ sự phát triển của ngành chế biến thủy sản đã tạo ra một nguồn nguyên liệu còn lại dồi dào cả về sản lượng và chủng loại Đó chính là động lực thúc đẩy công nghệ xử lý lượng nguyên liệu còn lại này phát triển theo Vì thế, hiện nay đã có nhiều hướng tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại này để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, gồm có:

 Sản xuất bột cá, dầu cá

Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản, công nghệ sản xuất bột cá chăn nuôi ngày càng phát triển Bởi lẽ, từ công nghệ chế biến thủy sản tạo ra lượng nguyên liệu còn lại khá dồi dào, sản lượng cá tạp ngày càng tăng cao, chiếm 2/3 tổng sản lượng chung Các nước phát triển công nghiệp đòi hỏi tiêu thụ một lượng lớn về bột cá chăn nuôi Việc sản xuất bột cá chăn nuôi có ý nghĩa kinh tế rất lớn, bởi vì công nghệ này đã tận dụng được nguồn nguyên liệu còn lại và nguyên liệu thủy sản kém giá trị để tạo nên sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp lượng đạm dễ tiêu hóa cho động vật nhằm phát triển chăn nuôi cung cấp trứng, sữa, thịt cho con người[8]

Từ các loại nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá như: gan cá, nội tạng, đầu cá…có thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất dầu cá Thông thường quá trình tách chiết dầu cá gắn liền với công nghệ sản xuất bột cá Bởi lẽ, cần phải tách triệt để dầu cá ra khỏi nguyên liệu trước khi sản xuất bột cá để chất lượng bột cá tốt hơn[8]

 Sản xuất bột đạm thủy phân

Sản phẩm thủy phân có thể được sản xuất từ đầu, xương, nội tạng cá[6,7] Bột đạm thủy phân thu được chứa nhiều đạm dễ tiêu hóa, các vitamin, các nguyên

tố khoáng đa lượng, vi lượng và các chất hoạt động sinh học khác

 Sản xuất nước mắm

Từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá (đầu cá…), người ta đem thủy phân bằng enzyme Hỗn hợp sau thủy phân đem lọc thu được dịch thủy phân chứa nhiều axít amin Dịch thủy phân này được sử dụng để sản xuất nước mắm

 Ngoài ra, một số nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá như da cá có thể tận dụng để sản xuất gelatin và collagen, xương cá có thể sản xuất bột khoáng [14], vảy cá để sản xuất guanine và chân châu, tụy tạng cá để sản xuất insulin,

Hiện nay, ngành chế biến thủy sản trong nước phát triển khá mạnh mẽ nhưng công nghệ xử lý và tận dụng lượng nguyên liệu còn lại này thực sự chưa phát triển

và chưa được quan tâm đúng mức.Các sản phẩm sản xuất từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến thủy sản còn ít, chưa đa dạng, chất lượng chưa cao Vì vậy, các nhà chế biến thực phẩm thủy sản cần tìm giải pháp để nâng cao giá trị sử dụng nguồn nguyên liệu còn lại này, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế trong chế biến thủy sản, đồng thời giảm thiểu lượng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến thải

là carboxylpeptidase còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi là aminopeptidases[19]

Các endoprotease và exoprotease kể trên cộng tác một cách rất có hiệu quả trong việc phân giải protein Có thể nói rằng, chức năng chính của endoprotease tạo

ra một lượng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động[33]

Tuy nhiên, tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của axít amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hưởng mạnh đến hoạt động của các enzyme Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao.Ví dụ, trypsin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa lysine và argininine, Chymotrypsin chỉ thủy phân những liên kết peptid giữa tyrosine, phenylalanine, tryptophan Thậm chí chymosin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa Phe105-Met106 của kappa-casein [19]

Hiện nay, có rất nhiều loại protease đã được phát hiện và chúng được chia thành 4 nhóm cơ bản: serine protease (EC 3.4.21), cysteine protease (EC3.4.22), aspartic protease (EC 3.4.23), và metalloprotease (EC 3.4.24)

1.2.2.Một số enzyme protease thương mại

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại protease, một số loại protease được sử dụng phổ biến hiện nay là: Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex…

Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và exoprotease

(aminopeptidase), được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc axít yếu Điều kiện hoạt động tối ưu của Flavourzyme 500L là pH = 5,0–7,0, nhiệt độ khoảng

500C Flavourzyme 500L có hoạt tính 500 LAPU/g Flavourzyme có thể bị ức chế hoạt động ở 90°C trong 10 phút hoặc 120°C trong 5 giây Đây là một trong những enzyme khi thủy phân protein thu được dịch đạm vị không đắng so với các loại enzyme thủy phân như Neutrase, Alcalase hay Protamex (Nilsang, 2005)[26]

