Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng các hợp chất ô nhiễm cơ brôm (PBDEs) trong mẫu cá sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS

Nghiên cứu gần đây được thực hiện tại trung tâm CETASD sử dụng phương pháp chiết thẩm thấu qua gel GPC và thiết bị phân tích GC-MS cho thấy dư lượng các hợp chất PBDEs có thể được tìm th

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

CN Nguyễn Hoàng Mai

sv Nguyễn Thị Hồng (K52A-Hóa học)

Đ A I H O C Q U Ò C <v- - A NỤI

TRUNG TẨM THÔNG 1IN THƯ VIẺN

00060000 / 10 /;

Mục lục

Báo cáo tóm tắt 2

Danh mục các bảng 6

Danh mục các hình 7

1 Mở đầu 8

2 Tổng quan 9

2.2 Hàm lượng các hợp chẩt cơ brôm 11

2.3 Chuẩn bị mẫu 12

2.3.1 Chiết 13

2.3.2 Làm sạch dịch chiết i 7 2.4 Phương pháp phân tích 18

3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Nội dung nghiên cứ u 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 19

3.2.2 Phạm vi nghiên cứu 20

3.2.3 Chuẩn bị mẫu 21

3.2.4 Phương pháp phătt tích 24

3.2.5 Phương pháp đánh g iá 26

3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm 27

4 Kết quả và thảo luận 27

4.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 27

4.2 Khảo sát loại dung môi chiết mẫu cá 28

4.3 Khảo sát dung môi chiết với pha nước 30

4.4 Khảo sát hiệu suất thu hồi chất phân tích khi rửa axit H 2 SO 4 31

4.5 Tối ưu hóa thể tích dung môi rửa giải ra khỏi cột chiết pha rắn 44% H 2 S 0 4 -Silica/LC-S I " 31

4.6 Hiệu suẩt thu hồi trên nền mẫu thật 33

4.7 Kích thước và hàm lượng mỡ các mẫu c á 33

4.8 Hàm lượng các PBDE trong các mẫu cá lấy tại các địa điểm nghiên cứu 34

5 Kết luận 34

6 Tài liệu tham khảo 35

PHỤ LỤC 37

5

Danh mục các bảng

Bảng 2.1 Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu sinh h ọc 12

Bảng 2.2 Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu lỏng 14

Bảng 3.1 Thông tin về các mẫu c á 20

Bảng 3.3 Chương trình nhiệt độ của thiết bị sắc k ý 23

Bảng 3.4 Thời gian lưu và chế độ quan sát ion chọn lọc đối với các PBDE 23

Bảng 4.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị (n = 5 ) 27

Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexan và axeton nitrin 27

Bảng 4.3 Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết với pha nước là n-hexan và hỗn họp n-hexan : etyl axetat (3:2) 28

Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi các chất phân tích sau khi rửa axit sulíủric đặc (n = 3 ) 29

Bảng 4.5 Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs trên nền mẫu cá (thêm chuẩn 5 ng/g) 31

Bảng 4.6 Hàm lượng mỡ các mẫu c á 32

Bảng 4.7 Hiệu suất thu hồi PCB 209 (%) và hàm lượng PBDEs (ng/g thịt) trong mẫu c á 33

Danh mục các hình

Hình 2.1 Tỷ lệ phần trăm và tổng lượng tiêu thụ TBBPA (2002), HBCDD (2001) và

DecaBDE (2001) tại Mỹ, EU và châu Á 8

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của PBDEs (n + m = 1 -ỉ-10) 9

Hình 3.1 Mầu cá rô phi thu thập tại sông Tô Lịch 20

Hình 3.2 Hệ chiết pha rắn SPE với cột 44% sulfiưic acid impregnated silicagel 21

Hình 3.3 Quy trình phân tích PBDEs toong mẫu c á 22

Hình 3.4 Sắc đồ (SIM) của PBDEs trên thiết bị GCMS-QP2010 24

Hình 4.1 Hiệu suất thu hồi chất phân tích sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexane và acetonitrile 28

Hình 4.2 Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexan và hỗn hợp n-hexan : etyl axetat (3:2) 29

Hình 4.3 Hiệu suất thu hồi các chất phân tích sau khi rừa axit (n = 3 ) 30

Hình 4.4 Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs qua cột silicagel 44% H2SO4 31

Hình 4.5 Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs trên nền mẫu cá (thêm chuẩn 5 ng/g) 32

7

và sử dụng một số các hóa chất độc hại, đặc biệt là 12 chấưnhóm chất: aldrin, chlordane, dieldrin, endrin, heptachlor, hexachlorobenzenne (HCB), mirex, toxaphene, dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), polychlorinated biphenyl (PCB), dioxin và furan Công ước cũng yêu cầu xử lý triệt để những địa điểm tàng trữ thuốc BVTV và hoá chất độc hại có chứa POP Tại phiên họp ngày 8 tháng 5 năm 2009 tại Geneva, 9 loại chất/nhóm chất mới đã được hơn 160 Chính phủ các nước thống nhất đưa bổ sung vào danh sách các hóa chất độc hại theo Công ước Stockholm, nâng tổng số chấưnhóm chất POP lên thành 21 Các đồng loại thuộc nhóm các hợp chất polybtominited diphenyl ete, viết tắt là PBDEs, bao gồm: hexabromodiphenyl ether và heptabromodiphenyl ether, tetrabromodiphenyl ether và pentabromodiphenyl ether, nằm trong số 9 nhóm chất/hợp chất mới này

Các kết quả khảo sát thực tế cho thấy tình trạng ô nhiễm môi trường do các hợp chất POP gây ra là đáng báo động ở Việt Nam Tuy nhiên số liệu quan trắc các hợp chất PBDEs còn rất hạn chế; nguyên nhân là do đây là các hợp chất độc mới được quan tâm trên thế giới và do điều kiện phân tích ở Việt Nam chưa sẵn sàng cho việc phân tích các hợp chất này Nghiên cứu gần đây được thực hiện tại trung tâm CETASD sử dụng phương pháp chiết thẩm thấu qua gel (GPC) và thiết bị phân tích GC-MS cho thấy dư lượng các hợp chất PBDEs có thể được tìm thấy trong cá biển (0,58 - 2,4 ng/g lipid) và trong trầm tích cửa biển (0,05 - 0,15 ng/g trọng lượng ướt) [1] Giống như nhiều phương pháp đã được phát triển tại các phòng thí nghiệm trên thế giới, phương pháp phân tích được sử dụng trong nghiên cứu này còn tương đối phức tạp, đòi hỏi nhiều thời gian và thiết bị tách chiết đắt tiền (thiết bị GPC) và không thông dụng ở Việt Nam.

Với mục đích nghiên cứu đề suất một quy trình phân tích hiệu quả hơn, phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam trong việc phân tích các hợp chất PBDEs, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn, khảo sát, tối ưu hóa quy trình phân tích 11 đồng loại PBDEs trong mẫu cá sử dụng hệ chiết pha rắn SPE và thiết bị phân tích GC-MS với độ chính xác và độ tin cậy cao Kỹ thuật chiết SPE giúp rút ngắn thời gian làm sạch mẫu, tiết kiệm chi phí Phương pháp sau đó đã được áp dụng để phân tích và đánh giá sơ bộ hàm lượng các hợp chất PBDEs trong một số mẫu cá thu thập tại sông Tô Lịch và ao hồ cạnh khu xử lý chất thài điện tử.

2 Tổng quan

2.1 Thông tín chung về các hợp chất PBDEs

Các hợp chất chống cháy được ứng dụng chủ yếu trong các sản phẩm nhựa sử dụng trong các thiết bị điện dân dụng nhu vô tuyến, máy tính, linh kiện ôtô, bảng mạch điện, dây cáp, các sản phẩm polyme, sơn, vải, với mục đích làm tăng tính chống cháy của của các vật liệu Có nhiều loại chất chống cháy khác nhau: các chất vô cơ, các este hữu cơ của phốt phát có chứa hoặc không chứa các hợp chất halogen, các hợp chất hữu cơ cơ clo hoặc cơ brôm [2-4] Các chất chống cháy được chia thành hai loại, tùy thuộc vào mục đích sử dụng khác nhau: chất chống cháy ngăn phản ứng gây cháy và chất chống cháy phụ gia Chất chống cháy ngăn phản ứng gây cháy được gắn vào các polyme bằng liên kết cộng hóa trị nên hầu như không thể bị đào thải ra môi trường trừ trường hợp các sàn phẩm chứa chúng bị phân hủy hoặc bị đốt Tuy nhiên các chất chống cháy phụ gia thường được trộn hoặc hòa tan vào các vật liệu nên chủng dễ dàng tách ra từ các sản phẩm thương mại, vật liệu.

z 39 500 ton l 24 900 ton z 137 400 ton

Hình 2.1 Tỷ lệ phần trăm và tổng lượng tiêu thụ TBBPA (2002), HBCDD (2001) và DecaBDE

(2001) tại Mỹ, EƯ và châu Á

Chất chống cháy cơ brôm (BFRs) là những hợp chất đa dạng về cấu trúc hóa học, bao gồm các vòng thơm, các cyclic aliphatic, các dẫn xuất của phenol, các dẫn xuất của anhydric phthalic và aliphatic Các hợp chất BFRs thông dụng nhất là tetrabrombisphenol

A (TBBPA), polybrominated diphenylethers (PBDEs), hexabromocyclododecane (HBCD) và polybrominated biphenyls (PBBs) [3-5] Vào giữa thập niên 90 sản lượng BFRs hàng năm trên thế giới là 150.000 tấn, chiếm khoảng 30% sản lượng các chất chống cháy Khoảng 1/3 sản lượng BFRs là PBDEs, 1/3 khác là TBBPA, số còn lại là những hợp chất cơ brôm khác nhau Nhu cầu các hợp chất BFRs trên thị trường châu Âu, châu Mỹ và châu Á nãm 1999 được thống kê và biểu diễn trên hình 2.1 [6] Tổng sản lượng của 5 loại BFRs chủ yếu là trên 200.000 tấn (trong đó TBBA chiếm hơn 70%) và châu Á là điểm tiêu thụ lớn nhất (56,2%) Các hợp chất PBDEs được sử dụng như một loại phụ da chống cháy cho các sản phẩm polystyren, acrylonitrile butadiene styren, bọt polyurethan, lớp phủ sợi vải, lớp cách điện của dây điện và dây cáp, phích cám điện [3].

9

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của PBDEs (n + m = 1 - 10)

Xét trên phương diện cấu trúc hóa học (hình 2.2), PBDEs cũng gồm có 209 đồng đẳng, tương tự như hợp chất PCBs, và từng đồng đẳng riêng biệt của các hợp chất PBDEs này cũng được đánh số tương tự như PCBs Sản phẩm PBDEs thương mại chủ yếu chứa các cấu tử được thế bởi nhiều nguyên tử brôm như penta-, octa-, hoặc decabrommodiphenyl ether (PeBDE, OcBDE hoặc DeBDE) Ví dụ, sản phẩm thương mại của hỗn hợp PBDEs thường chứa ít hơn 10 đồng đẳng Tuy nhiên, PCBs kỹ thuật bán trên thị trường thường là hỗn hợp của khoảng 80 đồng đẳng.

Các hợp chất PBDEs có nhiều tính chất tương tự như PCBs và PCDDs, ví dụ chúng đều

là những chất gây ô nhiễm môi trường, bền vững trong môi trường và có khả năng tích tụ sinh học Khả năng hòa tan trong nước và áp suất bay hơi của của các hợp chất PBDEs rất thấp [3], do đó khi được giải phóng ra môi trường các hợp chất này dường như sẽ nhanh chóng hấp phụ vào trầm tích và đất Do có tính ưa mỡ cao và khó bị phân hủy, các hợp chất PBDEs cũng co khả năng tích lũy sinh học dễ dàng So sánh với PCBs, các hợp chất BFRs dễ bị phân hủy trong môi trường hơn do liên kết cacbon-brôm yếu hơn liên kết cacbon-clo Một vài hợp chất có khả năng tham gia phản ứng quang hóa dưới tác dụng của bức xạ u v [3] Ví dụ, dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, hợp chất DeBDE dễ dàng phân hủy thành các đồng đẳng cơ brôm có phân tử lượng nhỏ hơn và dễ dàng tham ra quá trình tích lũy sinh học hơn Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có số liệu nghiên cứu nào khẳng định rõ phần tỷ lệ nào của tetra- đến hexa-BDEs được tìm thấy trong môi trường là sản phẩm phân hủy của các đồng đẳng DeBDE và của hỗn hợp thương mại PeBDE.