Neutrase là endoprotease được chiết từ vi khuẩn được sử dụng để thủy phân

protein Enzyme này chỉ cắt protein ở mức độ vừa phải hoặc tạo thành các đoạn peptid Điều kiện hoạt động tốt của Neutrase 0,8L là pH = 5,5–7,5 ở nhiệt độ 45–

550C Neutrase 0,8 L có hoạt tính 0,8 AU/g và bị ức chế khi pH <4 (Kamnerdpetch, 2007)[22]

Alcalase 2,4 L (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) là protease của

Bacillus licheniformis với hoạt tính endopeptidase Alcalase là enzyme thương mại thuộc nhóm serine protease subtilisin A Hoạt tính của Alcalase 2,4L là 2,4 AU/g, bị

ức chế ở pH thấp, điều kiện hoạt động tốt nhất của Alcalase là pH = 8, nhiệt độ 50 – 600C (Liaset, 2002)[21]

Protamex là protease của Bacillus(Bagsvaerd, Denmark) Enzyme này có

hoạt tính endoprotease Điều kiện hoạt động tối ưu của protamex trong khoảng pH

= 5,5–7,5 ở nhiệt độ 35–60 °C Protamex có hoạt tính 1,5 AU/g Enzyme này cũng

bị bất hoạt ở 850C trong 10 phút và ở pH thấp (Liaset, 2002)[21]

1.2.3.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein

Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố[9,11],

cụ thể là:

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ enzyme phản ứng thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể, thậm chí không tăng

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền với nhiệt, chúng chỉ có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng biến tính Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng thủy phân do enzyme xúc tác được đặc trưng bằng hệ số:

Q10 = Kt+10 /Kt

Với Kt: Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ: t Kt+10: Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ :t + 100C

Người ta đã xác định được hệ số Q10 của các loại enzyme trong cơ thể cá trong khoảng từ 2 – 3, cá biệt có thể lên đến 7 như phản ứng Hemoglobin trong máu

cá

Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có nhiệt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ thích hợp của enzyme, trong đó có một giá trị nhiệt độ mà ở đó, tốc độ enzyme đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Với đa số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp trong khoảng 40 - 500C Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, đa số enzyme có nhiệt độ tới hạn khoảng 700C, với các enzyme bền nhiệt (bromelin, papin…), nhiệt độ tới hạn có thể cao hơn Nhiệt độ thích hợp với một enzyme có sự thay đổi khi có sự thay đổi về pH, nồng độ cơ chất…

- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian phản ứng thích hợp giúp enzyme cắt mạch triệt để làm cho cơ chất bị thủy phân hoàn toàn hơn Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra các sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scatol…và việc kéo dài thời gian thủy phân sẽ làm giảm hiệu quả kinh tế Ngược lai nếu thời gian thủy phân ngắn thì quá trình thủy phân chưa triệt để các axít amin tạo thành còn ít trong khi các peptit còn tồn tại nhiều trong sản phẩm như vậy sẽ gây lãng phí nguyên liệu và khó khăn cho quá trình lọc để thu dịch thủy phân protein

- Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme vì

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein enzyme Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9 Với nhiều protease, pH thích hợp ở vùng trung tính nhưng cũng có một số protease có pH trong vùng axít (pepsin, protease axít của vi sinh vật…) hoặc nằm trong vùng kiềm ( tripsin, subtilin…) Với từng enzyme, giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt

độ, loại cơ chất … thay đổi

- Ảnh hưởng của lượng nước: Nước vừa là môi trường phân tán enzyme và

cơ chất lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc

độ và chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme

- Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Diện tích tiếp xúc lớn tức là enzyme và

cơ chất có điều kiện gặp nhau tốt hơn, như vậy sẽ thuận lợi cho phản ứng thủy phân

nó sẽ làm cho phản ứng thủy phân diễn ra nhanh hơn

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng thủy phân, khi càng tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt đến giới hạn v = vmax nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng thủy phân hầu như không tăng

- Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm:Chất kiềm hãm (hay chất ức chế) là những chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy khi sử dụng enzyme ta phải biết rõ các chất kiềm hãm của nó để điều chỉnh phản ứng

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất khi có mặt trong phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ Tuy nhiên các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ xác định Khi dùng quá nồng

độ cho phép, hoạt độ enzyme sẽ giảm

Bột đạm thủy phân có hàm lượng protein cao, rất có giá trị dinh dưỡng Bột đạm thủy phân có màu trắng ngà, vàng nhạt hay nâu tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu Mùi thơm đặc trưng, khi cho vào nước dễ tan