Các họp chất BFRs không chỉ thâm nhập vào môi trường từ các nguồn thải trong quá trình sản xuất mà còn từ các sản phẩm hàng hóa trong quá trình sử dụng Khi bị gia nhiệt các hợp chất PBDEs có thể chuyển hóa thành các dioxin và íiiram cơ brôm Các hợp chất PFRs đã được tìm thấy trong rất nhiều loại mẫu khác nhau: trong không khí, trầm tích, bùn cống, mô cá, trứng chim, cá voi, cá heo, mỡ hải cẩu, sò và trầm tích, huyết thanh người, sữa và các mô tế bào Tỷ lệ thành phần các đồng đẳng trong các mẫu môi trường không giống hoàn toàn như tỷ lệ thành phần của chúng trong các sản phẩm kỹ thuật Điều này chứng tỏ đã có sự biến đổi về tỷ lệ thành phần trong môi trường, có thể là do quá trình thay thế các nguyên tử brôm bởi phản ứng quang hóa Do sự tích lũy sinh học, nồng

độ của các hợp chất này cao hơn đáng kể trong các đối tượng sinh học bậc cao hơn trong chuỗi thức ăn Ví dụ, các nhà khoa học đã ghi nhận nồng độ của các hợp chất PBDEs trong sữa người tăng liên tục trong khoảng thời gian nghiên cún từ 1972 đến 1997 ở

Thụy Điển; ngược lại hàm lượng các hợp chất cơ halogen khác như DDTs, PCBs, và PCNs lại giảm [12,13].

Mặc dù ảnh hưởng của hợp chất BFRs đến sức khỏe và môi trường chưa được xác định

rõ ràng, tuy nhiên, vào năm 1973, thông tin về mức độ tiếp xúc trực tiếp của các loại động vật sống ở cánh đồng và mức độ tiếp xúc của con người với hợp chất này thông qua chuỗi thức ăn đã gây được sự chú ý đáng kể ở Michigan [7] Độ độc cấp tính của phần lớn các hợp chất BFRs là tương đối thấp, nhưng một vài BFRs lại cho thấy nó có độ độc tương tự các hợp chất PCBs, PCDDs và ũiran [8,9] Ví dụ, số liệu đã công bố cho thấy các đồng đẳng có số nguyên tử brôm nhỏ hơn (tetra đến hexa) có thể là những hợp chất gây ung thư, chất gây rối loạn nội tiết tố và/hoặc là những chất độc ảnh hường đến sự phát triển hệ thần kinh [2,3,9] So với các hợp chất PBDEs có số nguyên tử brôm nhỏ hơn, hợp chất DeBPE, sản phẩm thương mại chính, được cho là đồng đẳng kém hoạt động hom

vì DeBPE thường được tìm thấy ở hàm lượng nhỏ hơn trong các mẫu sinh học và hấp phụ kém hom trên thành dạ dày [10,11] Nghiên cứu trên thức ăn sử dụng TeBDE đánh dấu đồng vị phóng xạ cho thấy hợp chất này hấp phụ hoàn toàn trong thức ăn, sau đó được vận chuyển và lưu dữ trong một thời gian dài trong các mô mỡ [10] Sự duy trì tính phóng xạ ở các mô mỡ chứng tỏ TeBDE đã không bị chuyển hóa đáng kể thành các hợp chất ưa nước.Tuy nhiên một vài nghiên cứu khác chỉ ra rằng PBDEs có thể bị chuyển hóa thành các hợp chất chứa nhóm hydroxyl, và như vậy các hợp chất polybrominated phenoxyphenol có thể cạnh tranh với các thyroxin trong cơ chế tạo liên kết protein transthyretin vận chuyển thyroxin [4].

2.2 Hàm lượng các hợp chất cơ brôm

PBDEs đã được tìm thấy trong không khí ở những vùng quê và các khu lân cận, trong trầm tích và sinh vật Việc tìm ra PBDEs trong tinh dịch của cá voi cho thấy các hợp chất này có thể phân bố đến cả những vùng nước sâu trong lòng đại dương [28] Một vài nghiên cứu đã chỉ ra khuynh hướng tăng lên của nồng độ BFRs trong môi trường Ví dụ, với cá voi SE Baffin, hàm lượng BDE-47 tăng 6,5 lần từ năm 1982 đến 1997 [43] Tương

tự, lượng PBDEs trong sữa người cũng tăng; tại Thuỵ Điển tăng 60 lần từ năm 1972 đến

1997 [12] Hợp chất được tìm thấy với hàm lượng lớn nhất trong sinh quyển là BDE-4 (2,2,4,4_tetrabromđiphenylete), mặc dù nó không phải là đồng đẳng chính được trong các sản phẩm [4].

Hàm lượng PFRs trong đất và trầm tích rất đa dạng theo vị trí Nghiên cứu mới đây về những mẫu core trầm tích theo thời gian (1907-1999) được lấy ở nhiều địa điểm khác nhau ờ Châu Âu cho thấy phần lớn những đồng đẳng của PBDEs đều bắt đầu xuất hiện vào nửa đầu thập niên 60 của thế kỷ trước BDE-209 xuất hiện sau đấy khoảng 1 thập kỷ [44].

11

Một vải nghiên cứu về nồng độ và sự phân bố của BFRs trong không khí cũng đã được thực hiện [44, 45] PBBEs đã được phát hiện với mật độ tập trung vào khoảng l -8pg/m3

Ở Thuỵ Điển, Sibria (Nga) nồng độ PBDEs là khoảng 1-8 pg/m3 và ở phía Tây Bắc Toritorri Canada nồng độ PBDEs vào khoảng 1-7 pg/m3 [45], nồng độ khoảng 7-53pg/m3

đã được phát hiện ở khu công nghiệp Nhật Bản, Đài Loan [45] Trong một nghiên cứu gần đây lượng PBDEs được phân bố ở vùng Great Lakes (USA) [45] Nồng độ tổng cộng của PBDEs vào khoảng 4.4-12pg/m3 và chất đồng đẳng BDE-47, 99, 100, 153 và

154 đã được tìm thấy ở tất cả các mẫu Nghiên cứu tương tự cũng chỉ ra ràng mức độ tập trung của PBDEs trong những văn phòng có máy vi tính thông thường có thể chứa BDE-

209 lên tới 80 pg/m3 và BDE-47 cũng đã được phát hiện.

PBDEs đã được nghiên cứu rộng rãi ở khu sinh vật ở Thuỵ Điển [31] Trong một vài nghiên cứu gần đây PBDEs (như BDE-46, 99, 100) trong cá được tìm thấy từ 19- 4600ng/g trọng lượng lipit, trong khi BDE-209 chỉ có trong một vài mẫu dưới dạng vết [31] Lượng BDE-47, 99, 100 ở cá là cao hơn so với trong trầm tích ( 4,6-36 lần) Nồng

độ PBDEs cao được tìm thấy trong cá chó, cá trình (17000-1 lOOOOng/g trọng lượng lipit).

Lượng PBDEs trong hải cẩu trong hai nghiên cứu gần đây ở Canada dao động từ 2,4-4,9 ng/g và 1,2-3,4 ng/g trọng lượng lipit đối với hải cẩu đực và cái [20] Tại cùng thời gian

đó, nồng độ PBDEs tìm thấy trong cá ở Canada là từ 135-545 ng/g.

Lượng BFRs ở người là tương đối thấp Tuy nhiên, lượng PBDEs ở sữa người ở Thụy Điển được tìm thấy dao động từ 72-4010 pg/g với đồng đẳng chính là PBDE-47, chiếm khoảng 60-70% tổng số PBDEs Các đồng đẳng đáng kể khác là PBDE-99, 100, 153 và

154 [12, 13] Một nghiên cứu ờ Đức cho biết lượng PBDEs ở sữa người được phát hiện dao động từ 0,6-1 lng/g chất béo [15] Nghiên cứu ở Nhật Bản cho biết PBDEs đo được trong huyết tương người trưởng thành là dưới 1 ng/g [58] Đồng đẳng chính được tìm thấy trong mô mỡ người là BDE-47, 99 và 153 và tổng PBDE là 1 ng/g trọng lượng lipit [9,14,17].

2.3 Chuẩn bị mẫu

Việc xử lý mẫu đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phân tích các hợp chất PBDEs trong mẫu môi trường vì tính chất phức tạp của nền mẫu và do các hợp chất này thường chỉ tồn tại ở hàm lượng rất thấp, lượng vết v ề cơ bản, qui trình xử lý mẫu bao gồm các bước: chiết các hợp chất PBDEs từ mẫu, dung dịch chiết sau đó được làm sạch, rửa giải theo từng phân đoạn và làm giàu trước khi đi đến bước cuối cùng là đo trên máy

ứ n g với mỗi nền mẫu (mẫu trầm tích, mẫu lỏng, .) người ta sử dụng các quy trình tách chiết mẫu khác nhau Trọng lượng mẫu phân tích thường dao động trong khoảng từ 0,5 đến 50 g.

Sau khi được chiết khỏi nền mẫu, dịch chiết thường được làm sạch và các hợp chất cần phân tích thường được rửa rải theo nhiều phân đoạn khác nhau vì phần lớn các phương pháp chiết là không chọn lọc hoàn toàn và hiệu quả tách của các kỹ thuật phân tích là không hoàn toàn hoàn hảo Các dịch chiết chắc chắn sẽ chứa các cấu tử gần giống với PBDEs và các cấu tử này thậm chí còn tồn tại ở hàm lượng cao hơn nhiều so với PBDEs Quá trình rửa rải theo nhiều phân đoạn là giống nhau cho các loại dịch chiết khác nhau.

2.3.1 Chiết

PBDEs được nghiên cứu ở trong nhiều loại mẫu mô khác nhau, trong cá, trứng chim, cá heo, mỡ hải cẩu và mỡ cá voi Thông thường, đầu tiên các mẫu này được đồng nhất, ví dụ với Na2S 04 khan Các phương pháp chiết đối với loại mẫu này được tổng kết ở bảng 2.1.

Bảng 2.1 Chiết, hấp thụ vả phân tích các mẫu sinh học Mẩu, chất

phân tích

X ử lý ban đầu

Phân tích

Tài liệu

nhất mẫu Chiết với n-hexan sử

dụng bộ chiết polytron

2 Xử lý với H2SO4 đặc

3 Cột 80 X 5mm, lg ílorisil, giải hấp với 30ml

hay GC- EI-MS

hải cẩu, cá, Đồng Chiết soxhlet với n- 1 Xử lý với H2SO4 đặc GC-NIC- [19]

Cá voi, PBDEs Đồng Chiết với n-hexan/ 1 Cột silic đa lớp (H2SO4- GC-EI- [2 1 ]

nhất với CH2 CI2 (1/1) silic/silic đã hoạt hóa/KOH- MS

khan

hải cẩu, trứng nhất mẫu với 300ml axeton/n- 2 GPC: biobeads S-X3 MS 23,

M ẩu, chất

phâo tích

X ử lý ban đầu

Phân tích

Tài liêu

chích, nhất với với 300ml aceton/n- 2 GPC: cột 2x300x7,8 mm MS

PBDEs.MeO- Na2S 04 hexan, 70/30, và 300ml i.d PL-gel, CH2Cl2/hexan

PBDEs khan n-hexan/dietylete, 90/10 (1/ 1) như là giải hấp, cất

phân đoạn 17,5-52,5 ml

3 Cô đặc

4 Cột ílorisil, lOmm i.d 8g

ílorisil, giải hấp với 75ml CH2 C12/ hexan (1/1)

chlodanes, Na2SC>4 đó với 25ml hexan 2 Cột sel silic, rửa với

3 Cột nhôm oxit, giải hấp với hexan

nhất với hỗn hợp Na2S 04

nhất với hỗn hợp Na2S 04

trộn với AlOx

SFE với C 0 2, ở 40°c và 281bar, tốc độ quay

2ml/phút đưa vào cột C18, giải hấp với 2 ml CH2C12

MS

GC-EI-[30]