1.2.5 Ứng dụng của các sản phẩm thủy phân protein

Dịch đạm thủy phân và bột đạm thủy phân có thể được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản Sản phẩm với hàm lượng protein cao, gồm hỗn hợp các axít amin cần thiết cho sự phát triển của tôm,

cá Khi phối trộn sản phẩm vào viên thức ăn thì thức ăn dễ tiêu hóa Bột đạm thủy phân cũng có thể được dùng trong thực phẩm sản xuất các sản phẩm bột dinh dưỡng cao đạm đối với bột đạm thủy phân có chất lượng cao Dịch đạm cô đặc còn có thể

sử dụng để bổ sung trong quá trình làm nước mắm do nó có hàm lượng axít amin cao, làm tăng độ đạm của nước mắm Dịch đạm thủy phân có thể dùng trong sản xuất nước mắm công nghiệp hoặc được sử dụng để sản xuất bột nêm

1.3.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC VỀ

SỰ THỦY PHÂN PROTEIN BẰNG ENZYME

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, sản phẩm thủy phân đã biết đến từ khá lâu và đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu công bố về việc sử dụng enzyme để thủy phân nguyên liệu còn lại của các nguyên liệu thủy sản để sản xuất ra các sản phẩm thủy phân, ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chăn nuôi, thực phẩm

Guerard và cộng sự(2001) đã nghiên cứu về thủy phân bao tử cá ngừ bằng enzyme Alcalase với các thông số sau: nhiệt độ 500C, pH = 8, thời gian 5,5 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm này dùng làm chất bổ sung nitơ cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật có kết quả tốt như những pepton công nghiệp dùng nuôi cấy vi sinh vật[16]

Herpandi và cộng sự(2012) đã nghiên cứu độ thủy phân và lượng axít amin trytophan tự do của sản phẩm thủy phân cá ngừ bằng các loại protease khác nhau Sản phẩm thủy phân protein thịt cá ngừ vằn được sản xuất bằng các loại protease (Alcalase, Protamex, Neutrase và Flavourzyme) trong thời gian 60, 120, 180 và 240

phút với tỷ lệ enzyme protease là 0,5, 1, 1,5 và 2% so với khối lượng của nguyên liệu Kết quả cho thấy thời gian dài với tỷ lệ enzyme cao đã làm tăng độ thủy phân Alcalase độ thủy phân cao nhất trong số tất cả các protease, tiếp theo là Protamex, Flavourzyme và Neutrase[17]

Ho và cộng sự(2009) đã nghiên cứu dịch thủy phân cá thu làm chất dẫn dụ khả năng bắt mồi cho cá hồi trắng Cá thu được xay nhỏ sau đó thủy phân với Alcalase hoặc Flavourzyme, nồng độ enzyme/protein là 3%, thời gian thủy phân 1

và 4 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy các sản phẩm thủy phân sau 1 và 4 giờ có hàm lượng peptid và các axít amin khác nhau Mẫu thủy phân bằng Flavourzyme có hàm lượng axít amin tự do cao hơn mẫu dùng Alcalase Mẫu 4 giờ có hàm lượng axít amin tự do cao hơn mẫu 1 giờ Khi sử dụng dịch thủy phân cá thu bổ sung vào thức ăn tỷ lệ 2% dùng làm chất dinh dưỡng thì tỷ lệ tăng trưởng của cá tăng, hệ số chuyển đổi thức ăn giảm[18]

Liaset và cộng sự(2002) đã nghiên cứu thu hồi nitơ từ xương cá hồi Atlantic

từ quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex Xương cá hồi được xay nhỏ và thủy phân với điều kiện tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1,16 : 1, tỷ lệ enzyme/cơ chất là 90AU Kg-1, pH là 6,5 và nhiệt độ nghiên cứu từ 350C đến 700C Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thủy phân ở chế độ đó thì hiệu suất thu hồi nitơ tăng theo nhiệt độ, đạt cao nhất tại 500C với53,5% và nhiệt độ càng tăng thì hiệu suất thu hồi nitơ lại giảm[20]

Lian và cộng sự(2005) nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme Flavourzyme và Protamex Kết quả nghiên cứu cho thấy với nhiệt độ 500C, thời gian thủy phân 6 giờ thì hàm lượng axít amin tự do của sản phẩm thủy phân đạt cao nhất 24,8% so với mẫu đối chứng 8,2%[21]

Luan và Li-jiao (2009) đã nghiên cứu công nghệ thủy phân thịt sò bằng sự kết hợp các loại enzyme proteaza Giai đoạn đầu thịt sò được thủy phân bằng sự kết hợp giữa proteaza trung tính và trypsin, giai đoạn sau được thủy phân bằng Flavourzyme Kết quả cho thấy tỷ lệ kết hợp tối ưu của protease trung tính và trypsin là 3:1 và các điều kiện thủy phân tối ưu của Flavourzyme như sau: nồng độ

enzyme 1000U/g nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân 550C, thời gian 5 giờ và pH=5 Với điều kiện này độ thủy phân là 55,97%[22]