PBDEs

thuốc trừ sâu hỗn hợp

Na2S0 4 trộn với

Phương pháp chiết lỏng được áp dụng đối với những mẫu đã đồng nhất từ cá và trứng chim Các hỗn hợp dung môi chủ yếu được dùng cho quá trình tách chiêt là hexan/axeton, hexan/đietylete, hexan/điclometan, hexan và điclometan [14, 31, 32, 33, 34] Dịch chiết

có thể được làm sạch thêm bằng đệm NaCl hoặc NaH2S 0 4 Các lipít chủ yếu sẽ bị phá hủy bởi axit suníìiric đặc Mấu mô cá đồng nhất có thể được chiết cùng với hexan và sau

đó là axeton [35].

Phương pháp chiết soxhlet đã được áp dụng cho các mẫu mô người và cá Dung môi chiết được sử dụng cho loại mẫu này thường giống hệ dung môi sử dụng cho đối tượng mẫu trầm tích như toluen, hexan và hỗn hợp hexan/axeton Thời gian chiết khoảng từ 4-24 giờ [16, 19, 28] Hiệu suất thu hồi của PBDEs trong cá và động vật có vú dưới biển đạt hơn hơn 70% [19].

Phương pháp chiết pha rắn (SFE) đã được sử dụng trong quá trình chiết PBDEs của mỡ

cá voi, sử dụng bẫy pha rắn C18 Mầu đã đồng hóa được trộn với ôxít nhôm như là một tác nhân giữ mỡ Thời gian chiết là 20 phút ở 40 °c và 281 bar Các chất phân tích được

bẫy bằng cách bị hấp phụ vào pha rắn C18, sau đó được giải hấp sử dụng hexan và diclometan Thời gian chiết được giải hạn trong 20 phút để giảm hàm lượng lipít bị chiết

ra khỏi mẫu vào dung môi Hiệu suất thu hồi của các chất chuẩn đồng vị đánh dấu l3C dao động trong khoảng 83-153% [35].

B àng 2.2 Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu lỏng Mấu

phân tích

tích

Tài liệu Sữa Trộn lOml sữa với lOml Nhồi hỗn hợp 1 5 g nhôm ôxit giải hấp GC-EI- [12]

người, axit fomic và 5g Iipit vào cột, rửa với với hexan, cất phân đoạn MS

Xử lý v ớ i H2SO4 đặc

Sữa Xử lý bằng xit fomic/2- Chiết với 2 lần l.C ô đặc tới 30jil Cột mao [13] người, propanol (4/1) trong bể hexan/aceton, 1/1 2 Dần xuất hóa bàng quản

15

Mẩu

Làm sạch

Phân tích

Tài liêu Huyết Xử lý với HC1 và 2- Chiết 2 lần với 1 Rửa bời KOH 0,5M GC-NCI- [38]

Máu cá, Làm biến chất bỏri HC1 và Chiết với 1 Phân đoạn bởi KOH GC-ECD [38]

PBDEs cũng đã được chiết từ sữa người cùng với một hỗn hợp chất gien poliphilic và axit íòcmic Những mẫu sữa kết hợp chặt chẽ với chất gien khi lắc mạnh mẫu này với hỗn hợp chất gian poliphilic và axit íocmic trong 2,5 giờ Hỗn hợp này được chuyển sang một ống thuỷ tinh và sau đó các tạp chất được loại bỏ khỏi hỗn hợp bằng các hỗn hợp nước và metanol, metanol/ điclometan/ hexan Hiệu suất thu hồi của PBDEs dao động trong khoảng 86-102% [12].

LLE cũng được sử dụng để xác định PBDEs trong những mẫu huyết thanh Axit hyđrôcloric và 2-propanoI được thêm vào mẫu thử sau đó PBDEs được chiết ra bởi hexan/MTBE, và pha hữu cơ được rửa bàng KCI 1% [38] LLE cũng được áp dụng cho

những mẫu nước sông và nước biển với việc sử dụng hexan làm dung dịch chiết sau khi

đã thêm vào 1 lượng nhỏ aceton [35].

2.3.2 Làm sạch dịch chiết

Dịch chiết, đặc biệt là dich chiết thu được bằng phương pháp chiết soxhlet hoặc các phương pháp chiết lỏng, thường rất bẩn để có thể phân tích ngay cho đối tượng chất phân tích là PBDEs Để xác định các hợp chất cơ brôm ở lượng vết, dịch chiết cần phải trải qua qui trình làm sạch gồm nhiều bước Một qui trình làm sạch riêng biệt là không cần thiết Thay vào đó, khi cần thiết, các bước làm sạch có thể được thực hiện trong quá trình chiết Ví dụ, mẫu thử có thể được trộn với bột đồng để loại bỏ lưu huỳnh khỏi mẫu (mẫu trầm tích), hoặc nhôm oxit được dùng để tách lipít khỏi mẫu (mẫu sinh học) Hơn nữa, dịch chiết có thể tiếp tục được làm sạch hoặc phân tách bàng việc sử dụng bẫy pha rắn [17, 39, 35].

Loại bỏ lỉpit từ sản phẩm chiết của mẫu sinh học

Sản phẩm chiết của các mẫu thử sinh học thường chứa hàm lượng lipit cao và các lipit này cần bị loại bỏ trước khi mẫu được bơm trên thiết bị GC để phân tích các PBDEs Vì nồng độ các chất cần phân tích thường liên quan đến hàm lượng lipit có trong mẫu, nên cần xác định hàm lượng lipit trong mẫu đi đôi với việc phân tích các hợp chất này.

Axit suníìiric thường được dùng để loại bỏ lipít trong mẫu; tuy nhiên phương pháp này cũng có thể phá huỷ một vài hợp chất cần phân tích Nhôm oxit sẽ ít gây ảnh hưởng đến các hợp chất cần phân tích hơn; hơn nữa chúng cũng được sử dụng để làm sach dịch chiết mẫu trầm tích, sắc ký thẩm thấu qua gien (GPC) cũng là một phương pháp được lựa trọn nhàm loại bỏ lipít ra khỏi mẫu [5, 22, 25], tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và thường được áp dụng để phân tích một số lượng mẫu đáng kể Cột ílorisil có thể được cùng sử dụng để loại bỏ một cách có lựa chọn hơn các hợp chất lipít [14].

Phân đoạn mẫu

Cột silica và cột ílorisil thường được sử dụng cùng với cột ôxít nhôm để tách dịch chiết thành các phân đoạn tương ứng với các hợp chất phân tích khác nhau, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cũng có thể được sử dụng để làm sạch mẫu và tách các phân đoạn dịch chiết.

Các bước làm sạch tương đối đơn giản đã từng được sử dụng trong một vài phương pháp phân tích các hợp chất PBDEs Khi xác định các hợp chất PBDEs trong mẫu sữa người, các đồng đẳng chính của PCBs trong dịch chiết LLE đã được tách ra bàng cách sử dụng cột silica [13] Với phương pháp tương tự, toxaphene và chlorđan đã được tách ra khỏi dich chiết là mẫu mỡ hải cẩu khi phân tích PBDEs Dịch chiết lỏng sau khi được sử lý với axit suníuric trong hexan được làm sạch trên côt silicagelusau khi PCBs đươc rửa giải

-"'A h Q C 3 U Ố C G IA HA NO '

L OOO&OOOCUOé

khỏi cột bằng hexan, hợp chất phân tích được rửa giải khỏi cột bằng hỗn hợp hexan/ete dietyl [26, 27] Với dịch chiết soxhlet từ các động vật cỏ vú, sau khi được xử lý bởi axit sunfuric DeBDE cũng được giải hấp từ cột silicagel bằng iso octan, và các hợp chất PBDEs khác được giải hấp bàng đietyl ete/iso octan [28] Tương tự, cột nhôm đã được sử dụng cho các dịch chiết soxhlet khi xác định PBDEs trong các mẫu trầm tích Hỗn hợp dịch chiết aceton/hexan được đưa qua cột nhôm và các PBDEs sau đó được rửa giải khỏi cột bằng hexan [16].

Quá trình làm sạch gồm ba bước đã được ứng dụng để phân đoạn PBDEs trong mẫu sữa sau khi được chiết bởi axeton nitrin Đầu tiên dịch chiết được làm sạch trên cột ôxit nhôm, dung dịch rửa giải hexan ở phân đoạn 2 sau đó được làm sạch tiếp trên cột silicagel và hợp chất cần phân tích được rửa giải bởi hỗ hợp điclometan/hexan sau khi cột đã được làm sạch bởi hexan [12].

Dịch chiết LLE của mẫu huyết thanh được làm sạch bởi quá trình tách phân đoạn với dung dịch KOH etanol Phân đoạn trung tính được sử lí bằng H2SO4 đặc và được dẫn qua cột silica gel/ axit sunfuric cùng với hexan [38].

2.4 Phương pháp phân tích

Phần lớn các phương pháp phân tích sử dụng cho việc xác định các hợp chất BFRs trong mẫu môi trường là cho các cấu tử có trọng lượng phân tử thấp (nhỏ hơn 800) Do các hợp chất này là hỗn hợp của nhiều đồng đẳng nên phương pháp sắc ký khí thường được sử dụng để phân tích; điều này hạn chế việc phân tích các đồng đẳng có khối lượng phân tử lớn Vấn đề khó khăn thường gặp phải khi phân tích các mẫu môi trường là nhiều hợp chất khác trong nền mẫu sẽ cùng bị rửa rải với chất phân tích gây ảnh hưởng đến quá trình định lượng Ví dụ rất nhiều các chất có mặt trong các mẫu trầm tích như: các chất

vô cơ như nguyên tố lưu huỳnh và các hydrocacbon tồn tại với hàm lượng cao hay hàm lượng cao của chất béo trong các mẫu sinh, học sẽ gây ảnh hưởng đến việc phân tích các hợp chất BFRs Sự tồn tại của các hợp chất này trong mẫu đòi hỏi phải sử dụng những thiết bị đo có độ chọn lọc cao như khối phổ sử dụng chương trình chọn lọc ion (MS/SIM) hoặc quá trình làm sạch mẫu phức tạp, hoặc thậm chí cả hai điều kiện này Nhìn chung, cần cỏ một quá trình xử lý mẫu gồm nhiều bước cho các đối tượng mẫu này.

GC là kỹ thuật phân tích thông thường để xác định các PBDEs trong các mẫu môi trường Cột nhồi đã được sử dụng trong một vài nghiên cứu ban đầu [33] Nhưng ngày nay việc phân tích các hợp chất này được thực hiện hiệu quả hơn nhiều khi sử dụng cột mao quản [40].

Phương pháp GC sử dụng để phân tích PBDEs trong các mẫu môi trường là tương tự như phương pháp được phát triển cho việc phân tích PCBs Tuy nhiên cần lưu ý là các PBDEs

chứa nhiều nguyên tử brôm hom cũng kém bền hơn so với PCBs tương ứng và do đó dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao [41].

PBDEs chủ yếu được phân tích sử dụng cột OV-1, DB-5, Ưltra-2, SPSil-8 và SE-54 [12,

13, 29, 36 , 41] Chiều dài của cột có thể từ 15-60 m Những cột ngắn thường dùng để xác định DeBDE.