Motamedzadegan và cộng sự(2010) đã nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng Thunnus albacares bằng enzyme Neutrase Kết quả chỉ ra rằng khi sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng Thunnus albacares thì các thông số tối ưu là nồng độ enzyme 37 AU / kg protein,

pH tự nhiên của bản thân nguyên liệu, nhiệt độ từ 50°C, và thời gian 60 phút thì độ thủy phân (DH) đạt 35%, sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein cao 74,56% và hàm lượng lipid thấp 1,86% và được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và làm thức

ăn cho chăn nuôi[23]

Nilsang và cộng sự(2004), nghiên cứu sử dụng hai loại enzyme protease là Flavourzyme 1000L và Kojizyme 800L bổ sung để thủy phân dịch thải từ qui trình

cá ngừ đóng hộp để thu dịch đạm Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu khi

sử dụng Flavourzyme là ở nhiệt độ 450C, nồng độ enzyme là 50 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w), pH tự nhiên = 5,9 – 6,0, thời gian thủy phân sau

6 giờ thì DH đạt 62% Với Kojizyme 800L, điều kiện tối ưu là ở nhiệt độ 500C, nồng độ enzyme là 40LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w), pH tự nhiên = 5,9 – 6,0, thời gian thủy phân sau 6 giờ thì độ thủy phân đạt 68%[24]

Nguyen và cộng sự (2011) đã nghiên cứu sự thủy phân phế liệu từ cá ngừ bằng enzyme Protamex và đặc tính sinh hóa của sản phẩm thủy phân Một chế độ thủy phân được thực hiện cho các phế liệu từ cá ngừ như đầu, nội tạng, đuôi ở nhiệt

độ 450C, tỷ lệ nước/nguyên liệu = 1/1, tỷ lệ enzyme 0,1%, pH tự nhiên, thời gian 12h Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, độ thủy phân của đầu, nội tạng và đuôi lần lượt là 32,3%, 16,8% và 22,2% Hiệu suất thu hồi nitơ trong các sản phẩm thủy phân từ đầu, nội tạng và đuôi lần lượt là 73,6%, 82,7%, 85,8%[25]

Ovissipour và cộng sự(2009) đã nghiên cứu tối ưu hóa sự thủy phân phế liệu

cá tầm bằng enzyme Alcalase Kết quả nghiên cứu đã xác định được các điều kiện tối ưu là: 50°C, 120 phút Chế độ thủy phân này cho sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein tương đối cao (66,43%) và lipid thấp (1,34%)[26]

Ovissipour và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares sử dụng enzyme Alcalase và Protamex Đầu cá ngừ vây vàng thu được từ quá trình sản xuất cá ngừ đóng hộp được thủy phân với các thông số sau: nồng độ enzyme sử dụng là 1,5%, pH tự nhiên, tỷ lệ nguyên liệu/nước (w / v) là 1:1 Kết quả cho thấy theo thời gian thủy phân thì độ thủy phân càng cao Độ thủy phân, hàm lượng protein và axít amin trong sản phẩm thủy phân thu được khi sử dụng enzyme Alcalase cao hơn so với enzyme Protamex[27]

Slizyté và cộng sự (2005) khi nghiên cứu quá trình thủy phân nội tạng cá Tuyết bằng enzyme Neutrase với tỷ lệ 0,3%, thời gian thủy phân 1h, ở nhiệt độ

500C thì thu được bột protein thủy phân có hàm lượng ẩm 3,9%; protein thô 83,5%; lipid 3,0%; tro 12,4%[28]

Sathivel và cộng sự(2005) nghiên cứu thủy phân đầu cá hồi đỏ bằng các loại enzyme thương mại như Alcalase, Flavourzyme 500L, Palatase 2000L và Neutrase

Họ đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại enzyme khác nhau và thời gian thủy phân khác nhau (25, 50, 75 phút) đến tính chất chức năng và giá trịdinh dưỡng của sản phẩm thủy phân đầu cá hồi đỏ[29]

Sylla và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân phế liệu cá bơn Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của 4 tỷ lệ nước khác nhau (10%, 25%, 50% và 100% so với nguyên liệu) đến quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex được so sánh Quá trình thủy phân được thực hiện ở pH = 6, nhiệt

độ 400C, thời gian thủy phân là 6giờ[30]

Sathivel và cộng tác viên (2005) khi thủy phân đầu cá hồi bằng enzyme Alcalase (0,5%) ở nhiệt độ 500C, trong thời gian 75 phút thì thu được bột protein thuỷ phân có rất nhiều các thành phần axít amin trong đó hàm lượng Isoleucine (3,71g/100g protein), Phenylalanine (4,07g/100g protein), hàm lượng Leucine (6,69g/100g protein),và Lysine (7,39g/100g protein) Tổng số acid amin là 98,74 g/100g protein[31]

Vanessa và cộng sự(2012) đã nghiên cứu về tối ưu hóa sự thủy phân thịt vẹm

bằng enzyme Thịt vẹm đã được thủy phân bằng cách sử dụng Protamex Các điều kiện tối ưu cho sự thủy phân thịt vẹm là pH = 6,85, nhiệt độ 510C,và tỷ lệ enzyme

so với nguyên liệu là 4,5% Dưới những điều kiện này độ thủy phân là 26,5% và hiệu suất thu hồi protein 65%[34]

Yang Xiu – min và cộng sự(2011) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất bột nêm từ sản phẩm thủy phân điệp Với điều kiện thủy phân sò điệp được xác định như sau: Flavourzyme với liều lượng 1200AU/g nguyên liệu và tỷ lệ nguyên liệu /nước là 1:4 (g / ml) trong thời gian thủy phân 5 giờ ở nhiệt độ 450C Dịch đạm thủy phân thu được đem phối trộn với muối, đường và bột ngột ở tỷ lệ thích hợp sau

đó tối ưu hóa chế độ sấy phun bằng phương phương pháp bề mặt đáp ứng, thiết kế thí nghiệm theo Box – Benken Sản phẩm bột nêm thu được có hàm lượng protein thô là 82,89%, chất béo là 1,55%, đường tổng số 6,82% và sản phẩm có độ ẩm 4,09%[35]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cũng được biết đến nhiều trong những năm gần đây

Và cho đến nay đã có các công trình nghiên cứu sau:

Vũ Ngọc Bội (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng enzyme protease từ B.subtilis S5 Chế phẩm protease kỹ thuật này có nhiệt độ thích hợp là

550C, pH thích hợp là 6,0 và có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày[1]

Huỳnh Dự(2010) đã nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá Kết quả chỉ ra rằng qua ba loại enzyme Alcalase, Protamex và Neutrase sử dụng thủy phân phế liệu mực thì Alcalase hiệu quả hơn so với hai loại enzyme còn lại Và điều kiện thích hợp nhất với enzyme Alcalase là nồng độ enzyme là 5% so với trọng lượng chất khô của phế liệu mực, pH = 7,6, nhiệt độ 530C, thời gian thủy phân 2 giờ[2]

Nguyễn Thị Ngọc Hoài (2012) đã nghiên cứu thu hồi và đặc trưng hóa tính chất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme Kết quả dịch thủy phân protein thu được đem cô quay ở nhiệt độ 450C, áp suất hút chân không là 50mbar, thời gian hút là 20 phút, nồng độ chất khô trong dịch thủy phân sau cô quay là

220Brix Sau đó, tiến hành sấy phun dịch cô quay ở nhiệt độ1300C, nồng độ maltodextrin bổ sung là 8%, mẫu thu được có độ ẩm là 10% , trong 1 gam bột thì hàm lượng protein hòa tan là 110,1mg[5]

Nguyễn Thị Mỹ Hương (2011) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme protease thương mại và sử dụng sản phẩm thủy phân này trong thức ăn cho tôm Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, việc

bổ sung bột protein thủy phân từ đầu cá ngừ vào trong thức ăn cho tôm đã cải thiện

sự tăng khối lượng của tôm, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng protein [6]

Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự(2011) đã nghiên cứu sử dụng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra và ứng dụng sản phẩm thủy phân trong việc sản xuất nước mắm Điều kiện tối ưu cho việc thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis như sau: nhiệt độ 500C, pH = 7,6; tỷ lệ nước 30%, nồng độ muối 2%, hoạt độ enzyme 50UI

và thời gian thủy phân là 18 giờ Sản phẩm nước mắm thu được sau khi ủ ở tỷ lệ bã chượp 20% có hàm lượng đạm formol 14,5 g/l, đạm tổng số16 g/l, đạm NH3 1,49 g/l và axít amin 12,81 g/l [10]

Đỗ Văn Ninh (2004) đã nghiên cứu thu nhận protease từ nội tạng cá và gan mực Kết quả cho thấy rằng chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực

có nhiệt độ thích hợp từ 50 -550C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong việc thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [11]

Lý Thị Minh Phương (năm 2008) đã nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân từ thịt hàu biển dùng trong thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch thủy phân thu được có hàm lượng axít amin cao, mùi thơm và đạt tiêu chuẩn vềvi sinh với loại

enzyme thủy phân thích hợp là Allzyme FD ở nồng độ enzyme so với cơ chất là 0,32%, nhiệt độ 560C, pH= 6,5, thời gian thủy phân là 8 giờ

Phạm Thị Đan Phượng (2012) với nghiên cứu thu nhận bột đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp xửlí kết hợp hai enzyme protease Kết quả nghiên cứu cho thấy chế độ thủy phân sử dụng kết hợp 2 loại enzyme protease thích hợp như sau: Giai đoạn đầu xử lí bằng Alcalase ở nhiệt độ