MS và ECD đều có thể được sử dụng để phân tích các hợp chất PBDEs Kỹ thuật ion hoá

va chạm điện tử (EI) và ion hoá hóa học âm (NCI) thường được ứng dụng với MS để phân tích các hợp chất này Sự kết hợp giữa MS và NCI sẽ làm tăng độ nhạy phát hiện, đặc biệt với những hợp chất chứa nhiều hơn bốn nguyên tử brôm Độ nhạy của kỹ thuật NCI có thể cao hơn gấp 10 lần so với ECD [41] Metan thường được sử dụng là khí phản ứng Tuy nhiên kết quả thực nghiêm khi phân tích một vài hợp chất cho thấy bằng việc sử dụng amôni thay cho metan độ nhạy có thể tăng lên đến 80% [41] So sánh kỹ thuật EI và NCI trong sắc ký khối phổ GC-MS các nhà khoa học nhận thấy hai kỹ thuật này cho những kết quả tương đương về khả năng đáp ứng, độ nhạy và giá trị định lượng [42] Tuy nhiên, phương pháp EI mang lại tính chọn lọc cao hơn do các hợp chất PBDEs được phân tích dựa trên các ion phân tử hoặc các mảnh ion có khối lượng lớn Hơn nữa, sẽ dễ dàng hom cho việc lựa chọn các chất nội chuẩn khi sử dụng kỹ thuật GC-EI-MS.

3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung nghiên cừu

Đề tài đã thực hiện các phần nghiên cứu sau nhằm đạt được các mục tiêu đã đề ra:

1/ Dựa trên các quy trình tham khảo đã được công bố tiến hành khảo sát và tối ưu hóa quy trình phân tích các hợp chất PBDEs trong mẫu cá sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp phân tích GC-MS.

2/ Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích đối với đối tượng nghiên cứu là các mẫu cá lấy tại sông Tô Lịch, thành phố Hà Nội.

3/ Đánh giá sơ bộ sự tích lũy của các các hợp chất PBDEs trong các mẫu cá tại các địa điểm đã chọn.

3.2 Phương ph áp nghiên cứu

3.2.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

3.2.1.1 Hóa chất

* n-hexan loại tinh khiết phân tích (Trung Quốc), được cất lại trên cột cất cao 0,8 m, lấy phân đoạn sôi ở 60 ° c và được kiểm tra lại trên thiết bị GC-MS để đảm bảo không chứa các hợp chất PBDEs.

* Axeton, ethyl axetat, axeton nitrin, axit sunfuric loại tinh khiết phân tích (Merck).

* Nước cất 2 lần, axeton và n-hexan (Trung Quốc) để rửa dụng cụ

* Muối khan Na2S 04 ,NaCl (Merk) (hoạt hóa ở 600 ° c trong 4 giờ).

19

* Chuẩn đơn lẻ của 11 hợp chất PBDEs (BDE-28, 47, 49, 6 6, 85, 99, 100, 119, 138,

153, 154) nồng độ 2 ng/mL pha trong xyclohexan (Cambridge Isotope Laboratory Inc., Mỹ).

3.2.1.2 Dụng cụ

* Chai đồng hóa 100 mL, các vial thủy tinh màu hổ phách 1,5 mL, 4 mL, 15 mL.

* Cốc thủy tinh và ống đong loại 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL.

* Bình tam giác loại 250 mL, 500 mL, phễu chiết 500 mL, bình cầu 250 mL.

* Pipet paster, micro pipet, phễu thủy tinh

* Dao, thớt, panh.

* Cột 44%H2S 04-Silica/LC-SI 12ml Tube.

* Khí mang He (độ tinh khiết 99,9999%).

Các dụng cụ bằng thủy tinh trước khi sử dụng đều được làm sạch bàng cách: rửa xà phòng, siêu âm 30 phút, rửa bằng nước cất 2 lần, để ráo tự nhiên, sấy khô trong tủ sấy ở 105 °c, tráng lại bàng acetone và n-hexan sạch trước khi sử dụng.

3.2.1.3 Thiết bị

* Máy say sinh tố (Philip, Nhật).

* Thiết bị đồng hóa mẫu chuyên dụng (Kika Labortechnike, Đức).

* Cân phân tích có độ chính xác 10'4g (Precisa, Thụy Điển).

* Máy ly tâm

* Bộ chưng cất phân đoạn có cột cất 0,8 m (Sigma-Aldrich, Mỹ).

* Thiết bị cất quay chân không (Buchi, Nhật Bản).

* Máy siêu âm (Cole Parmer, Mỹ), tủ sấy (Lenton, Anh), tủ hốt (Lapconco, Mỹ).

* Thiết bị đuổi dung môi thổi khí N2 (Eyela, Nhật Bản).

* Thiết bị phân tích sắc ký khí - khối phổ GCMS - QP 2010 với cột mao quản DB-1 (30 m X 0,25 mm X 0,25 |im) (Shimadzu, Nhật Bản).

3.2.2 Phạm vi nghiên cứu

Mầu cá đã được thu thập tại các địa điểm nghi ngờ có sự tồn tại của các hợp chất PĐDEs Địa điểm lấy mẫu là sông Tô Lịch, sông Nhuệ, nơi hàm lượng cao của các hợp chất PCBs

đã được ghi nhận.

• Thời điểm lấy mẫu: các mẫu cá được lấy vào tháng 06 năm 2009 tại đầu sông Tô Lịch

và đầu sông Nhuệ

• Số lượng mẫu: 8 cá thể cá rô phi, cá diếc, cá trôi, cá trê đã được thu thập tại đầu sông

Tô Lịch và sông Nhuệ (bảng 3.1.) Các cá thể cùng loại đã được đồng thể hóa để tạo thành 4 mẫu cá riêng biệt (mẫu cá rô phi, mẫu cá diếc, mẫu cá trôi, mẫu cá trê.