550C, pH tự nhiên, nồng độ Alcalase/đầu tôm là 0,2%, 2 giờ; sau đó xử lý tiếp bằng Flavourzyme: tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm là 0,1%, 1 giờ Chế phẩm protein giàu carotenoid thu được phối trộn với các thành phần gia vị khác bao gồm: bột carotenoprotein sấy khô: 41g, muối ăn: 41g , đường: 9g, mì chính: 9g để chế biến bột canh tôm với kết quả cảm quan tốt, sản phẩm bột nêm có màu đỏ gạch, mùi thơm hài hòa, có hương thơm của tôm, vị ngọt nhẹ[12]

Vũ Hồng Thiên và cộng sự (2009) đã công bố kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột canxi thực phẩm từ xương cá Tra Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Khi sử dụng phương pháp thủy phân xương cá Tra bằng phương pháp hóa học sử dụng NaOH, thì điều kiện tối ưu cho quá trình là nhiệt độ 800C, thời gian 90 phút, tỷ lệ NaOH:nguyên liệu là 1:1 và nồng độ NaOH dùng để thủy phân là 2% Trong khi đó, đối với phương pháp enzyme thì điều kiện thích hợp là: nhiệt độ 550C, tỷ lệ enzyme/cơ chất 5:10 trong thời gian 48 giờ Sản phẩm bột xương thu được từ cả hai phương pháp đều được đánh giá tốt về mặt cảm quan Tuy nhiên, để sản phẩm có thể được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, đặc biệt dùng làm chất bổ sung canxi cho thực phẩm con người, cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn

về quy trình tinh chế và sản xuất bột xương, đồng thời giá trị sinh học canxi của bột xương cũng cần được nghiên cứu nhằm xác định rõ giá trị, chất lượng của sản phẩm, từ đó xác định giới hạn khả năng ứng dụng của sản phẩm thu được[14]

Trần Cảnh Đình và cộng sự - Viện Nghiên cứu Hải sản (2010) đã nghiên cứu chế độ thủy phân đầu tôm bằng enzyme Neutraza, enzym Papain và enzym Bromelain thô (chiết xuất từ đọt dứa) và enzym nội tại có trong phế liệu đầu tôm kết quả nghiên cứu cho thấy Sử dụng enzyme Neutraza (một loại enzyme protease

có sẵn trên thị trường) thủy phân phế liệu tôm là rất hiệu quả trong quy trình công nghệ sản xuất dịch hương tôm dùng cho các sản phẩm mô phỏng giả tôm, mì tôm hay làm nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi Điều kiện thủy phân thích hợp của enzyme Neutraza đối với đầu tôm là ở nhiệt độ 55oC, trong thời gian 2h, tỷ lệ E/ S

là 1.5ml/ 100ml Khi kết hợp giữa E.Neutraza và E Nội tại trong đầu tôm thì điều kiện thủy phân thích hợp là nhiệt độ 500C, trong thời gian 2h và tỷ lệ E/S là 1ml/100ml, tỷ lệ E/S được giảm đi 0.5ml/100ml Điều này có ý nghĩa về mặt kinh tế

và phù hợp với việc sản xuất thức ăn chăn nuôi

ThS Nguyễn Thị Hương Thảo (2012) đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ

enzyme trong sản xuất collagen từ da cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Qua

phân tích, nhóm nhiên cứu nhận thấy, với 50% hàm lượng chất khô là collagen trong tổng cộng 69% protein thì da cá tra rất phù hợp để sản xuất collagen Kết quả

xử lý nguyên liệu cho thấy da cá tra được loại béo chất lượng bằng NaOH 0,4% tỷ

lệ 1:10 (w/v) trong 48 giờ ở 500C Hiệu suất tách chiết collagen từ da cá bằng nước

ở 400C đạt 91,20%, sau khi da được trương nở trong acid acetic 0,5 M với tỷ lệ da: dung dịch là 1: 3 trong thời gian 97 phút ở 500C Sử dụng enzym Corolaza 7089 ở nhiệt độ 550C, pH 8 thủy phân dịch chiết trong 240 phút sẽ thu được sản phẩm collagen Sản phẩm cuối dạng bột có màu trắng ngà, pH trung tính, hàm lượng protein cao trên 90%, hàm lượng tro dưới 2%, hàm lượng béo thấp thích hợp sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm, thực phẩm

Như vậy, đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu liên quan đến việc tận dụng các nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến để sản xuất ra các sản phẩm thủy phân protein Tuy nhiên, việc thủy phân nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá Chẽm ở các nhà máy chế biến chưa được đầu tư nghiên cứu Vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng đầu xương cá Chẽm để sản xuất dịch đạm thủy phân là rất cần thiết

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu đầu, xương cá Chẽm

Đầu xương cá Chẽm được mua tại Xí Nghiệp Khai Thác và Dịch Vụ Thủy Sản Khánh Hòa Đầu và xương cá đã được cấp đông sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ chế biến, Đại học Nha Trang Tại đây, đầu cá Chẽm được rã đông, xay nhỏ bằng máy xay, sau đó được bao gói hút chân không Các túi nguyên liệu được làm đông bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ-200C cho đến khi sử dụng

2.1.2 Enzyme

2.1.2.1 Enzyme Flavourzyme

Enzyme Flavourzyme được sản xuất bởi công ty Novozyme Chế phẩm

enzyme Flavourzyme 500 MG thu được từ Aspergillus oryzae, Flavourzyme có cả

hoạt tính của endoprotease và exopeptidase

Điều kiện hoạt động tối ưu:

Enzyme Alcalase được sản xuất bởi công ty Novozyme Chế phẩm Enzyme

Alcalase 500 ML thu được từ protease của Bacillus licheniformis với hoạt tính

endopeptidase Alcalase là enzyme thương mại thuộc nhóm serine protease subtilisin A

- pH = 8

- Nhiệt độ 50 – 600C

Đầu xương Cá Chẽm

Xay nhỏ

Xác định các thành phần sinh hóa: Nước, protein, lipid

và tro

Kết quả và thảo luận

Enzyme này có thể bị bất hoạt ở 850C trong vòng 5 phút hoặc 1200C trong vòng 5 giây

- Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho enzyme này từ 0 ÷100C

Đây là hai sản phẩm enzyme được FAO/WHO, JECFA và FCC công bố đạt tiêu chuẩn dùng cho thực phẩm Sản phẩm này đã được công bố chất lượng với BYT Việt Nam số16536/2005/YT-CNTC

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định thành phần hóa học của đầu xương cá Chẽm

Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu đầu xương cá Chẽm được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.2 Sơ đồ xác định thành phần hóa học của đầu cá Chẽm

2.2.2 Quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ đầu xương cá Chẽm

Dựa trên sự tham khảo của một số công trình nghiên cứu về sự thủy phân nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến bằng enzyme[7,17] Có quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân đầu cá Chẽm được đề xuất như sau:

Hình 2.3 Qui trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ đầu, xương cá Chẽm

Lipid

Đầu xương cá Chẽm xay nhỏ

Thủy phân bằng enzyme Alcalase

Thủy phân bằng Flavourzyme

Thuyết minh quy trình:

Đầu, xương cá Chẽm mua về loại bỏ mang, nội tạng sau đó đem rửa sạch và

đã xay nhỏ, được thủy phân bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ nước/nguyên liệu và tỷ

lệ enzyme/nguyên liệu nhất định Quá trình thuỷ phân được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian nhất định, pH tự nhiên của bản thân nguyên liệu Nhiệt độ được duy trì ổn định nhờ bể ổn nhiệt Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân thì ức chế hoạt động của enzyme ở 90°C trong 15 phút

Sau đó tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme tỷ lệ enzyme/nguyên liệu nhất định Quá trình thuỷ phân được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian nhất định, pH tự nhiên của bản thân nguyên liệu Nhiệt độ được duy trì ổn định nhờ bể

ổn nhiệt Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân thì ức chế hoạt động của enzyme ở 90°C trong 15 phút

Hỗn hợp sau khi thủy phân được cho qua rây để tách riêng phần rắn (xương) và dịch lọc Phần dịch đem ly tâm bằng máy ly tâm lạnh với tốc độ 3600 vòng/phút, ở nhiệt độ thường Sau khi ly tâm có dầu cá ở trên cùng, dịch đạm thủy phân có màu hơi vàng ở giữa và cặn ly tâm ở đáy Tách riêng dịch đạm thủy phân rồi đem đi bảo quản đông ở nhiệt độ -180C

2.2.3.Thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu xương cá Chẽm bằng enzyme Alcalase và Flavourzyme

Các thông số nghiên cứu cho quá trình thủy phân là tỷ lệ E/NL, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân Để lựa chọn các thông số thích hợp dựa trên các chỉ tiêu đánh giá hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ acid amin và nitơ amoniac

2.2.3.1 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu (E/NL) thích hợp

Mục đích thí nghiệm:

Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp để thủy phân đầu xương cá Chẽm

thu được sản phẩm thủy phân có hiệu suất thu hồi nitơ và nitơ acid amin cao

Cách tiến hành:

Đầu, xương cá Chẽm đã xay nhỏ đông lạnh, được rã đông rồi cho vào 5 cốc thủy tinh 250 ml mỗi cốc 100g nguyên liệu Tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định sau: tỷ lệ N/NL là 1:1 (tức 100ml nước), nhiệt độ thủy phân 50°C,

pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ, tỷ lệ E/NL ở mẫu từ 1 đến 5 lần lượt là 0,1%;0,3%; 0,5%; 0,7% và 0,9% Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong 15 phút