Bảng 3 1 Thông tin vê các mâu cá STT rp A Tên cá / Đia điểm Khối lượng (g) Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm)

Hình 3.1 Mau cá rô phi thu thập tại sông Tô Lịch

3.2.3 Chuẩn bị mẫu

3.2.3.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Các mẫu cá được đánh bắt tại địa điểm lấy mẫu Mầu cá đều còn tươi, được gói trong giấy nhôm và bảo quản lạnh trong suốt quá trinh vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.

21

Sau khi đưa mẫu về phòng thí nghiệm, tién hành đo kích thước (chiều dài, chiều rộng) và

đo khối lượng của từng mẫu Tiến hành tách rời phần thịt và gan và đem cân, lấy phần thịt xay nhuyễn bằng máy say sinh tố Mau sau đó được bảo quản trong tủ lạnh sâu ở -20

°c đến khi đem phân tích.

3.2.3.2 Tách chiết và làm giàu sơ bộ

Quá trình tách chiết và làm giàu sơ bộ được thực hiện dựa theo các tài liệu đã công bố [1, 3, 16]: Cân chính xác 2 g mẫu cá (ướt) đã được xay nhuyễn cho vào cốc đồng hóa 100 mL, thêm 50 ml acetonitrile và 100 ppb các chất đồng hành PCB 209 vào rồi tiến hành đồng hóa trong 5 phút, tiếp tục ly tâm 5 phút Sau đó gạn dịch chiết vào bình cầu 250 ml.Thêm

20 ml acetonitrile vào phần xác cá còn lại, lắc đều, ly tâm 5 phút và gạn tiếp phần dịch chiết vào bình càu 250 ml trên, cô cất quay chân không để làm giàu về khoảng 5 mL.

3.2.3.3 Làm sạch và làm giàu dịch chiết

Dịch chiết từ nền mẫu sinh học thường chứa nhiều tạp chất như Iipid, acid béo, amin, rượu

Do đó làm sạch dịch chiết là vô cùng quan ữọng, kỷ thuật chiết pha rắn đã được sử dụng để loại bỏ các tạp chất này cũng như để làm sạch dịch chiết Trong nghiên cứu này, quy trinh làm sạch mẫu sẽ được tối ưu hóa, bao gồm: lựa chọn dung môi chiết, rửa xít, tối ưu thể tích tách chiết mẫu qua cột SPE.

Hình 3.2 Hệ chiêt pha rắn SPE với cột 44% sulíuric acid im pregnated silicagel

Cân 2 g m ẫu thịt cá vào chai thủy tinh 100 mL

+ 50 ml acetonitrile

■+ 50 nl PCB 209 20 ppm Đông hóa 5 phút Ly tâm 5 phút Gạn Cô cât quay chân không vê 5

+ Chuyên vào phễu chiết 500 mL chứa 250

mL nước và 10 g NaCI Chiêt với 250ml H2 O

+ 50 mL n-hexane:ethyl acetat (3:2) Lắc chiết lần 1 trong 10 phút

Cô cât quay chân không vê 1

+ 10 mL n-hexane, chuyển dung môi

Cỏ cât quay chân không vê 1 ml

Rửa axỉt lân 1

Thêm 100 |il hỗn hợp nội chuẩn 5 ppm

Cô băng N2 vê 200|iL

+ Đinh mức vế 1 mL

Bơm lên GC-MS

H ình 3.3 Q uy trình phân tích P B D E s trong m ẫu cá

- Làm sạch mẫu bằng bước rửa axit: Mẩu sau khi đã được chuyển về dung môi n-hexan, được làm giầu về 2-3ml sẽ được chuyển vào lọ 15ml, cho lml axit H2SO4 98% lắc đều và để yên 5 phút cho 2 phân lớp axit và dung môi được phân lớp rõ ràng Thu lấy phần lớp dung môi cho vào một vial.Phần lóp axit tiếp tục thêm 3ml n-hexane lắc chiết lần 2 Thu lấy phần dung môi vào vial đựng dung môi chiết lần 1.

23

- Làm sạch bàng cột chiết pha rắn 44% H2SO4: Sau khi làm giàu mẫu về 500 pj.l Hoạt hóa cột bằng 20ml hexane Chuyển toàn bộ mẫu vào trong cột và rửa giải bằng 12 ml hexane với tốc

độ 1-2 giọưgiây

Qui trình phân tích PBDEs trong mẫu cá được mô tả tổng quát tại hình 3.3.

3.2.4 Phương pháp phân tích

3.2.4.1 Điều kiện phân tích trên GC-MS

Việc phân tích định tính và định lượng các hợp chất PBDEs được tiến hành trên thiết bị GCMS - QP 2010 của Shimadzu, Nhật Bản Các thông số dưới đây và các thông số trong bảng 3.3 và 3.4 trình bày điều kiện phân tích mẫu trên thiết bị GC-MS Hình 3.4 biểu diễn sắc đồ (SIM) thu được cùa hỗn hợp chuẩn PBDEs đo trên thiết bị GCMS-QP2010.

* Điều kiện làm việc của thiết bị sắc ký:

- Cột tách: cột mao quản DB-1MS

(30 m X 0,32 mm X 0,25 |im ).

- Khí mang He (độ tinh khiết 99,9999%).

- Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 270°c

- Chế độ phân tích lựa chọn mảnh (SIM).

Bàng 3.3 Chucmg trình nhiệt độ của thiết bị sắc ký Tốc độ

(°c/phút)

Nhiệt độ cuối (°C)

Thòi gian giữ (phút)

Tổng thời gian: 48 phút

B àng 3.4 Thời gian lưu và chế độ quan sát ion ch ọn lọc đối với các PB D E

trưng (m/z)

I o d m í

sánh 1

mh so m/z)

Thời gian liru (phút)

Đồng loại PBDE lon mảnh đặc

trung (m/z)

lon mì sánh (

ính so m/z)

Thời gian liru (phút)

* Phân tích định lượng: Sử dụng phương pháp nội chuẩn

Phương pháp nội chuẩn dựa trên việc so sánh cường độ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất có tính chất tương tự đối với thiết bị như chất cần phân tích Chất đó được gọi là chất nội chuẩn Chất nội chuẩn được đưa vào mẫu cần phân tích với nồng độ

25