Sau đó để nhiệt độ hạ xuống 500C rồi tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme với các thông số sau: nhiệt độ thủy phân 50°C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ, tỷ lệ E/NL là 0,3% Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong 15 phút Sau đó dùng rây để tách riêng phần xương

và dịch lọc

Phần dịch lọc đem ly tâm, thu được ba phần là lipid, dịch thủy phân, cặn ly tâm Dịch thủy phân được đem đi xác định hiệu suất thu hồi nitơ hàm lượng nitơ acid amin và hàm lượng nitơ amoniac.Từ đó, làm cơ sở để lựa chọn tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu thích hợp

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp

Nguyên liệu đã nghiền nhỏ đông lạnh (100g)

Thủy phân bằng enzyme alcalase(N/NL là1:1, nhiệt độ

500C, pH tự nhiên, thời gian 2 giờ), tỷ lệ E/NL:

Rã đông

Mẫu 1

(0,1%)

Mẫu 3 (0,5%)

Mẫu 5 (0,9%)

Mẫu 2 (0,3%)

Mẫu 4 (0,7%)

Lọc

Xác định Nitơ acid amin, Nitơ amoniac và

hiệu suất thu hồi Nitơ

Thủy phân bằng Flavourzyme , nhiệt độ 500C, pH

tự nhiên, thời gian 2 giờ), tỷ lệ E/NL: 0,3%

Bất hoạt enzyme

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp

Mục đích thí nghiệm:

Xác định được nhiệt độ thủy phân thích hợp để thủy phân đầu xương cá Chẽm thu được sản phẩm thủy phân có hiệu suất thu hồi nitơ và nitơ acid amin cao Cách tiến hành:

Đầu và xương cá Chẽm đã xay nhỏ đông lạnh, được rã đông rồi cho vào 5 cốc thủy tinh 250 ml mỗi cốc 100g nguyên liệu Tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định sau: tỷ lệ N/NL là 1:1 (tức 100ml nước), tỷ lệ E/NL thích hợp đã xác định ở trên, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 4 giờ, nhiệt độ thủy phân của mẫu

từ 1 đến 5 lần lượt là 400C, 450C , 500C, 550C và 600C Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong 15 phút

Sau đó tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme với các thông số sau: nhiệt độ thủy phân 50°C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ, tỷ lệ E/NL là 0,3% Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong

15 phút Sau đó dùng rây để tách riêng phần xương và dịch lọc

Phần dịch lọc đem ly tâm, thu được ba phần là lipid, dịch thủy phân, cặn ly tâm Dịch thủy phân được đem đi xác định hiệu suất thu hồi nitơ hàm lượng nitơ acid amin và hàm lượng nitơ amoniac.Từ đó, làm cơ sở để lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp so với nguyên liệu

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp

Nguyên liệu đã nghiền nhỏ đông lạnh (100g)

Thủy phân bằng enzyme alcalase(N/NL là1:1, pH tự nhiên, thời

gian 2 giờ), tỷ lệ E/NL: thích hợp, nhiệt độ thủy phân:

Rã đông

Mẫu 1

(400C)

Mẫu 3 (500C )

Mẫu 5 (600C )

Mẫu 2 (450C )

Mẫu 4 (550C )

Lọc

Xác định Nitơ acid amin, Nitơ amoniac và hiệu

suất thu hồi Nitơ

Dịch thủy phân

Li tâm

Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp

đối với Alcalase

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp

Mục đích thí nghiệm:

Xác định được thời gian thủy phân thích hợp để thủy phân đầu xương cá Chẽm thu được sản phẩm thủy phân có nitơ acid amin và hiệu suất thu hồi nitơ cao Cách tiến hành:

Đầu xương cá Chẽm đã xay nhỏ đông lạnh, được rã đông rồi cho vào 5 cốc thủy tinh 250ml mỗi cốc 100g nguyên liệu Tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định sau: tỷ lệ N/NL là 1:1 (tức 100ml nước), tỷ lệ E/NL và nhiệt độ thích hợp đã xác định ở trên, pH tự nhiên, thời gian thủy phân ở mẫu 1 đến 5 lần lượt là 1h, 2h, 3h, 4h, 5h Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong 15 phút

Sau đó hạ nhiệt độ xuống 500C rồi tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme với các thông số sau: nhiệt độ thủy phân 50°C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ, tỷ lệ E/NL là 0,3% Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 90°C trong 15 phút Sau đó dùng rây để tách riêng phần xương

và dịch lọc

Phần dịch lọc đem ly tâm, thu được ba phần là lipid, dịch thủy phân, cặn ly tâm Dịch thủy phân được đem đi xác định hàm lượng nitơ acid amin, hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac.Từ đó, làm cơ sở để lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp đối với Alcalase